Clemizolul și modulatorii semnalizării serotoninei suprimă convulsiile în sindromul Dravet

rezumat

sindromul Dravet este o epilepsie catastrofală în copilărie, cu crize convulsive precoce, limbaj întârziat și dezvoltare motorie, tulburări de somn, comportament asemănător anxietății, deficit cognitiv sever și risc crescut de deces. Este cauzată în primul rând de mutații de novo ale genei SCN1A care codifică un canal de sodiu activat de tensiune neuronală. Peștele zebră cu mutație în omologul SCN1A recapitulează activitatea convulsivă spontană și imită mișcările comportamentale convulsive observate în sindromul Dravet. Aici, arătăm că screeningul fenotipic al bibliotecilor de medicamente în mutanții scn1 de pește zebră identifică rapid și cu succes noi terapii. Demonstrăm că clemizolul se leagă de receptorii serotoninei și activitatea sa antiepileptică poate fi imitată de medicamente care acționează asupra căilor de semnalizare a serotoninei, de exemplu trazodonă și lorcaserină. Coincident cu aceste constatări ale peștilor Zebra, am tratat cinci pacienți cu sindrom Dravet greu de rezolvat din punct de vedere medical cu un agonist al receptorului serotoninei aprobat clinic (lorcaserin, Belviq Xvid) și am observat unele rezultate promițătoare în ceea ce privește reducerea frecvenței și/sau severității convulsiilor. Descoperirile noastre demonstrează o cale rapidă de la descoperirea preclinică la peștele zebră, prin identificarea țintei, până la potențiale tratamente clinice pentru sindromul Dravet.

Introducere

epilepsiile copilăriei clasificate ca fiind catastrofale sunt adesea asociate cu o mutație genetică. Dintre acestea, sindromul Dravet a fost legat de mai mult de 600 de mutații de novo într-o singură genă, SCN1A (Catterall și colab., 2010; Escayg și colab., 2010). Copiii care suferă de sindromul Dravet prezintă convulsii începând cu vârsta de 6 luni, limbaj întârziat și dezvoltare motorie, tulburări de somn, comportament asemănător anxietății și deficit cognitiv sever (Dravet, 2011). Simptomele tulburării spectrului autist au fost, de asemenea, raportate (Li și colab., 2011) și riscul de moarte subită inexplicabilă cu epilepsie (SUDEP) la această populație este estimat la 15 ori mai mare decât alte epilepsii din copilărie (Kearney, 2013). Medicamentele antiepileptice disponibile nu oferă un control adecvat al convulsiilor, iar procedurile neurochirurgicale resective nu sunt de obicei o opțiune. Noile tratamente pentru sindromul Dravet rămân o nevoie importantă nesatisfăcută, în ciuda unui anumit nivel de eficacitate în studiile clinice limitate pentru canabidiol (Epidiolex hectolix) și stiripentol (Diacomit October), care pot fi asociate cu probleme cognitive sau, respectiv, de siguranță a apetitului (Perez și colab., 1999; Chiron și colab., 2000; Detyniecki și colab., 2016; Devinsky și colab., 2016).

mutațiile în SCN1A, o genă care codifică subunitatea de formare a porilor de la un canal de sodiu cu tensiune (Nav1.1), au fost identificate la aproape 85% dintre pacienții cu sindrom Dravet (Dravet, 2011). Canalele Nav1.1 contribuie la depolarizarea rapidă a membranelor neuronale observate în timpul generării potențialului de acțiune (Hodgkin și colab., 1952). Șoarecii heterozigoți pentru o mutație a pierderii funcției în Nav1.1 dezvoltă convulsii spontane și sensibile la temperatură la începutul vieții și mor prematur în jurul zilei postnatale 25 (Yu și colab., 2006; Oakley și colab., 2009; Ceah și colab., 2012). Studiile de electrofiziologie acută la acești șoareci cu deficit de Scn1a asociate sugerează o reducere a densității curentului de sodiu și o scădere asociată a activității de ardere pentru o subpopulație de neuroni inhibitori care exprimă GABA (dar nu celule principale excitatorii) culminând cu inhibarea sinaptică redusă și hiperexcitabilitatea rețelei (Yu și colab., 2006; Kalume și colab., 2007; Han și colab., 2012). Această ipoteză a interneuronopatiei este în concordanță cu alte forme de epilepsii catastrofale din copilărie și a fost confirmată la șoareci unde Scn1a a fost șters selectiv din subpopulațiile interneuronice care exprimă parvalbumină sau somatostatină (Dutton și colab., 2013; Tai și colab., 2014). Comportamente asemănătoare autismului au fost, de asemenea, raportate la acești șoareci (Han și colab., 2012). Interesant este că studiile inițiale asupra neuronilor excitatori și inhibitori umani derivați folosind tehnologia celulelor stem pluripotente induse de la doi pacienți cu sindrom Dravet au raportat deficite în curentul de sodiu activat de tensiune pentru ambele tipuri de celule, sugerând fie compensarea homeostatică pentru pierderea timpurie a funcției unui canal de sodiu specific creierului critic, fie mecanisme suplimentare care contribuie la fenotipul epileptic observat la acești pacienți (Jiao și colab., 2013; Liu și colab., 2013).

