Ck20 și CK5/6 colorarea imunohistochimică a neoplasmelor uroteliale: o perspectivă

rezumat

Citokeratinele aparțin familiei filamentelor intermediare. Acestea sunt exprimate într-o manieră foarte specifică în celulele epiteliale, unde joacă un rol crucial în integritatea și stabilitatea mecanică a celulelor. Mai multe tipuri de citokeratine au fost descrise atât în uroteliul normal, cât și în cel neoplazic. În cazul neoplasmelor uroteliale, expresia CK20 și CK5 / 6 a fost demonstrată în mai multe studii ca având implicații diagnostice și prognostice. Astfel, carcinomul urotelial de grad scăzut manifestă expresia CK limitată la celulele umbrelă, în timp ce tumorile de grad înalt au de obicei o expresie în întreaga grosime a uroteliului, cu excepția stratului bazal. Expresia CK5 / 6, pe de altă parte, este exprimată în celulele bazale în toate carcinoamele uroteliale de grad scăzut și unele de grad înalt. Colorarea difuză CK20 însoțită de pierderea stratului bazal CK5/6-pozitiv este de obicei asociată cu un comportament clinic agresiv. Dubla colorare a diapozitivelor pentru aceste citokeratine poate facilita interpretarea și corelarea corespunzătoare.

1. Introducere

Citokeratinele aparțin familiei citoscheletului cu filament intermediar de 10 nm prezent în toate celulele. Proteinele filamentului intermediar sunt exprimate într-o manieră foarte specifică tipului de celule, iar aici keratinele reprezintă categoria tipică de filament intermediar prezentă în celulele epiteliale. Aceste filamente sunt un grup complex de polipeptide insolubile în apă, cu dimensiuni cuprinse între 40.000 și 68.000 Mr. În epitelii, filamentele de keratină pot fi grupate ca tonofilamente, împletesc nucleul, se întind prin citoplasmă și se atașează la plăcile citoplasmatice ale joncțiunilor tipice celule epiteliale-celule, desmosomii. Astfel, keratinele joacă un rol funcțional major în integritatea și stabilitatea mecanică atât a celulelor epiteliale unice, cât și a țesuturilor epiteliale și sunt o parte inerentă a continuumului stabilității de la celula unică la formarea țesutului .

proteinele de keratină pot fi împărțite în keratine mici acide de tip I și mari bazice până la neutre de tip II. O proprietate unică a keratinelor este că, spre deosebire de celelalte proteine cu filament intermediar, ele pot constitui doar stadiul lor filamentos prin formarea de perechi de molecule de tip I și tip II (1 : 1). Printre keratinele umane, recenta nomenclatură consensuală cuprinde keratinele de tip I K9–K10, K12–K28 și K31–K40 și keratinele de tip II K1–K8 și K71-K86. În genomul uman, genele de keratină sunt grupate în două situsuri cromozomiale diferite: cromozomul 17q21.2 (keratine de tip I, cu excepția K18) și cromozomul 12q13.13 (keratine de tip II și K18). Se crede că cele două subfamilii de citokeratină au apărut prin duplicarea genelor și divergența ulterioară a CK8 și CK18 .

fiecare tip de celulă epitelială exprimă o combinație caracteristică de două până la zece izotipuri de citokeratină. Astfel, celulele epiteliale normale in vivo sau in vitro pot fi identificate în ceea ce privește profilul lor de izotip citokeratină. Profilurile caracteristice de citokeratină ale diferitelor tipuri normale de celule epiteliale tind să fie reținute în urma transformării neoplazice și această caracteristică poate fi exploatată în diagnosticul tumoral. Cu toate acestea, profilurile de citokeratină ale celulelor epiteliale pot reflecta, de asemenea, diferențierea funcțională, mai degrabă decât țesutul de origine. Astfel, celulele metaplastice exprimă caracteristicile profilului citokeratinei ale morfologiei lor, mai degrabă decât cele ale omologului lor normal .

