microscopia în mod implicit este o tehnică care ne permite să observăm, mai degrabă decât să măsurăm, evenimente biologice și să facem concluzii pe baza a ceea ce vedem, mai degrabă decât pe baza unor calcule. Prin urmare, subiectul acestui articol poate părea puțin surprinzător, deoarece se ocupă de măsurătorile colocalizării. Deși există situații în care puteți determina colocalizarea proteinelor vizual, o confirmare mai precisă a unei distribuții reciproce a două sonde va fi adesea necesară.
de ce este insuficientă o determinare vizuală a Colocalizării?
numai dacă ați colectat imagini în urma unui protocol controlat pentru analiza colocalizării (semnal suficient în fiecare canal, fără autofluorescență sau sângerare a semnalului) este sigur să spunem că cele două sonde se colocalizează exclusiv pe baza observației. În acest caz, dacă semnalul verde se colocalizează cu semnalul roșu și imaginea este în mare parte galbenă, nu este necesară nicio măsurare statistică. Dar dacă nu vedeți o suprapunere, nu înseamnă că nu este acolo! Se poate ca intensitățile celor două canale să nu fie aceleași. Anume, culoarea intermediară pe care o vedem poate apărea numai dacă ambele sonde au aceeași intensitate. Prin urmare, concluziile bazate pe determinarea vizuală pot duce adesea la rezultate fals negative.
ce metode de măsurare a suprapunerii există?
deși nu există o abordare standard a acestei chestiuni, există două metode care sunt utilizate pe scară largă și acceptate în general. Acestea implică fie coeficientul de corelație al lui Pearson (PCC), fie coeficientul de colocalizare al lui Mander (MCC).
aceste două metode se referă la două aspecte diferite ale colocalizării – corelație și co-apariție. Coeficientul lui Pearson este legat de corelația intensităților pixelilor din cele două canale. Măsoară relația dintre semnale-dacă valorile semnalului dintr-un canal cresc simultan cu celălalt sau un semnal cade când celălalt crește. Corelația este distinctă de co-apariție, care este exprimată matematic prin coeficientul lui Mander. Aceasta reprezintă acoperirea unui semnal peste celălalt, ceea ce relevă măsura în care două sonde ocupă același loc. Să explorăm acest lucru un pic mai departe.
coeficientul de corelație al lui Pearson (PCC)
definiție: PCC reflectă relația liniară dintre intensitățile semnalului. Valorile pot varia între 1 (corelație pozitivă perfectă) și -1 (corelație negativă perfectă), în timp ce 0 înseamnă că nu există corelație. Este posibil să explorați PCC vizual printr-o scattergram în care coordonatele de pe complot reprezintă valori ale pixelilor (semnal) în ambele canale. Cu cât mai multe puncte se grupează în jurul unei linii drepte, cu atât este mai bună corelația dintre cele două semnale
cerințe: PCC ar trebui măsurat în regiunea de interes (ROI) pentru a evita falsele pozitive sau negative. Dacă măsurați PCC pe întreaga imagine, pixelii fundalului se vor corela perfect și vor umfla PCC. În schimb, dacă măsurarea este efectuată într-o regiune fără interes în care există o distribuție eterogenă a ambelor canale, PCC va fi deprimat.
puteți selecta ROI manual sau prin prag pentru a exclude fundalul. Indiferent de modul în care o faceți, aveți grijă, mai ales când treceți. Selecția ROI trebuie să includă toate regiunile relevante ale celulei(celulelor), adică fiecare loc în care se poate aștepta ca o sondă să se distribuie. Dacă utilizați o metodă bazată pe intensitate pentru selectarea ROI (thresholding), este posibil să excludeți din greșeală rezultatele relevante. Cum se poate întâmpla asta? Ați putea avea o regiune de excludere reciprocă, în care nu apare nicio etichetă, iar acest lucru poate fi un rezultat relevant din punct de vedere biologic (ambele molecule nu sunt exprimate în acel loc din celulă). Cu toate acestea, pragarea nu va include această regiune în ROI, punându-vă în pericol de a pierde rezultate relevante.
recomandat pentru: PCC trebuie utilizat pe imagini dacă există o relație liniară între intensități. Dacă datele se potrivesc unui model mai complex, PCC nu va funcționa bine. De asemenea, ar trebui aleasă o metodă diferită dacă există o suprapunere inegală, în care sondele co-distribuie, dar în proporții diferite. Acest lucru poate apărea atunci când GFP este utilizat ca o singură sondă. Nivelul său de Expresie poate diferi între celule și poate provoca depresia PCC datorită variabilității intercelulare ridicate.