deși șoarecii și neuronii derivați din celule stem pluripotente induse de om contribuie la înțelegerea fiziopatologiei subiacente a sindromului Dravet, aceste sisteme nu sunt potrivite pentru identificarea rapidă a noilor terapii datorită variabilității acestor modele și reproductibilității măsurătorilor cantitative. Deoarece peștii zebra sunt un sistem ideal de modele de vertebrate pentru efectuarea ecranelor bazate pe fenotip cu molecule mici (MacRae și colab., 2015) și sunt supuse manipulărilor genetice, ne-am concentrat eforturile pe un mutant al canalului de sodiu zebrafish. Mutanții peștilor Zebra care adăpostesc o mutație missense a pierderii funcției în ortologul SCN1A, scn1Lab, au fost identificați într-un ecran de mutageneză (Schoonheim și colab., 2010). Datorită unei duplicări ancestrale a întregului genom, mutanții zebrafish scn1Lab sunt haploinsuficienți pentru Nav1.1 și analog cu șoarecii Scn1a+/− sau pacienții cu sindrom Dravet. Comportamentele Convulsive și episoadele de scurtă Interictală și de lungă durată polispike ictal-descărcare electrografică asemănătoare sunt observate la larvele mutante încă din 3 zile post-fertilizare (dpf), cu progresia către fenotipuri convulsive mai robuste între 4 și 7 dpf (Baraban și colab., 2013; Hong și colab., 2016). Larvele mutante mor prematur, prezintă deficite metabolice (Kumar și colab., 2016) și sunt rezistente la multe medicamente antiepileptice (AED) (Dinday și colab., 2015). Similar cu managementul clinic al sindromului Dravet, o anumită atenuare a activității convulsive poate fi obținută cu valproat, benzodiazepine, bromuri, stiripentol, precum și o dietă ketogenică (Baraban și colab., 2013). Folosind larvele de pește zebră mutante scn1Lab și o strategie de screening bazată pe fenotip în două etape, am analizat acum peste 2300 de compuși. Clemizolul, un antagonist al receptorilor histaminici de primă generație (H1), a fost identificat ca un inhibitor puternic al activității convulsive comportamentale și electrografice (Baraban și colab., 2013). Cu toate acestea, antihistaminicele sunt contraindicate la populațiile de epilepsie pediatrică (Miyata și colab., 2011) și analogul receptorului H1 la peștele zebră prezintă o asemănare mai mică de 50% cu cea umană (Peitsaro și colab., 2007). Aici, folosim modele preclinice de pește zebră pentru a demonstra că clemizolul, dar nu antihistaminicele, exercită activitate antiepileptică. Pe baza legării ligandului și a screeningului suplimentar de droguri vizate în peștele zebră mutant scn1, am identificat mai mulți modulatori de serotonină (5-HT) ca fiind eficienți în suprimarea convulsiilor, inclusiv doi compuși aprobați de FDA (trazodonă și lorcaserin). Lorcaserin (Belviq) a fost prescris în cadrul unui program de utilizare compasională la copiii cu sindrom Dravet și a dus la reducerea activității convulsive la unii pacienți. Propunem ca modularea semnalizării 5-HT să reprezinte o nouă intervenție terapeutică pentru această epilepsie catastrofală din copilărie.

