delețiile cromozomului 20 în malignitățile mieloide: reducerea regiunii comune șterse, generarea unui contig PAC/BAC și identificarea genelor candidate

bandarea și vopsirea cromozomilor

preparatele cromozomiale ale măduvei osoase din 107 cazuri cu tulburări mieloide au fost analizate prin bandarea G pentru a evalua dimensiunea ștergerii brațului lung al cromozomului 20. După cum s-a descris anterior (Nacheva și colab., 1995b), au fost identificate două categorii de ștergere 20Q – ștergeri mari (59 cazuri), rezultând pierderea ambelor benzi întunecate Giemsa din 20q (figura 1a, sus) și ștergeri mici (48 cazuri) în care rămâne o bandă întunecată Giemsa (figura 1a, jos). În continuare ne-am concentrat pe ultimul grup de pacienți (rezumat în tabelul 1).

analiza peștilor folosind o vopsea cromozom 20 a fost efectuată pe cele 48 de probe cu o ștergere mică de 20Q. În șase cazuri, ștergerea 20q s-a dovedit a fi cauzată de rearanjări criptice. Într-un caz, aplicarea simultană a vopselelor pentru cromozomii 15 și 20 a identificat un marker derivat din cromozomul 15, dar doi omologi normali ai cromozomului 20 (figura 1b). În celelalte cinci cazuri, pictura cromozomială a demonstrat prezența unei translocații dezechilibrate cu un punct de întrerupere recurent la 20q11.2 și parteneri cromozomiali variabili (figura 1C). În toate cele cinci cazuri, markerul der (20) a fost singurul produs de translocație reținut în genom. Mai mult, cartografierea peștilor a arătat că punctul de întrerupere al cromozomului 20 a avut loc într-o regiune proximală față de D20S107 și a confirmat pierderea restului brațului lung al cromozomului 20 (datele nu sunt prezentate). Aceste rezultate vor fi raportate în detaliu în altă parte.

în restul de 42 de cazuri, pictura cromozomială a fost în concordanță cu o deleție interstițială mică de 20q (figura 1D). Majoritatea (33 de cazuri) au avut o deleție de 20Q ca singura anomalie cariotipică. În celelalte nouă cazuri, ștergerea 20q a fost însoțită de diverse aberații cromozomiale suplimentare (Tabelul 1). Toate cele 42 de cazuri cu o ștergere mică de 20Q au fost supuse unei cartografieri suplimentare a peștilor cu sonde specifice locusului.

analiza cartografierii Deleției

cei 42 de pacienți cu deleții mici de 20Q au fost analizați de FISH utilizând un PAC centromeric (CEP20), un PAC care hibridizează într-o regiune distală de 20Q (LSI 20q13) și un PAC care hibridizează în cadrul CDR (LSI D20S108). La fiecare pacient, au fost observate semnale atât de la LSI 20q13, cât și de la CEP20, dar nu de la LSI D20S108 pe cromozomul 20 șters, confirmând prezența unei deleții interstițiale (rezumate în Figura 3). Metafazele de la fiecare pacient au fost apoi hibridizate cu maparea PACs la limitele MPD cunoscute și MDS/AML CDRs–D20S107 care se află la limita proximală a CDR-urilor și D20S176 care se află telomerică a limitei distale a CDR-urilor (Bench și colab., 1998a; Wang și colab., 1998).

la 37 de pacienți (25 cu MDS sau AML, 12 cu MPD) ambele sonde nu au reușit să producă un semnal pe cromozomul 20 șters, demonstrând prezența ștergerilor extinse care nu ar ajuta la rafinarea CDR-urilor. Astfel de probe nu au fost investigate în continuare. Cu toate acestea, la patru pacienți cu MDS (DB53, MH40, DB122 și DB214) și unul cu MPD (JH41), una dintre cele două sonde a dat un semnal pe cromozomul 20 șters și aceste probe au fost analizate mai detaliat.