2. Expresia citokeratinei în Uroteliu în timpul dezvoltării embriologice

citokeratinele sunt primul tip de filament intermediar care apare în timpul embriogenezei și toate celulele într-un anumit stadiu al dezvoltării fetale sunt citokeratină pozitivă. Primele izotipuri de citokeratină care trebuie exprimate sunt perechea CK8 + CK18. În timpul transformării epiteliale-mezenchimale embriologice, expresia citokeratinei este pierdută de anumite linii de celule, care fie rămân citokeratină negativă și se dezvoltă în țesut conjunctiv, fie mai târziu re-exprimă citokeratinele epiteliilor secundare . Dezvoltarea embriologică a vezicii urinare provine din cloaca, o structură posterioară, care este o cameră comună pentru deșeurile gastrointestinale și urinare. În săptămânile 4-7 de dezvoltare, cloaca este împărțită de septul urorectal în două părți: canalul anorectal posterior și sinusul urogenital anterior. Partea superioară a sinusului urogenital formează vezica urinară .

în timpul dezvoltării timpurii a vezicii urinare, epiteliul mucoasei se transformă treptat de la epiteliul endodermic simplu la căptușeala urotelială multistratificată. Ca model al căptușelii endodermice în tractul GI, căptușeala urotelială în curs de dezvoltare este inițial difuză pozitivă pentru CK20 în toate straturile. În timpul maturării ulterioare a uroteliului, se dezvoltă un strat bazal care poate fi demonstrat prin pozitivitatea CK5 și CK13. Maturarea ulterioară a uroteliului implică pierderea CK20 în aproape toate straturile, cu excepția celulelor umbrelă. Astfel, se pare că există trei faze distincte ale dezvoltării uroteliale. Prima etapă se caracterizează printr-o lipsă de celule bazale și expresie CK20 în toate straturile. A doua fază este determinată de apariția stratului bazal, dar modelul de Expresie CK20 este încă difuz. În a treia și ultima etapă, există maturarea modelului de Expresie CK20 care se caracterizează prin CK20 numai în stratul umbrelă. Stratul bazal este bine dezvoltat și poate fi demonstrat prin imunostimularea CK5/6 sau CK13 .

3. Expresia citokeratinei în Uroteliul Normal

vezica urinară este căptușită de uroteliu, care este specializat pentru a funcționa ca o barieră în calea urinei și pentru a se adapta modificărilor volumului intraluminal. Uroteliul apare ca un epiteliu multistrat, cu trei zone celulare: (1) un strat bazal compus din celule în contact și orientate perpendicular pe planul membranei bazale; (2) Zona celulară intermediară compusă din 2-5 straturi celulare; (3) un strat de celule luminal sau superficiale compus din celule intermediare târziu și mari, frecvent binucleate, „umbrelă” celule cu suprafața lor apical cu care se confruntă lumenul. Celulele umbrelă se caracterizează printr-un tip de joncțiuni celulare zonula occludens și prin prezența plăcilor specializate ale membranei unitare asimetrice în membrana celulară apicală și în veziculele fuziforme intracelulare . Această apariție se datorează prezenței uroplakinei abundente în membrana celulară .

în uroteliul adult normal, CK7, CK8, CK18 și CK19 sunt exprimate în toate straturile celulare uroteliale, CK5 este exprimat bazal, iar CK20 este asociat cu celule umbrelă (Figura 1).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

(a) uroteliu Normal care dezvăluie mai multe straturi de celule, inclusiv celule bazale, celule intermediare și celule umbrelă. (b) pata imunohistochimică care dezvăluie modelul normal de colorare al uroteliului. Celulele umbrelă sunt decorate de ck20 (magenta). Celulele intermediare sunt necolorate. Celulele bazale sunt decorate prin colorarea CK5/6 (maro).

pot exista, de asemenea, câteva celule CK20-pozitive în stratul celular intermediar al unor specimene normale .

4. Expresia citokeratinei în neoplazia Urotelială papilară

transformarea neoplazică a celulelor uroteliale dă naștere carcinomului urotelial, cea mai frecventă formă de cancer de vezică urinară în majoritatea țărilor. Mulți pacienți prezintă tumori superficiale care sunt fie neinvazive (pTa), fie invadează numai lamina propria (pT1). În timp ce recurența este frecventă (50-70%), boala poate fi de obicei controlată prin tratament local. Cu toate acestea, 10-15% dintre pacienții cu boală superficială progresează în cele din urmă la boli musculare invazive și metastatice. O creștere a gradului, caracterizată printr-o pierdere de diferențiere și prezența modificărilor displazice sunt ambii factori determinanți ai prognosticului slab. În plus, unele carcinoame uroteliale prezintă diferențiere bazală/scuamoasă, care a fost asociată cu un prognostic mai slab .