materiale și metode

întreținerea peștelui zebră

monitorizarea convulsiilor

la 5 DPF larvele individuale de pește zebră au fost plasate într-un singur puț dintr-o microplacă clară cu fund plat cu 96 de puțuri care conține medii embrionare. Larvele au fost selectate aleatoriu, deoarece determinarea sexului nu este posibilă în acest stadiu. Microplăcile au fost plasate în interiorul dispozitivului de urmărire a mișcării DanioVision și aclimatizate timp de 20 de minute la temperatura camerei. Parcele de locomoție au fost obținute pentru fiecare sondă în timpul unei epoci de înregistrare de 10 minute folosind un sistem DanioVision care rulează software-ul EthoVision XT (DanioVision, Tehnologia Informației Noldus); setările de detectare a pragurilor pentru identificarea obiectelor mai întunecate decât fundalul au fost optimizate pentru fiecare experiment. Evaluarea convulsiilor a fost efectuată utilizând următoarea scală în trei etape stabilită pentru crizele induse de pentilenetetrazol (Baraban și colab., 2005): etapa 0, nici o activitate de înot sau foarte puțin; Etapa I, a crescut, crize scurte de activitate de înot; etapa II, rapid ‘vârtej-ca’ circling înot comportament; și Etapa III, convulsii paroxistice întregul corp clonus-like, și o scurtă pierdere a posturii. Peștii de tip sălbatic sunt în mod normal punctați în etapa 0 sau I. Parcelele au fost analizate pentru distanța parcursă (în milimetri) și viteza medie (în milimetri pe secundă). După cum sa raportat anterior (Winter și colab., 2008; Baraban și colab., 2013), schimbările de viteză au fost cel mai sensibil test al comportamentului convulsiv.

pentru studiile de electrofiziologie, larvele de pește zebră au fost paralizate pentru scurt timp cu bungarotoxină (1 mg/ml) și imobilizate în 1,2% agaroză; înregistrările potențiale de câmp local au fost obținute din structurile creierului anterior folosind o tehnică cu un singur electrod, așa cum s-a descris anterior (Baraban și colab., 2005; Hong și colab., 2016). Au fost obținute sesiuni de înregistrare potențiale de câmp local încorporate în agaroză de 10 până la 30 de minute pentru fiecare pește la 1 kHz. Sistemul iZAP (Hong și colab., 2016) a fost utilizat pentru monitorizarea neinvazivă pe termen lung a peștilor Zebra în absența unui agent paralizant. Sistemul captează în mod autonom mai multe larve de pește zebră sub mai mulți electrozi de suprafață integrați în camerele microfluidice. larvele scn1Lab au fost monitorizate continuu timp de 5 ore. potențialul câmpului electric a fost înregistrat la 1 kHz continuu, cu excepția pauzelor de 2 până la 3 minute pentru schimbarea mediilor pentru tratarea și spălarea compusului. Datele înregistrate au fost analizate utilizând MATLAB pentru graficele potențiale de câmp și analiza frecvenței.

screening-ul Bibliotecii compuse

compușii pentru screening-ul medicamentelor au fost achiziționați de la Selleck Chemicals și au fost furnizați ca soluții DMSO de 10 mM. Biblioteca ligandului canalului ionic Selleck (catalog #L2700), biblioteca compusă GPCR (catalog #L2200) și o bibliotecă modulantă personalizată de 5 HT au fost utilizate pentru screening. Compușii bibliotecii sunt enumerați în tabelul suplimentar 1. În toate ecranele bibliotecii de droguri, compușii au fost codificați și experimentele au fost efectuate de anchetatori care erau orbi la natura compusului. Înregistrările inițiale ale comportamentului de locomoție au fost obținute de la mutanți în mediul embrionar, așa cum este descris mai sus; un al doilea complot de locomoție a fost apoi obținut după o schimbare a soluției la un compus de testare și o perioadă de echilibrare de 20 min. Compușii pentru studiile de locomoție au fost dizolvați în medii embrionare și au fost testați la o concentrație de 250 de inqqm, cu o concentrație finală de DMSO de 2,5%.