în plus față de cei 42 de pacienți cu deleții mici de 20q care au fost analizați de FISH folosind sonde specifice locusului, alți șase pacienți cu deleție de 20Q (patru cu MDS, doi cu MPD), de la care metafazele măduvei osoase nu erau disponibile, au fost analizați utilizând PCR microsatelit. ADN-ul din granulocitele purificate și celulele T a fost analizat folosind un panou mare de markeri polimorfici care au cuprins CDR-urile MPD și MDS/AML (Tabelul 2). Toți cei patru pacienți cu SMD au avut deleții care se extindeau dincolo de limitele CDR publicate. Cu toate acestea, la unul dintre cei doi pacienți cu MPD (RB42), limita centromerică a deleției a redus considerabil CDR MPD (Figura 2, Tabelul 2).

reducerea regiunii șterse comune la pacienții cu SMD/LMA

analiza preliminară FISH a identificat patru pacienți cu SMD cu deleții care au încălcat CDR MDS/LMA. În fiecare caz, ștergerea 20q a fost prezentă în toate metafazele examinate. În trei cazuri (DB53, DB214 și MH40), ștergerea 20q a fost prezentă ca o anomalie unică. La pacientul db122, deleția 20q a fost singura anomalie inițială, cu două subclone conținând trisomia 21 sau trisomia 8 și trisomia 21, în plus față de deleția 20Q. Aceste patru cazuri au fost studiate folosind sonde suplimentare specifice locusului pentru a stabili limitele de ștergere.

limita proximală a CDR MDS/AML a fost rafinată de pacienții db53, MH40 și DB122. Limita proximală a ștergerii în DB53 se află între D20S107 și WI-11538 (Figura 3), o distanță de aproximativ 400 kb. Pentru pacientul MH40, un PAC care conține WI-11538 (dJ357E14) a dat naștere în mod constant unui semnal redus în concordanță cu prezența punctului de întrerupere a ștergerii proximale în cadrul acestui PAC (Figura 3). Mai mult, limita proximală a deleției la pacientul db122 se situează între sts-R52161 și stSG25449 (figura 1e,f), o distanță mai mică de 200 kb (figurile 3 și 4). Aceasta reprezintă o rafinare mare a limitei proximale a CDR MDS/AML.

pacientul DB214 a permis o rafinare considerabilă a limitei distale a CDR MDS/AML. Limita distală a acestei deleții se afla între WI-12515 și stSG40369 (figura 1g,h), o distanță mai mică de 100 kb (figurile 3 și 4).

prin urmare, aceste date reduc considerabil CDR-ul MDS/AML la o regiune situată între PAC dJ620E11, care conține sts-R52161, și PAC dJ196H17 care conține WI-12515 (figurile 3 și 4). Clona bacteriană contig prezentată mai jos demonstrează că dimensiunea fizică a acestei regiuni este de aproximativ 2,6 Mb.

reducerea regiunii comune șterse la pacienții cu MPD

la pacientul JH41 (diagnostic PV), limita proximală a deleției a fost determinată anterior de PCR microsatelit să se situeze între D20S438 și D20S107 (Bench și colab., 1998a). PAC dJ155H19, care conține D20S107 (Figura 4), a dat naștere în mod constant unui semnal redus în concordanță cu prezența punctului de întrerupere a ștergerii proximale în cadrul acestui PAC (Figura 3).

granulocitele și celulele T de la alți doi pacienți au fost investigate utilizând PCR microsatelit (Tabelul 2). Un pacient cu PV (RB42) a demonstrat retenția heterozigozității la D20S108, dar pierderea la D20S858 (Figura 2, Tabelul 2). Punctul de întrerupere proximal al deleției la acest pacient se situează între D20S108 și D20S858, o distanță mai mică de 200 kb (figurile 3 și 4).

aceste date reduc foarte mult MPD CDR, care este acum flancat de D20S108 (acest studiu) și D20S481 (Wang și colab., 1998). Dimensiunea fizică estimată a acestei regiuni este 2.7 Mb, folosind date din clona bacteriană contig prezentată mai jos. Regiunea de suprapunere dintre noile CDR-uri MDS/AML și MPD a definit un CDR combinat ‘mieloid’ de 1,7 Mb (Figura 3).

