Cum se efectuează extracția ADN – ului din pete de sânge uscate folosind rășină Chelex

fiecare bio-om de știință care dorește să analizeze ADN-ul știe că procesul începe cu extragerea ADN-ului din celulele de interes. Aceste celule ar putea fi RBC, paraziți sau bacterii pentru a numi câteva. În plus, există diferite metode de extracție a ADN-ului1 din care să alegeți în funcție de tipul eșantionului, analiza în aval și așa mai departe. Mulți oameni de știință încep cu pete de sânge uscate (DBS) și, prin urmare, modul de extragere a ADN-ului din astfel de probe prezintă un interes deosebit. Un DBS este preparat în mod obișnuit, prin colectarea sângelui pe o hârtie de filtru cromatografică de 3 mm Whatman CARD2 sau Whatman și lăsându-l să se usuce pentru o perioadă de timp (~4 ore) înainte de procesare. Această metodă de bio-eșantionare a fost utilizată de zeci de ani.

o metodă utilă pentru izolarea ADN-ului din astfel de probe utilizând rășina BT Chelex 1003 este descrisă mai jos.

pasul unu: Liza eritrocitelor

• se taie o pată de sânge uscată și se pune într-un tub de microcentrifugă (1,5 ml) folosind un perforator. Nu uitați să etichetați tubul, mai ales atunci când lucrați pe mai multe probe. În scopuri de control al calității, includeți și un punct de sânge de control pozitiv.
• se adaugă 1 ml de saponină 0,5% în tubul de microcentrifugă care conține pata de sânge. Închideți, vârtejați și incubați la 4 0C timp de cel puțin 4 ore, sau mai bine, peste noapte. În această etapă, complexele de saponină cu colesterol în membrana eritrocitelor conduc la formarea porilor în membrană și, prin urmare, la hemoliză.4 saponina este un reactiv de liză utilizat în mod obișnuit în eliberarea paraziților (de exemplu, paraziți ai malariei) din celulele roșii din sânge.
• rotiți câteva secunde la 4.000 rpm, pentru a îndepărta picăturile de pe capacul interior și aspirați saponina din tub folosind un vârf de pipetă fără barieră atașat la o pipetă pasteur pe o mașină de asamblare sub vid. Se poate folosi și o pipetă pasteur din plastic. Lăsați locul în tubul microcentrifug.

Pasul doi: spălarea

• adăugați 1 ml de soluție salină tamponată cu fosfat în microcentrifugă, închideți, vortex și incubați la 4 0C timp de 20-30 de minute. Incubarea peste noapte nu va provoca niciun rău. Această etapă asigură îndepărtarea saponinei din tub.
• rotiți câteva secunde la 4.000 rpm, apoi scoateți PBS, la fel cum ați îndepărtat saponina. Lăsați locul în tubul microcentrifug.

Pasul trei: extracția ADN-ului cu rășină Chelex

principiu: rășina Chelex funcționează prin prevenirea degradării ADN-ului de la enzimele degradative (Dnaze) și de la potențialii contaminanți care ar putea inhiba analizele din aval. În general, rășina Chelex va prinde astfel de contaminanți, lăsând ADN-ul în soluție. Rășina Chelex arestează cationi precum Mg2+, un co-factor important pentru acțiunea Dnazei, protejând astfel ADN-ul de degradare.5,6

• se pipetează și se adaugă 150 unqql de soluție de rășină Chelex 6,7% în tubul de microcentrifugă care conține pata. Închideți tubul. Un memento important: atunci când pregătiți soluția de Chelex de 6,7%, utilizați apă care nu conține Dnaze, nucleaze (sau orice altceva care ar putea dăuna și degrada ADN-ul).
• se incubează la 95 0C timp de 10 minute folosind un bloc de căldură/ agitator. Este important să deschideți tubul de două ori, la fiecare 2 minute, pentru a elibera presiunea și apoi agitați câteva secunde după aceea. Aceasta eliberează ADN-ul în soluție.

Pasul patru: evitați granulele de rășină Chelex din extractul Final

• rotiți timp de 5 minute la 4.000 rpm
• pipetați cât mai mult extract posibil într-un tub de microcentrifugă mai mic (0,6 ml) folosind un vârf de barieră pentru aerosoli, evitând în același timp transferul granulelor Chelex.
• centrifugați microcentrifugul de 0,6 ml la 4000 rpm Timp de 10 minute. Ideea celei de-a doua rotiri este de a elimina orice margele Chelex rămase care ar putea fi transferate în extractul final. De ce este important acest lucru? Două motive principale: 1) Chelex se leagă de ionii de magneziu (co-factor esențial pentru polimeraza Taq utilizată în PCR) și 2) fluoresces Chelex. Dacă fluorescența este modalitatea dvs. de a vizualiza un rezultat, acest lucru poate crea un fals pozitiv.
• se pipetează aproximativ 100 unqql și se transferă extractul final într-un nou microcentrifuge. Etichetați și păstrați la frigider.

câteva sfaturi în timp ce faceți extracții ADN

• lucrați într-un mediu curat, fără contaminanți
• utilizați vârfuri de pipetă care nu conțin nucleaze
• manipulați toate probele cu mănuși
• din nou, evitați mărgelele Chelex din extractul final

concluzie

Chelex Resin7, oferă o metodă simplă și rapidă de extracție a ADN-ului din DBS, pentru utilizare în diverse aplicații analitice moleculare. Această metodă nu necesită echipamente costisitoare și este fiabilă atunci când este testată împotriva altor metode.

1. GE Healthcare (2010). Extragerea fiabilă a ADN-ului din cardurile Whatman FTA. Notă de aplicare 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, MAREA BRITANIE: GE Healthcare.
2. Whatman (n.d.). Pregătirea unui disc als pentru analiza ADN-ului. Protocolul Whatman als BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) Chelex 100 și Chelex 20 Chelating rășină schimbătoare de ioni Manual de instrucțiuni. LIT200RevB. Hercules, ca: laboratoare Bio-Rad.
4. Baumann, E., Stoya, G., V Unkticlkner, A., Richter, W., Lemke, C. și Linss, W. (2000). Hemoliza eritrocitelor umane cu saponină afectează structura membranei. Acta Histochemica, 102(1), 21-35.
5. IBRC (2016). Protocolul De Extracție: Chelex. Site-ul IBRC. Adus de lahttp://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C. S., Boissaye, R., Stewart, J. și Staton, P. (n.d.). Dezvoltarea și validarea internă a unui protocol de extracție a ADN-ului Chelex pentru tampoane orale de referință.
7. Walsh, P. S., Metzger, D. A. și Higuchi,R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 ca mediu pentru extragerea simplă a ADN-ului pentru tastarea pe bază de PCR din Materialul medico-legal. Biotehnologii, 54(3), 134-139.