criteriile pentru desemnarea unui rezultat pozitiv au fost următoarele: (i) o scădere a vitezei medii de 40%; și (ii) o reducere la stadiul 0 sau stadiul I al comportamentului convulsivant în lotul de locomoție pentru cel puțin 50% din peștii testați. Fiecare compus testat clasificat ca rezultat pozitiv în testul de locomoție a fost evaluat pentru toxicitate prin vizualizare directă pe un stereomicroscop după o expunere de 90 de minute la medicament. Toxicitatea (sau mortalitatea) a fost definită ca absența bătăilor inimii sau a mișcării vizibile ca răspuns la stimularea externă la cel puțin 50% din peștii testați. Hiperexcitabilitatea a fost definită ca un compus care determină o creștere cu 40% a vitezei de înot și/sau a activității convulsive în stadiul III la cel puțin 50% din peștii testați. Hit-uri pozitive identificate în ecranul de locomoție primar au fost confirmate folosind metoda de screening locomoție într-un al doilea test cu un ambreiaj independent de pește Zebra. Compușii au fost apoi achiziționați separat de Sigma-Aldrich și testați folosind metoda de screening a locomoției pentru a treia oară pe un ambreiaj independent de pește zebră. Medicamentele care au redus viteza medie de înot peste prag și au fost netoxice în cele trei teste independente de locomoție au fost analizate în continuare folosind testul electrofiziologic. În studiile de electrofiziologie, medicamentele au fost confirmate mai întâi la o concentrație de 250 de centimetri folosind testul de locomoție și apoi același pește zebră a fost evaluat folosind o înregistrare a potențialului de câmp local. Toate screeningul a fost făcut cu compuși codificați și analizat de anchetatori orbiți de identitatea compusului.

analiza filogenetică

analiza filogenetică a secvențelor proteice umane htr2 și zebrafish Htr2 au fost efectuate cu software-ul PhyML sub parametrii de testare a raportului de probabilitate asemănător SH (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper și colab., 2008). Secvențele de proteine au fost derivate din Ensembl uman HTR2A (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198) și zebrafish htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ensdart00000104569), HTR2CL1 (ENSDART00000024191) secvențe.

analiza cantitativă a expresiei ARNm în timp real

nivelurile de Expresie ale genelor htr2 ale peștilor zebră au fost examinate folosind ARN-ul colectat de la 25 de capete sau cozi de la 5 larve mutante homozigote de tip DPF sau scn1Lab și creierul disecat de la peștii zebră masculi adulți de tip sălbatic. ARN-ul Total a fost extras folosind reactivul Trizol (Invitrogen), conform protocolului producătorului și tratat cu Dnaza I (Invitrogen). ARNm purificat a fost retrotranscris la ADNc folosind SuperScript sistem de sinteză de primă catenă (Invitrogen) cu un amestec de oligo(dT)20. Nivelurile de Expresie ale genelor htr2 de pește zebră și ale genei de menaj factorul de alungire a traducerii eucariote 1 alfa 1, ca 1 (eef1a1l1) a fost determinat folosind o mașină PCR în timp real StepOne (biosisteme aplicate). Reacțiile au fost efectuate în 20 de volume de unqql pe plăci cu 96 de godeuri folosind SYBR unql Green Master Mix (Applied Biosystems), cu grund de 250 nM și 3 unql de ADNc. Secvențele de Oligonucleotide sunt enumerate în tabelul suplimentar 2. Datele au fost analizate din trei experimente independente. Datele au fost exprimate sub formă de valori Ct și utilizate pentru a determina valorile de Centicct.