o clonă bacteriană contig care acoperă regiunile șterse comune MPD și MDS/AML

am construit anterior un contig YAC de 11 Mb din această regiune a cromozomului 20 (Bench și colab., 1998a). Pentru a produce o hartă fizică mai detaliată, am construit acum o hartă bazată pe PAC și BAC. Clonele PAC și BAC au fost identificate prin hibridizarea STSs la bibliotecile genomice (Ioannou și colab., 1994; Osoegawa și colab., 1998). Clonele au fost suprapuse folosind amprentarea restricției (Gregory și colab., 1997) și cartografierea conținutului STS care permite gruparea clonelor în contiguri. Pentru a lega contig – urile, s-au folosit noi sonde STSs și ADN, dezvoltate de la capetele contig-urilor, pentru screeningul ulterior al Bibliotecii. PAC-urile și BAC-urile noi au fost apoi amalgamate în contiguri în același mod până când a fost produsă o hartă contiguă.

clona bacteriană contig conține un total de 456 clone bacteriene, dintre care 376 sunt PAC și 80 sunt BACs. Se extinde de la D20S607 la SEMG1 și include 202 markeri ADN din care 185 sunt STSs și 17 sunt sonde ADN. Dimensiunea contig s-a bazat pe o medie de 3, 5 kb pe banda de amprente HindIII (P Deloukas (2000), rezultate nepublicate). Dimensiunea estimată a contig a fost calculată ca 5 Mb prin înmulțirea numărului total de benzi de amprentă diferite din contig cu 3,5. O reprezentare a hărții care ilustrează calea minimă de tigla și PAC-urile care au fost utilizate pentru experimentele de pește este prezentată în Figura 4. O versiune completă a hărții poate fi găsită la http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name= Chr_-20ctg125&class=Map.

identificarea secvențelor exprimate

patruzeci și trei de Est-uri unice au fost localizate între d20s607 și stSG34035 inclusiv. Dintre acestea, 34 Est au fost cartografiate prin hibridizare la o ‘poligridă’ de PACs și BACs sau prin PCR de colonii bacteriene care conțin PACs sau BACs (Figura 4). Încă nouă Est, cartografiate anterior în această regiune a cromozomului 20 (Bench și colab., 1998a; Deloukas și colab., 1998) au fost poziționate pe contig prin alinierea explozivă a secvenței EST cu secvența genomică PAC sau BAC disponibilă.

pentru a identifica secvențele exprimate în roman, 23 de clone PAC din calea minimă de placare au fost secvențiate parțial sau complet. Secvența genomică a acestor clone a fost analizată folosind programul NIX (Williams și colab., 1998) care permite observarea simultană a unui număr de instrumente de identificare a genelor, inclusiv Graal, GENSCAN și BLAST. Au fost identificate opt Est și gene care nu au fost cartografiate anterior (Tabelul 3). Șase dintre acestea se aflau în MPD CDR și șapte se aflau în MDS cdr. S-au obținut dovezi că șase din aceste opt secvențe exprimate presupus au reprezentat gene transcrise de bună credință, mai degrabă decât pseudogene procesate sau contaminanți genomici ai ADN-ului în baza de date EST. KCNS1 este o genă care codifică o subunitate de canal cu tensiune de potasiu. ESTs aa053206 / AA053121 s-au dovedit ulterior a fi derivate din gena SGK2 (Kobayashi și colab., 1999). Alinierea secvenței ADNc la secvența genomică a demonstrat o structură exon/intron pentru trei dintre cele șase Est-uri rămase (AI312497, aa568401 și aa910031) cu secvența de consens a site-ului de îmbinare prezentă la toate limitele exonului / intronului. În toate aceste trei cazuri, prezența fiecărui exon a fost confirmată de programe de predicție exon, cum ar fi Graal. Existența unui exon a fost, de asemenea, prezisă de Graal, GENSCAN și Genefinder în regiunea PAC dJ1108D11 care s-a aliniat la EST AA993161 ceea ce înseamnă că acest EST a reprezentat și o genă transcrisă.

