cromodomainul Chp1 leagă coada H3K9me și miezul nucleozomului pentru a asambla heterocromatina

plasmide și tulpini construcție

mutanții Chp1CD pentru exprimare și purificare au fost generați prin PCR invers folosind primerii enumerați în tabelul suplimentar S2 pornind de la pET28a chp1 cromodomain plasmidă . Testele de salvare a heterochromatinei au fost efectuate prin introducerea plasmidelor care conțin chp1 wt și proteina mutantă chp1 sub promotorul său endogen într-o tulpină chp1 inkt (SP170, vezi Tabelul suplimentar S3) . gena chp1 cu lungime completă și promotorul său endogen (-949 bp de la începutul secvenței de codificare chp1+) au fost clonate în plasmida pREP1. mutanții cromodomainici chp1 au fost generați prin PCR invers folosind primerii enumerați în tabelul suplimentar S2 și transformați în tulpina indicată chp1.

pentru integrarea genomică, plasmida pREP1 a fost modificată pentru a înlocui promotorul nmt1+ cu următoarea casetă de integrare: (SphI) Regiune la 5′ a genei Chp1 (cromozomul I, 2215500-2215055) (AscI)—casetă de rezistență HphMX6 -(SphI) promotor endogen Chp1 (cromozomul I, 2214829-2214664)—secvență de codare Chp1—(bamhi) terminator chp1 (cromozomul i, 2210976-2210582) (bamhi). Caseta de integrare (atât chp1+, cât și chp1loop1b/2B) a fost apoi amplificată PCR și transformată prin electroporare, în tulpini SP101, SP170 și SP64. Celulele au fost apoi selectate pe plăci Yes + Higromicină (50 mg ml−1 Higromicină). Coloniile unice au fost izolate, ecranate PCR și secvențiate pentru inserarea genomică a casetei de rezistență HphMX6 și a mutațiilor LOOP1B/2b.

tulpinile care conțin plasmide au fost cultivate pe medii Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu. Toate tulpinile și plasmidele utilizate în acest studiu sunt enumerate în tabelele suplimentare S3 și S4.

purificarea proteinelor

His6-SUMO-Chp1CD și toți mutanții CD au fost exprimați în E. coli BL21 (de3) (pLys) și purificat prin cromatografie de afinitate prin utilizarea rășinii Ni-NTA (GE Healthcare, Freiburg, Germania). His6-SUMO-Chp1CD conține Locul de clivaj al trombinei între două etichete .

în total, s-a adăugat 0,2 mm IPTG pentru a induce expresia proteică urmată de creștere la 18 C O/N. celulele au fost recoltate prin centrifugare și re-suspendate în tampon de liză (20 mm acid 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetansulfonic (HEPES) pH 7,5, 150 mM Naci, 1 mM ditiotreitol (DTT), 20 mM imidazol). După înghețarea flash, celulele au fost dezghețate și incubate timp de 30 min în lizozimă înainte de Sonicare (Branson Sonifier 250-ieșire 4, ciclul de funcționare 40). Suspensia a fost centrifugată (12000 g, 20 min la 4 centimetric C) și supernatantul adăugat la rășina Ni-NTA preechilibrată în tampon de legare (20 mm HEPES pH 7,5, 500 mM NaCI, 1 mM TDT, 20 mM imidazol) și incubat timp de 30 min la 4 centimetric C sub rotație. Rășina a fost apoi spălată cu 5 centimetrii cu tampon de legare și proteinele au fost eluate în tampon de eluție (20 mm HEPES pH 7,5, 150 mm NaCl, 1 mM DTT, 300 mm imidazol). Chp1CD wt și mutanții au fost apoi dyalizați O / N într-un tampon care conține 20 mm HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD a fost apoi purificat în continuare prin filtrare cu gel (Superdex 75 PG; GE Healthcare) și dializat într-un tampon care conține 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT.

Silencing assays

celulele pentru silencing assays au fost crescute la o do 0,7–1 și apoi normalizate la o concentrație finală de 1 107 celule ml−1 de cultură. S-au făcut diluții seriale de zece ori, astfel încât spotul cu cea mai mare densitate să conțină 1 105 celule. Celulele au fost observate pe plăci neselective (da) și acid 5-fluoro-orotic (5-FOA 1 g l−1 5-FOA). Plăcile au fost incubate la 32 centimetric C timp de 2-3 zile și imaginate. Celulele au o genă reporter ura4 inserată în repetiții IMR pericentromerice (Locus heterocromatic). Când gena reporter ura4 este redusă la tăcere, celulele pot crește pe mediu care conține 5-FOA. Când heterocromatina este pierdută, gena reporter ura4 este exprimată și celulele nu sunt în măsură să crească pe mediul 5-FOA.