studii la om

după identificarea cu succes a compușilor din modelul nostru de pește zebră și luarea în considerare a farmacocineticii, copiilor li s-a prescris Belviq (lorcaserin) în cadrul unui protocol de utilizare compasională la Spitalul de Copii Colorado (IND 125307). Copiii s-au calificat pentru utilizarea Belviq xvif dacă au avut o mutație SCN1A sau un diagnostic clinic de sindrom Dravet și au eșuat cel puțin două medicamente, inclusiv stiripentol, în unele cazuri și excluzând blocanții canalelor de sodiu. Copiilor li s-a cerut o electrocardiogramă și o ecocardiogramă la momentul inițial și la fiecare 6 luni în timpul utilizării produsului. În plus, li s-a cerut să aibă vizite de urmărire la fiecare 3 luni pentru a asigura o creștere adecvată, precum și pentru a evalua efectele secundare suplimentare. Testele de laborator au fost necesare la fiecare 6 luni pentru a include teste hematologice, teste ale funcției hepatice și teste ale funcției renale. Doza de Belviq a fost inițiată cu 2, 5 mg la culcare și a crescut treptat săptămânal, după cum este necesar, până la o doză maximă de 10 mg de două ori pe zi sau de 0, 3 mg/kg și zi—oricare dintre acestea s-a produs mai întâi.

aprobarea Consiliului de evaluare instituțională a fost obținută pentru colectarea retrospectivă a datelor, inclusiv o renunțare la consimțământ. Datele au fost extrase dintr-o revizuire retrospectivă a dosarelor medicale electronice de la Spitalul de Copii Colorado, inclusiv vârsta, tipurile de convulsii și frecvența înainte și după utilizarea Belviq XV, evenimentele adverse, doza de Belviq XV și utilizarea concomitentă a medicamentelor.

analiza statistică

datele sunt prezentate ca eroarea standard medie a valorilor medii (sem), dacă nu se specifică altfel. Pentru comparație între două grupuri s-au folosit T-test de Student. Când varianța nu a avut o distribuție normală, a fost utilizat testul U non-parametric Mann-Whitney. One-way ANOVA după testul de comparație multiplă al lui Dunnett pentru analiză împotriva unui eșantion de control sau Holm-Sidak comparații multiple în perechi între mijloace. Diferențele considerate semnificative statistic sunt indicate cu asteriscuri (*P < 0,05; **P < 0,01).

rezultate

efectul clemizolului asupra comportamentului convulsiv la peștele zebră

am tratat larvele mutante scn1Lab (5 dpf) cu clemizol la concentrații cuprinse între 30 și 400 MMC și apoi am monitorizat efectul asupra comportamentului convulsiv spontan folosind software automat de urmărire a locomoției. Pe baza a 250 de studii repetate de control al locomoției la mutanți scn1Lab netratați, a fost stabilită o reducere a vitezei medii de înot cu 40% (>1, 5% sd) față de valoarea inițială ca prag pentru suprimarea pozitivă a comportamentului convulsiv. Clemizol (Fig. 1A) a prezentat activitate antiepileptică la 300 și 400 XC (expunere de 30 min) și la 100 XC (expunere de 90 min) (Fig. 1B); expunerile prelungite au fost toxice la concentrații mai mari. Pentru a determina dacă clemizolul poate suprima comportamentul convulsiv spontan la un al doilea mutant scn1 de pește zebră, am analizat larvele mutante scn1Laa (5 dpf) în testul de urmărire a locomoției. Larvele identificate ca comportament convulsivant în stadiul III (de exemplu, convulsii corporale complete, activitate de înot de mare viteză și o scurtă pierdere a posturii; Fig. 1C) au fost confirmate ca prezentând descărcări electrografice cu componente interictale și ictale în înregistrările de teren ulterioare din creierul anterior (Fig. 1D). Viteza medie de înot pentru larvele identificate ca S3 sau ‘presupuși mutanți scn1Laa’ zebrafish a fost semnificativ mai mare decât pentru controalele fraților sau pentru toate larvele testate (Fig. 1E); mutanții au fost confirmați ca homozigoți scn1Laa prin PCR post-hoc. Apoi am testat medicamente care s-au dovedit anterior că suprimă convulsiile spontane în sindromul Dravet și mutanții scn1Lab (250 stiripentol și 250 diazepam), precum și 250 lamotrigină (un AED care poate agrava convulsiile în sindromul Dravet). Așa cum era de așteptat, stiripentolul și diazepamul, dar nu lamotrigina, au suprimat semnificativ comportamentul convulsiv la larvele mutante scn1Laa; clemizolul de 250 mm a fost, de asemenea, eficient în acest test (Fig. 1F). Împreună, aceste studii demonstrează că clemizolul poate suprima comportamentul convulsiv în două linii diferite de pește zebră mutant scn1.