modelul de colorare imunohistochimică pentru citokeratină20 și CK5/6 variază în funcție de tipul și natura neoplasmului urotelial. De exemplu, neoplasmele uroteliale papilare cu potențial malign limitat (PUNLMP), precum și carcinoamele papilare de grad scăzut dezvăluie ck20 limitat la celulele umbrelă și colorarea CK5/6 limitată la stratul bazal, identică cu distribuția acestor keratine în uroteliul normal (Figura 2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 2

(a) carcinom urotelial papilar de grad scăzut. (b) pata imunohistochimică care prezintă expresia ck20 (magenta) limitată la celulele umbrelă și un strat bazal bine format reprezentat de colorarea CK5/6 (maro). (c) carcinom urotelial de grad scăzut, cu colorare a celulelor bazale, dar lipsit de celule umbrelă.

carcinoamele uroteliale de grad înalt, pe de altă parte, tind să aibă imunoreactivitate difuză pentru CK20 care implică celulele umbrelă, precum și stratul intermediar. În plus, stratul bazal poate fi demonstrat prin pozitivitatea CK5 / 6 (Figura 3).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 3

(a) carcinom urotelial papilar de grad înalt. (b) carcinom urotelial papilar de grad înalt, cu colorare difuză în grosime completă pentru CK20 și prezența stratului bazal, așa cum s-a demonstrat prin colorarea CK5/6. (c) carcinom urotelial de grad înalt care dezvăluie prezența difuză a celulelor bazale și colorarea cu grosime completă pentru CK20.

carcinomul urotelial papilar de grad superior, pe de altă parte, relevă expresia CK20 în întreaga grosime a uroteliului cu absența stratului bazal și colorarea negativă pentru CK5/6 (Figura 4).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 4

(a) carcinom urotelial de grad înalt cu pierdere parțială a celulelor bazale, dar colorare difuză pentru CK20. (b) carcinom urotelial de grad înalt, cu pierderea aproape completă a celulelor bazale. (c) carcinom urotelial papilar de grad înalt care prezintă colorație imunohistochimică difuză pentru CK20 și absența completă a stratului bazal fără colorare pentru CK5/6.

acest model cu colorare difuză ck20 cu grosime completă în absența colorării stratului bazal este, de asemenea, o caracteristică întâlnită în carcinoamele uroteliale de grad înalt cu lamina propria sau invazia musculară (Figura 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 5

(a) carcinom urotelial de grad înalt cu invazie timpurie care prezintă colorare citoplasmatică puternică CK20 și absența celulelor bazale. (b) carcinom urotelial de grad înalt cu invazie extinsă. Celulele carcinomului sunt difuz pozitive pentru CK20, dar stratul bazal este absent.

s-a sugerat că modelul colorării CK20 este un adjuvant util morfologiei în diagnosticul carcinomului urotelial. De asemenea, s-a sugerat că expresia CK20 poate prezice potențialul malign în tumorile uroteliale de grad scăzut și, prin urmare, CK20 poate fi util în definirea strategiilor de tratament pentru pacienții cu aceste tumori. Expresia CK20 a fost reținută de majoritatea carcinoamelor uroteliale pure, păstrând modelul normal de localizare superficială în unele tumori papilare bine diferențiate sau prezentând o reacție eterogenă sau uniform pozitivă în toate straturile celulare. Porțiuni ale carcinomului cu diferențiere scuamoasă relevă o reducere a expresiei CK20. Cu toate acestea, aceste zone reacționează pozitiv pentru CK5/6 [figurile 6 (a) și 6(b)] într-un model diferit de distribuția bazală a stratului bazal .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 6

(a) carcinom urotelial de grad înalt cu diferențiere focală scuamoasă. (b) colorarea imunohistochimică care demonstrează colorarea puternică CK5/6 în zona diferențierii scuamoase. Partea rămasă a petelor de carcinom pentru CK20. (c) carcinom urotelial de grad înalt cu caracteristici morfologice bazocuamoase. (d) colorarea imunohistochimică în carcinomul bazocuamos cu imunostimulare puternică pentru CK5/6 și absența completă a pozitivității CK20.