coeficienții de Colocalizare a lui Mander
definiție: MCC este o metrică care descrie co-apariția – fracția unei proteine care colocalizează cu cealaltă. MCC vă va oferi o măsură bună de colocalizare atunci când etichetați o proteină într-o veziculă și doriți să vedeți cum se colocalizează cu o anumită structură într-o celulă, să zicem un microtubul. Dacă presupunem că toate veziculele se colocalizează cu microtubuli, dar numai o proporție de microtubuli se colocalizează cu vezicula, puteți calcula MCC pentru fiecare canal și puteți obține o metrică care descrie cantitativ această suprapunere fracționată.
cerințe: captura cu MCC este că necesită eliminarea fundalului. Cea mai dificilă parte aici este stabilirea unui punct de întrerupere pentru intensitate care va permite scăderea fundalului. MCC măsoară fluorescența completă a unei sonde în fiecare pixel peste zero. Cu toate acestea, peste zero pixeli sunt extrem de rare, datorită unor factori precum: autofluorescență, scurgeri de lumină, etichetare nespecifică sau fluorescență din câmpiile imaginii în afara focalizării. Prin urmare, măsurarea MCC necesită o selecție atentă a pragului (cutoff).
prima modalitate de a face acest lucru este pragul global, unde scădeți o valoare de prag din fiecare pixel, astfel încât fiecare nivel sub limita selectată să fie fundal și fiecare pixel de mai sus să cadă într-o regiune de interes. Deși acest lucru este foarte intuitiv, pragurile globale sunt destul de brute și pot duce la situații nedorite, cum ar fi excluderea pixelilor cu valoare scăzută, care sunt aproape de fundal, dar sunt de fapt pozitivi.
o opțiune mai automată și mai puțin subiectivă este metoda Costes în care pragul este estimat prin calcularea PCC de mai multe ori. Acest lucru servește la definirea intervalului de valori ale pixelilor care sunt pozitive și, prin urmare, nu ar trebui excluse. PCC este calculat pentru diferite grupuri de pixeli, iar valorile pixelilor pentru care PCC este egal sau aproape de zero sunt luate ca valori de prag. Cu toate acestea, ar trebui verificat și vizual, deoarece în imaginile cu un raport semnal-zgomot mai mic poate identifica un nivel de prag foarte scăzut, astfel încât să nu distingă structurile etichetate de fundal.
recomandat pentru: când problema biologică a experimentului dvs. se referă la măsura în care proteinele/structurile se suprapun, MCC ar trebui să fie măsura de alegere. Acești coeficienți sunt interpretați mai intuitiv decât PCC și sunt independenți de proporționalitatea semnalului (diferențele în numărul de structuri etichetate de fiecare sondă).
înainte de a începe analiza
indiferent de alegerea pentru măsurarea colocalizării pentru care optați, este foarte important ca colectarea imaginilor să fie efectuată într-un mod corect. Încercați să controlați cât mai mulți factori și să pregătiți un set de eșantioane de control care vă permit să monitorizați cât mai multe variabile posibil.
rețineți că determinarea colocalizării vizuale este influențată de mulți factori, inclusiv subiectivitatea observatorului, faptul că creierul fiecărui individ poate vedea culorile diferit, o posibilă orbire a culorii observatorului și rezoluția spațială care determină dimensiunea pixelilor, printre altele. Asigurați-vă că procesați imaginile pe care urmează să le analizați într-o manieră uniformă și rețineți că orice manipulare necontrolată vă poate determina să pierdeți informații relevante.
și nu în ultimul rând
aceste calcule sunt implementate în majoritatea pachetelor software de analiză a imaginilor, de exemplu ImageJ și Volocity. Dar, având în vedere că măsurarea colocalizării este încă un câmp oarecum confuz, sunt necesare îmbunătățiri, așa că urmăriți noile versiuni și pachete pentru software.
cum măsurați colocalizarea? Spuneți-ne scriind în secțiunea de comentarii!
Literatură:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. Un ghid practic pentru evaluarea colocalizării în microscopia biologică. Jurnalul American de Fiziologie-fiziologia celulelor (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: analiza Colocalizării în microscopia fluorescentă. În: Taatjes, Douglas J., Roth, J Untracrgen (ed.), Tehnici de imagistică celulară: metode și protocoale, New York: Humana Press, 2012, pp.97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Teste statistice pentru măsuri de colocalizare în microscopie biologică. Jurnalul de microscopie. 2013; 252(3): 295-302
te-a ajutat asta? Apoi, vă rugăm să partajați cu rețeaua.