investigarea mecanismului de acțiune pentru clemizol

ecranul secundar de droguri folosind mutanți scn1Lab

screeningul terțiar pentru identificarea compușilor promițători de plumb pentru clinica

5-expresia receptorului HT la larvele de pește zebră

deoarece clemizolul are o afinitate semnificativă de legare la HTR2A și HTR2B și atât trazodona, cât și lorcaserina sunt modulatori de semnalizare 5-HT, am căutat să confirmăm expresia acestor receptori la peștele zebră. Alinierea secvenței proteice a receptorilor HTR2 umani și a peștilor Zebra a evidențiat conservarea evolutivă cu ortologii peștilor Zebra, cu htr2aa și Htr2ab ambele prezentând 59,3% identitate proteică cu htr2a umană; și un singur ortolog HTR2B, Htr2b prezentând 62,0% identitate proteică. Cuantificarea nivelului de Expresie htr2 folosind capete sau cozi izolate de 5 larve mutante DPF de tip sălbatic sau scn1Lab a relevat expresia îmbogățită htr2a și htr2cl1 în cap. Rezultate similare au fost obținute din creierul de pește zebră de tip sălbatic adult, deoarece larvele mutante nu supraviețuiesc până la maturitate (Fig suplimentar. 4).

reducerea frecvenței convulsiilor la pacienții cu sindrom Dravet

sindromul Dravet este o epilepsie catastrofală în copilărie și o tulburare rară (http://www.rarediseases.org/) cu rezultate debilitante, inclusiv epilepsie intratabilă, dezvoltare cognitivă sever limitată și risc de SUDEP. Datele noastre preclinice confirmă faptul că modularea semnalizării 5-HT poate suprima convulsiile asociate cu mutații ale pierderii funcției SCN1A. Deoarece modulatorii 5-HT identificați sunt compuși aprobați de FDA cu profiluri de siguranță cunoscute, tratamentul cu aceste medicamente refolosite ar putea modifica frecvența convulsiilor la copiii cu sindrom Dravet. Această abordare translațională vizează bolile rare și devastatoare pentru care studiile clinice la scară largă nu sunt fezabile (Dunoyer, 2011; Parker și colab., 2013).

deoarece clemizolul nu este în prezent fabricat sau Disponibil în formulare de grad clinic, iar trazodona poate acționa ca un agonist sau antagonist al receptorului 5-HT, în funcție de concentrație (Maj și colab., 1979; Marcoli și colab., 1998), am ales să evaluăm Belviq (lorcaserin) în cadrul unui program de utilizare compasională în afara etichetei la o populație mică de copii cu sindrom Dravet. Acești copii s-au dovedit a fi rezistenți la cel puțin cinci AED aprobate. Cinci copii (vârsta medie: 11,8 ani; Interval: 7-18 ani) heterozigoți pentru o deleție în SCN1A au fost tratați prospectiv cu Belviq XV și urmăriți longitudinal la Spitalul de Copii Colorado (Aurora, CO). Protocolul de tratament a fost aprobat de Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB), iar părinții pacienților cu sindrom Dravet au consimțit în scris la participarea copilului lor. Am analizat retrospectiv numărul raportat în jurnal de convulsii tonico-clonice atonice, mioclonice și generalizate (GTC), reacții adverse și Ae concomitente.

caracteristicile clinice ale copiilor cu sindrom Dravet tratați cu Belviq XV sunt rezumate în tabelul 1. Nu s-au înregistrat decese în rândul celor cinci pacienți tratați cu Belviq inkt, iar Belviq inkt a fost bine tolerat fără evenimente adverse grave care au determinat întreruperea tratamentului. În timpul tratamentului cu Belviq în afara etichetei, un pacient a fost inițial fără convulsii timp de 3 săptămâni, un pacient a fost fără convulsii timp de 2 săptămâni, iar un al treilea pacient a avut 1-2 zile fără convulsii pe săptămână. Toți cei cinci pacienți au prezentat o reducere a numărului total de convulsii. Convulsiile tonico-clonice generalizate au fost reduse semnificativ la pacienții 1, 2 și 3. Într-adevăr, pacientul 2 a prezentat o reducere de 90% a convulsiilor tonico-clonice generalizate, fără a fi nevoie de medicamente de salvare. Doi pacienți rămân în tratament cu Belviq xvid, fără o creștere a frecvenței convulsiilor și, așa cum era de așteptat, cel mai frecvent efect secundar observat a fost scăderea apetitului alimentar. Un pacient a reluat medicația a doua oară cu o îmbunătățire intermediară pentru o perioadă scurtă de timp și apoi s-a redus.