detectarea nivelurilor de ARN de către qPCR (RT-qPCR)

culturile de drojdie (10 ml) au fost cultivate la un OD600 de 0,7–1,5. Celulele au fost apoi re-suspendate în tampon de liză de 500 xqql (300 mm NaOAc pH 5,2, 1% dodecil sulfat de sodiu) și 500 xqql fenol–cloroform și incubate la 65 xqqc timp de 10 min cu amestecare constantă. Fracțiunea apoasă a fost separată de fenol-cloroform prin centrifugare (10 min, 20 000 g) și etanolul precipitat. Acizii nucleici au fost tratați cu Dnaza I (Roche, Basel, Elveția) timp de 30 de minute la 37 de grade C, urmată de 15 minute la 75 de grade C de inactivare termică. ADN-ul complementar a fost sintetizat folosind 100 ng de ARN și 1 pmol de oligos ADN cu Superscript III (Invitrogen, Darmstadt, Germania) folosind condiții standard. Nivelurile de ARN au fost cuantificate cu qPCR prin utilizarea kitului Biozym DyNAmo flash qRT-PCR și normalizat la gena euchromatică tdh1.

testele de deplasare a mobilității electroforetice ARN

testul de deplasare a ARN au fost efectuate în urma condițiilor raportate anterior . În total, 0.66 pmoli de ARN centromeric 32P radiomarcat de 30 nt au fost incubați cu cromodomaină de 10 centimm Chp1 (de tip sălbatic și mutant) într-un tampon conținând 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCl, 0,5 mM DTT și 3% glicerol. Pentru ARN EMSA cu transcrieri centromerice de 100 nt dg, au fost incubate 2 pmoli de ARN radiomarcat 32P cu 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmoli ai proteinei Chp1CD (mutant WT și LOOP1B/2B) în volum final de 15 unqql. Peptida H3K9me3 (Eurogentec, K Unkticln, Germania) a fost adăugată la o peptidă 1:1 Chp1CD – H3K9me, după cum sa raportat în . Incubația s-a efectuat timp de 1 oră pe gheață, iar probele (volum final de 20 unqql) au fost apoi încărcate pe un gel nativ de 10% acrilamidă-TBE (raport bis-acrilamidă 1:29). Pentru extragerile de ARN in vitro, s-a legat 1 ectg de SUMO-Chp1CD (mutant de tip sălbatic și LOOP1B/2b) la 15 inqql rășină Ni-NTA (GE Healthcare) și s-a adăugat H3k9me3nucleozom pentru a asambla complexul Chp1cd-H3k9me3nucleozom în tampon de legare (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mm imidazol). După spălarea de trei ori cu 50 de centicli de tampon de legare, s-au adăugat 2 pmoli de ARN DG marcat cu 32P 100nt și incubat cu rășina Nucleozomală Chp1CD pe gheață timp de 1 h. rășina a fost centrifugată la viteză mică (60 g, 10 s) și fluxul colectat. Rășina a fost spălată de trei ori cu un tampon de legare de cel puțin 3% (V/v) și complexul Chp1cd-nucleozom-ARN a fost eluat prin adăugarea unui tampon de imidazol de 300 mM (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mm KCL, 0,5 mM DTT, 300 mm imidazol), incubat timp de 1 oră pe gheață cu interval de amestecare de 5 minute (fracție legată). Probele au fost încărcate pe un gel de acrilamidă nativ de 10% TBE (raport bis-acrilamidă 1:29) și au funcționat timp de 2 ore la 10 mA la 4 centimetric C. După expunerea peste noapte, gelurile au fost scanate folosind fosfoimagerul TyphoonFLA9000.