analiza secvenței Pac-urilor din interiorul căii minime de placare ne-a permis, de asemenea, să stabilim structura genomică a genelor cunoscute și noi în această regiune. Alinierea ADNc RPTPrho la PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 și dJ269M15 a demonstrat că această genă se întinde pe cel puțin 1,2 Mb. PAC dJ138B7 conținea două gene(H-L (3)mbt și SGK2), precum și porțiunea 5′ a genei corespunzătoare SHGC-36858. În special, gena H-L(3)mbt conține 20 de exoni cu doi exoni finali alternativi presupuși. Analiza dJ644L1 a demonstrat că gena MafB umană constă dintr-un singur exon. Analiza secvenței finite a fost efectuată și de centrul Sanger (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) și acest lucru poate fi vizualizat la http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&class=GenomeSequence.

aceste date stabilesc prezența a șase gene și a altor 14 Est unqiue în cadrul noului CDR MDS/AML și un total de 14 gene cu 23 Est unice în cadrul noului CDR MPD (Tabelul 3). Șase gene și 10 Est-uri unice sunt prezente în regiunea de suprapunere dintre cele două CDR-uri.

profilarea expresiei

se consideră că tulburările mieloproliferative, sindroamele mielodisplazice și leucemia mieloidă acută rezultă din transformarea unei celule multipotente în compartimentul celulelor stem hematopoietice (Bonnet și Dick, 1997; Kralovics și Prchal, 1998). Mai mult, s-a demonstrat anterior că ștergerea 20q poate apărea într-o celulă progenitoare capabilă să dea naștere atât celulelor mieloide, cât și celulelor B (White și colab., 1994). Aceste considerații sugerează că gena sau genele de pe cromozomul 20Q care sunt inactivate în aceste boli sunt susceptibile de a fi exprimate în celulele progenitoare hematopoietice normale. Prin urmare, am determinat care dintre secvențele transcrise au fost exprimate în măduva osoasă și celulele pozitive CD34 purificate.

amplificarea PCR cu transcripție inversă (RT–PCR) a fost realizată cu primeri reprezentând fiecare din cele 51 de secvențe transcrise (Figura 5). Au fost efectuate cel puțin două amplificări RT–PCR independente pentru fiecare secvență transcrisă. Primerii corespunzători unui Est (WI-7685) derivat din 3′ UTR al genei CD34 au fost utilizați ca un control pozitiv (figura 5). În cazul în care două sau mai multe Est corespundeau aceleiași secvențe transcrise, același rezultat a fost obținut pentru fiecare EST.

datele sunt prezentate în Figura 5, Tabelele 3 și 4. Dintre cele 37 de secvențe exprimate în CDR MPD, 20 au fost exprimate în celule mononucleare ale măduvei osoase. Dintre acestea, 16 au fost exprimate și în celule pozitive CD34. În cadrul CDR MDS / AML, 11 din 20 de secvențe transcrise au fost exprimate în celule mononucleare ale măduvei osoase. Dintre acestea, opt au fost exprimate și în celule pozitive CD34. Din cele 16 secvențe transcrise care se află în regiunea de suprapunere dintre MPD și CDR-urile MDS/AML, opt au fost exprimate în celule de măduvă osoasă, dintre care cinci au fost exprimate și în celule CD34 pozitive. Prin urmare, aceste cinci secvențe transcrise reprezintă gene candidate primare, deoarece se află atât în MPD, cât și în Cdr-urile MDS/AML și sunt exprimate în compartimentul celulelor progenitoare hematopoietice. Acestea includ două gene necunoscute care corespund ESTs SHGC-36858 și WI-12515, precum și trei gene, SFRS6, H-L(3)mbt și MYBL2.