discuție

Clemizol, un antihistaminic de primă generație descoperit în anii 1950 (Zierz și colab., 1952), a fost identificat ca un potențial terapeutic pentru tratamentul sindromului Dravet folosind scn1Lab mutant zebrafish pentru a examina bibliotecile de medicamente refolosite (Baraban și colab., 2013; Dinday și colab., 2015). Aici am confirmat o activitate antiepileptică pentru clemizol folosind un al doilea model mutant scn1 zebrafish. Din păcate, clemizolul este metabolizat rapid la șoareci cu un timp de înjumătățire plasmatică <10 min (comparativ cu 3,4 ore la om) (Nishimura și colab., 2013), limitându-și evaluarea în modele murine. Folosit cu succes ca antihistaminic (Zierz și colab., 1952; Jacques și colab., 1960) cu studii acute și cronice care raportează un ordin scăzut de toxicitate (Finkelstein și colab., 1960), clemizolul nu mai este fabricat și nu este disponibil în prezent pentru administrare clinică off-label. Lipsind un mijloc de evaluare eficientă a clemizolului în modelele preclinice de rozătoare, am folosit zebrafish pentru implicarea țintă (receptorii 5-HT) și identificarea medicamentelor înrudite (trazodonă și lorcaserină) cu profiluri de siguranță adecvate care facilitează traducerea rapidă într-o aplicație clinică. De asemenea, este descrisă utilizarea plină de compasiune, prescripția off-label A Belviq xvide (lorcaserin) la pacienții cu sindrom Dravet dificil din punct de vedere medical.

antagoniștii receptorilor H1 antihistaminici sunt în mod normal contraindicați la populațiile de copii și adolescenți (Miyata et al., 2011) și screening-ul acestor medicamente au confirmat incapacitatea lor de a suprima (și, în unele cazuri, exacerba) convulsiile la peștele zebră scn1. Datele de legare au evidențiat o afinitate necunoscută anterior clemizolului pentru receptorii HTR2A și / sau HTR2B. Un ecran fenotipic ulterior al bibliotecilor vizate a identificat doi compuși modulatori 5-HT, trazodonă și lorcaserină, capabili să suprime convulsiile comportamentale și electrofiziologice într-un mod comparabil cu clemizolul. Belviq (lorcaserin) este un agonist HTR2C aprobat de FDA prescris pentru managementul greutății cronice (Thomsen și colab., 2008). Desyrel (trazodonă) este, de asemenea, un antidepresiv aprobat de FDA, prescris în mod obișnuit pentru tulburările de somn (Mendelson, 2005). Este frecvent clasificat ca antagonist invers HTR2A și HTR2C și inhibitor al absorbției 5-HT (Stahl, 2009). Cu toate acestea, studiile efectuate la șobolani sugerează că trazodona sau metabolitul său meta-clorofenilpiperazină (mCPP) poate acționa ca un agonist HTR2C la concentrații mai mari (Maj și colab., 1979; Marcoli și colab., 1998). În special, tratamentul cronic cu trazodonă s-a dovedit anterior a fi protector împotriva convulsiilor induse electroconvulsive la șoareci (Chavan și colab., 2010; Borowicz și colab., 2012), susținând datele noastre de la scn1lab mutant zebrafish. O acțiune mediată de receptorul 5-HT pentru clemizol este, de asemenea, în concordanță cu un ecran fenotipic recent în care modulatorii semnalizării serotoninergice (inclusiv clemizolul) s-au dovedit a fi un tratament eficient într-un model preclinic al bolii Machado-Joseph (Teixeira-Castro și colab., 2015); iar studiile de aici sugerează că clemizolul și trazodona justifică dezvoltarea ulterioară pentru testarea off-label la pacienții cu sindrom Dravet.