imunoprecipitarea cromatinei

culturile de drojdie (100 ml) au fost cultivate la un OD600 de 0,7 și reticulate cu 3% formaldehidă la temperatura camerei timp de 15 minute, conform descrierii . Reacția a fost stinsă cu glicină de 125 mM timp de 10 minute la temperatura camerei. Celulele au fost Re-suspendate în tampon de liză de 500 ilqql (50 mm HEPES pH 7,5, 1.5 m acetat de sodiu, 5 mM MgCl2, 2 mm acid etilendiaminetetraacetic, 2 mM acid etilenglicol tetraacetic, 0,1% NP-40, 20% glicerol) conținând inhibitori de protează (comprimate de cocktail inhibitor de protează, Roche, Complete, fără acid etilendiaminetetraacetic). Celulele congelate au fost lizate folosind MP Biospec bead beater. După liză, extractul a fost sonicat 35 pentru 30 s (bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgia) și Filat la 13 000 g timp de 15 min pentru a obține supernatantul cromatinei. Pentru ADN-ul de intrare, s-au utilizat 50 unqql de supernatant. Pentru imunoprecipitații, supernatanții au fost normalizați pe baza concentrației proteice și incubați cu anticorp H3K9 anti-dimetilat sau anticorp anti-Chp1 (H3K9me2, Abcam nr. Ab1220 și Chp1, Abcam nr. Ab18191), imobilizat pe Dynabeads magnetice, timp de 2 ore la 4 centimetrii C. perlele și proteina imobilizată au fost spălate 5 centimetrii cu 1 ml tampon de liză. Proteinele au fost eluate prin incubare cu 150 ilqtl de tampon de eluție (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mm acid etilendiaminotetraacetic, 1% dodecil sulfat de sodiu) la 65 ilct C timp de 15 min. Legaturile incrucisate au fost inversate prin incubare la 65 centimetric C peste noapte urmate de degradarea ARN cu Rnaza a si degradarea proteinelor cu Proteinaza K. ADN–ul a fost apoi recuperat prin extractie fenol-cloroform si Precipitare etanol si cuantificat folosind qPCR. Gena euchromatică tdh1 a fost utilizată pentru normalizare. Oligonucleotidele utilizate în testele de imunoprecipitare a cromatinei sunt enumerate în tabelul suplimentar s2.

reconstituirea in vitro a Nucleozomilor și metilarea (H3K9me3)

Nucleozomii au fost reconstituiți utilizând histone Xenopus laevis și secvența 601, așa cum s-a descris anterior . Metilarea in vitro a fost făcută așa cum este descris . Vârful la + 42 Da a fost observat în publicația originală și nu este o contaminare (Matt Simon, comunicare personală și descrisă în ).

In vitro Chp1CD–H3K9me3 formarea și eluția complexului Nucleozomic MLA

în total, 5% din Chp1CD au fost legați la 15% din rășina Ni-NTA în tampon de legare (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mM DTT, 20 mm imidazol) timp de 20 min la 4%. Rășina a fost spălată o dată cu cinci volume de tampon de legare și s-au adăugat 10 nucleozomi analogici H3K9me3 de metil lizină (MLA) (nucleozomii MLA au fost dializați anterior în tampon de legare) într-un volum final de 20 centicli și incubați 1 h pe gheață cu re-suspensie constantă la fiecare 5 minute. După incubare, rășina a fost centrifugată (60 g timp de 10 s) și fluxul colectat. Rășina a fost apoi spălată de trei ori cu cinci volume de tampon de legare. Complexul SUMO-Chp1CD-H3k9me3nucleozom a fost eluat prin adăugarea de trombină (Sigma, Munchen, Germania) timp de 2 ore pe gheață în 20 unqql de tampon de legare. Formarea complexă a fost apoi evaluată prin electroforeza în gel SDS-poliacrilamidă pe geluri de acrilamidă 15% și prin colorare negativă EM.

Chp1CD h3k9me3 teste de legare a peptidelor

în total, 1 hectolitru de histonă H3 (1-21)-GGK(biotină) peptidă (Eurogentec) a fost incubat cu 15 unkticl de rășină de agaroză streptavidină (Invitrogen) în 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT. S-au adăugat apoi aproximativ 5 hectolitri de Chp1CD (atât wt, cât și mutanți) într-un volum final de 20 de centili și s-au incubat timp de 1 oră pe gheață în aceleași condiții tampon. Rășina a fost spălată de trei ori și apoi eficiența de legare a fost evaluată la electroforeza în gel SDS-poliacrilamidă pe geluri de acrilamidă 15%. Cuantificarea legării s-a făcut prin utilizarea software-ului ImageJ. Legarea fiecărui mutant a fost normalizată la wt Chp1CD pentru fiecare test.

termoforeza la Microscală (MST)

pentru eticheta SUMO MST a fost eliminată din construcțiile Chp1CD cu protează Ulp1. În total, 100 de centigg de tip sălbatic și mutant Chp1CD au fost etichetate fluorescent folosind kitul de etichetare a proteinelor monolitice MO-L003 BLUE-NHS (Amine Reactive) conform instrucțiunilor producătorului (Nanotemper Technologies, Munchen, Germania). Un raport fluorescență 1: 1: proteină a fost estimat prin utilizarea software−ului Nanodrop1000 ‘proteine și etichete’ caracteristică și fiecare Cromodomain Chp1 a fost rulat pe un gel de acrilamidă SDS de 15% pentru a normaliza concentrațiile la 0,1 mg ml-1.

reacțiile au fost asamblate în 20 ilqql cu 300 ng de chp1cd fluorescent și cantități crescătoare de-Histonă H3 (1-21)-GGK(biotină) peptidă (Eurogentec) sau H3k9me3nucleozomi, într-un tampon conținând 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT și 0,05% Tween-20. Pentru testele de legare a Nucleozomilor H3k9me3 glicerolul a fost adăugat la concentrația finală de 10%. Pentru testele H3K9me3, aceste diluții au fost utilizate pentru măsurători: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 milimetri, 800 milimetri, 1,2 milimetri, 1,8 milimetri. Pentru testul H3K9me3Nucleosome s-au utilizat următoarele diluții pentru măsurători: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 milimetri, 1,2 milimetri, 1,4 milimetri, 1,6 milimetri, 2,4 milimetri.

alergările MST au fost efectuate folosind capilare tratate standard (Nanotemper Cat#K002) pe NT.115 instrument monolit. Toate măsurătorile au fost efectuate folosind 80% LED și 40% putere MST, cu Laser 30 S la timp și 5 s Laser off timp. Pentru fiecare experiment, au fost efectuate cinci măsurători unice.

datele au fost analizate cu software-ul GraphPad Prism versiunea 6.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA) și SigmaPlot Software versiunea 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, SUA). Pentru testele de legare a peptidelor, cu curbele care prezintă o tendință sigmoidă distinctă, am montat ecuația sigmoidală asimetrică logistică Richards five Parameter și am calculat automat Kd. Pentru testele de legare a Nucleozomilor H3k9me3, deoarece tendința de date brute nu mai era sigmoidă pentru toate proteinele analizate, a fost utilizată o ecuație polinomială (cubică) de ordinul trei pentru montarea și compararea punctelor de date brute ale chp1cd de tip sălbatic și a diferiților mutanți. Kd a fost calculat pe baza caracteristicii ‘interpolare’ a software-ului GraphPad prism, folosind valoarea legată/nelegată de 50% pe axa y.

Nucleozomul tripsinei digestia

nucleozomii fără coadă au fost preparați prin incubarea nucleozomilor reconstituiți cu o rășină tpck-tripsină imobilizată (Termoscientific) timp de 2 ore la temperatura camerei într-un tampon conținând 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT . Digestia triptică generează benzi histonice foarte definite și a fost caracterizată în detaliu unde se taie exact tripsina .

testele de legare a Nucleozomilor cu mutanți Chp1CD

testele de legare a nucleozomilor de tip sălbatic și Mutant Chp1CD au fost efectuate conform descrierii anterioare pentru formarea complexului Nucleozomic Chp1cd-H3KC9me3 MLA în 20 mm HEPES pH 7,5, 100 mm KCl, 0,5 mM DTT, 40 mM imidazol. Rășinile și intrările au fost rulate pe geluri de electroforeză SDS-poliacrilamidă în gel 15% acrilamidă. Toate probele au fost apoi analizate prin imunoblot cu histonă anti-H3 (AbCam, Cambridge, Marea Britanie, 1: 1000) sau anticorp anti-H3K9me3 (AbCam, 1: 1000), IgG-HRP anti-capră (BioRad, 1:3000) IgG-HRP anti-iepure (BioRad, Munchen, Germania, 1:3000).

microscopie electronică cu pată negativă

după eluția trombinei, au fost observate 3 unqql din complexul nucleozomilor chp1cd–H3KC9me3 pe o rețea de cupru descărcată cu strălucire (Cu 400 mesh Q11916, Quantifoil, Gro Okticl Xibbichau, Germania) acoperită cu o peliculă de carbon de 1 nm timp de 45 s. după o spălare rapidă cu apă, grila a fost incubată timp de 15 acetat de uranil. Imaginile cu pete Negative au fost colectate pe un microscop electronic de transmisie FEI Morgagni.

crio-EM pe complexul nucleozomilor Chp1CD–H3KC9me3

grilele crio-EM (grile acoperite cu carbon, cu 300 ochiuri R3/3+1 nm strat de carbon, Quantifoil) au fost preparate folosind un Vitrobot Mark IV (compania FEI). Datele crio-EM au fost colectate cu ajutorul unui microscop electronic de transmisie Titan-Krios (Fei Company, Hillsboro, OR, SUA) la 200 KEV și o mărire de 113 000 inkt la planul CCD folosind o cameră CMOS F816 (TVIPS GmbH, Gauting, Germania), rezultând o dimensiune a pixelilor de imagine de 1,2 inkt pe pixel pe scara obiectului (dimensiunea pixelilor CCD a fost de 13,6 inkt). Pentru colectarea automată a datelor a fost utilizat software-ul EM-TOOLS și datele au fost colectate într-un interval de defocalizare de la 10 000 la 40 000 la sută.