rezultatele noastre se adaugă, de asemenea, unui număr tot mai mare de dovezi care sugerează modularea semnalizării serotoninergice ca un supresor puternic al activității convulsive, în special în epilepsiile catastrofale din copilărie, cum ar fi sindromul Dravet. Recent, 7 din 10 pacienți aflați în tratament cu doze mici cu blocantul de recaptare 5-HT fenfluramină s-au auto-raportat a fi fără convulsii timp de 1 an (Ceulemans și colab., 2016). O ușoară îngroșare a uneia sau a două valve cardiace a fost raportată la doi dintre acești pacienți, în concordanță cu o posibilă relație între utilizarea fenfluraminei și hipertensiunea pulmonară (Douglas și colab., 1981; Ceulemans și colab., 2016). La om, HTR2A și HTR2C sunt exprimate în SNC, în timp ce expresia HTR2B este îmbogățită în inimă (Lambe și colab., 2011; Meltzer și colab., 2013). Mai precis, HTR2C este exprimat pe o subpopulație de interneuroni inhibitori (Liu și colab., 2007) și activarea acestor receptori cu 5-HT crește inhibarea sinaptică mediată de GABA (Boothman și colab., 2006) adică mecanismul de acțiune antiepileptic care stă la baza multor medicamente antiepileptice prescrise în mod obișnuit. Într-adevăr, majoritatea studiilor preclinice sugerează că activarea receptorilor HTR2A și/sau HTR2C are efecte antiepileptice (Gharedaghi și colab., 2014; Guiard și colab., 2015), care este un mecanism rezonabil de acțiune care leagă clemizolul, lorcaserina, trazodona și blocantul de recaptare 5-HT fenfluramină (Dinday și colab., 2015; Ceulemans și colab., 2016). Interesant este că expresia htr2b în creierul peștilor Zebra a fost relativ scăzută, sugerând în continuare că aceste medicamente exercită potențial activitate antiepileptică prin activarea receptorului HTR2A sau HTR2C. Interesant, studiile efectuate în muștele knock-in Drosophila care transportă mutația umană K1270T SCN1A în gena canalului para sodic au arătat că suplimentarea cu un precursor 5-HT (5-hidroxitriptofan) salvează fenotipul convulsiv indus de căldură (Schutte și colab., 2014). În plus, un studiu recent care utilizează mutanți scn1Lab a evaluat 13 compuși de semnalizare 5-HT și a sugerat, de asemenea, un potențial rol antiepileptic pentru modulatorii de semnalizare 5-HT (Sourbron și colab., 2016). Cu toate acestea, aceste studii din urmă zebrafish au folosit un protocol fundamental diferit (24 h față de 30-90 min expunere la medicament) care nu a fost validat anterior ca identificând cu succes AED-urile utilizate în sindromul Dravet (benzodiazepine, valproat, stiripentol, bromuri și dieta ketogenică). În plus, concentrațiile de droguri sunt de aproximativ 10 ori mai mici decât demonstrăm că sunt eficiente la peștele Zebra (Baraban și colab., 2005, 2013; Dinday și colab., 2015) și raportarea unei acțiuni antiepileptice pentru halucinogenul TCB-2 (Fig. 5), sugerează că compararea directă a datelor din laboratoare care utilizează proceduri diferite ar trebui interpretată cu prudență.

în general, concluzionăm că peștii Zebra mutanți sunt un model adecvat pentru screeningul rapid și descoperirea noilor AED care, cu profiluri de siguranță adecvate, pot informa direct îngrijirea clinică pentru populațiile de pacienți cu risc, cum ar fi sindromul Dravet.

abrevieri

abrevieri
• 5-HT

  serotonină

• AED

  medicament antiepileptic

• dpf

  zile după fertilizare

• GPCR

  receptor cuplat cu proteina G

• iZAP

  platformă integrată de analiză a peștilor Zebra

mulțumiri

am dori să mulțumim membrilor laboratorului Baraban, Brian Grone și Matthew Dinday, în special, pentru util discuții pe parcursul acestor studii.

finanțare

S. C. B recunoaște finanțarea din grantul NINDS R01 nr. NS079214, Premiul UCSF Catalyst și Fondul sabatic Raymond &Beverley Sackler Center.

material suplimentar

material suplimentar este disponibil la Brain online.