în total, 2 480 micrografii pentru complexul Chp1CD–H3KC9me3 și, respectiv, 991 micrografii pentru controlul nucleozomilor H3KC9me3 au fost selectate pentru analiza cu o singură particulă utilizând pachetul software Xmipp (figura suplimentară S9A) . Câteva mii de particule au fost culese manual și curățate cu grijă de zgomot. Aceste particule au fost apoi utilizate pentru colectarea semi-automată și automată a particulelor în XMIPP. Funcția de transfer de Contrast a fost determinată de CTFFIND3 . Particulele unice selectate au fost convertite în formate de păianjen și RELION pentru analize suplimentare (figura suplimentară S9B). Mediile de clasă bidimensionale au fost generate cu pachetul software RELION (figura suplimentară S9C) . Mediile de clasă proaste au fost eliminate din analiza ulterioară a datelor. Rafinările tridimensionale au fost realizate ulterior cu pachetele software SPIDER și RELION .

clasificarea nesupravegheată a particulelor a fost realizată prin însămânțare aleatorie cu hărțile complete de densitate fără clasificare focalizată în pachetul software SPIDER. Încercările de a utiliza clasificarea concentrată au dus la o prejudecată puternică și la suprasolicitarea zgomotului în regiunile de interes. Prin urmare, nu am folosit clasificarea focalizată pentru a reduce părtinirea. În clasificarea inițială făcută în SPIDER, clasele C0–C6 și N0-N5 au fost retroproiectate folosind unghiuri din hărțile C0 și N0 și aceste clase nu au fost complet rafinate. Aici am vrut doar să selectăm clase care aveau o densitate suplimentară legată de nucleozom. Particulele generatoare de hărți cu densități diferite Chp1CD au fost separate și clasificate în continuare. Au fost efectuate aproximativ 20 de runde de clasificări aleatorii de însămânțare până când am împărțit particulele în cinci grupuri diferite (figura suplimentară S3). Clasele C11–C15 au fost rafinate cu pachetul software RELION. Rafinările finale ale complexelor Nucleozomice Chp1CD-H3k9me3 (clasa C15) și controlul Nucleozomilor s-au făcut cu pachetul software RELION. Pentru rafinarea finală, referința a fost filtrată la ~50 Olt (filtru RELION). Referința pe care am folosit-o nu a avut nici una dintre caracteristicile observate în reconstrucțiile rafinate (ADN-ul dublu helix nu este rezolvat, canelura majoră nu este vizibilă, helicele de la XV nu sunt rezolvate). Acest lucru nu indică nicio părtinire de referință în structura noastră. Rezoluția controlului Nucleozomilor a ajuns la 7,3% folosind auto-rafinarea în RELION și simetria C2 (FSC 0,143 cutoff a două hărți rafinate independent). Chp1CD-h3k9me3complexul Nucleozomic a fost rafinat până la 10 Irak (FSC 0,143 cutoff a două hărți rafinate independent) fără aplicarea simetriei.

rezoluția locală a fost calculată folosind software-ul ResMap (volum unic final, minRes=7, maxRes=14, automask). Rezoluția medie determinată de Resmap este de 9,4% pentru complexul Nucleozomic Chp1CD-H3k9me3, confirmând independent rezoluția medie determinată anterior de 10% (FSC 0,143) (figura 1C). Pentru chp1cd-H3k9me3 rezoluția locală a complexului Nucleozomic pentru nucleozom este de 9-10%, iar pentru ligand ~10% (figura 2a). Distribuția unghiului Euler pentru reconstrucțiile finale este prezentată atât pentru nucleozom, cât și pentru complexul Nucleozomic Chp1CD-H3k9me3 (figura suplimentară S9D). Toate orientările sunt prezente cu o preferință pentru vederi de sus și laterale.

modelele moleculare au fost construite folosind pachetul software Chimera folosind montarea rigidă a corpului structurilor cristaline . Încadrarea în densitate s-a făcut cu opțiunile Chimera ‘încadrare în hartă’ și ‘încadrare în segmente’ cu doar ajustări manuale minore. Segmentarea și vizualizarea tuturor hărților crio-EM au fost realizate și cu software-ul Chimera .