în unele cazuri, întregul carcinom poate prezenta caracteristici basosquamous. Aceste cazuri prezintă reactivitate puternică pentru CK5 / 6 cu pozitivitate mică sau deloc pentru CK20 [figurile 6 (c) și 6(d)].

două studii publicate recent au furnizat dovezi suplimentare cu privire la semnificația clinică a diferitelor modele de imunostimulare pentru CK20 și CK5/6. Într-unul dintre aceste studii, probele tumorale de la 222 de pacienți cu carcinoame uroteliale ale tractului superior care au fost tratați cu nefroureterectomie radicală au fost analizate pentru exprimarea a șapte markeri imunohistochimici bazali/luminali (CK5, EGFR, CD44, CK20, p63, GATA3 și FOXA). Prin utilizarea CK5 și CK20, au definit patru subtipuri de carcinoame uroteliale ale tractului superior:(i)exclusiv CK20 pozitiv și CK5 negativ (CK20+/CK5−)(ii)exclusiv CK5 pozitiv și ck20 negativ (CK20−/CK5+)(iii)ambii markeri pozitivi (CK20+/CK5+)(iv)ambii markeri negativi (CK20−/CK5−)

în analiza de regresie multivariată a Cox, subtipul ck20+/CK5 a fost un marker prognostic cu un risc crescut de 3,83 ori de deces specific cancerului comparativ cu celelalte trei subtipuri .

într-un al doilea studiu, colorarea imunohistochimică pentru CK5/6 și CK20 a fost raportată a fi corelată cu prognosticul carcinomului urotelial precoce. În plus, profilurile de Expresie genică ale subgrupurilor de carcinom urotelial papilar de grad superior de grad superior (UTUC) non-invaziv muscular clasificate după nivelurile de Expresie CK5/6 și CK20 au fost studiate și corelate cu rezultatele clinice. Aceste subgrupuri au inclus CK5/6-înalt/CK20-scăzut, CK5/6-înalt/CK20-înalt și CK5/6-scăzut / CK20-înalt. Ultimul grup caracterizat prin expresia scăzută a CK5/6 și expresia ridicată a CK20 a fost predictiv pentru prognosticul mai rău al carcinoamelor uroteliale de grad înalt papilar non-invaziv muscular. Analiza transcripțională a relevat 308 gene exprimate diferențiat în subgrupuri. Analizele funcționale ale genelor au identificat adeziunea celulară ca un proces comun îmbogățit diferențiat în acest subgrup în comparație cu celelalte, ceea ce ar putea explica fenotipul său cu risc ridicat. Semnăturile ciclului celular târziu / proliferării au fost, de asemenea, îmbogățite în acest subgrup . Astfel, se pare că tumorile uroteliale caracterizate prin colorare difuză pentru CK20 în absența stratului bazal demonstrabil reprezintă subtipul cel mai agresiv al carcinomului urotelial papilar.

Citokeratina 5/6 este prezentă în epiderma keratinizantă normală și în epiteliul mucoasei scuamoase, precum și în celulele bazale sau celulele mioepiteliale ale sânului, glandelor salivare și prostatei . În biopsiile de prostată și sân, CK5/6 decorează stratul bazocelular și astfel este util în diagnosticul carcinomului invaziv, acesta din urmă fiind lipsit de celule bazale. Arhitectura uroteliului este diferită de cea a epiteliului ductal prostatic sau mamar, rezultând că prezența sau absența celulelor bazale nu poate fi utilizată pentru stratificarea neoplasmelor uroteliale în tipuri benigne sau maligne. Cu toate acestea, absența celulelor bazale în neoplasmele uroteliale poate indica un prognostic slab. Astfel, un carcinom urotelial de grad înalt cu un strat bazal conservat se poate comporta mai puțin agresiv în comparație cu o altă tumoare de grad înalt în care stratul bazal a fost pierdut. În laboratorul nostru, folosim colorarea dublă pentru aceste citokeratine, ceea ce este extrem de util în interpretarea corectă a acestor pete.

un model similar de colorare poate fi observat și în carcinomul urotelial in situ . Aceste leziuni sunt de obicei puternic reactive pentru CK20 și pot sau nu să rețină stratul bazocelular CK5/6-pozitiv. Tipul de carcinom urotelial in situ și extensia pagetoidă a celulelor carcinomului pot fi, de asemenea, recunoscute prin colorarea CK20 pozitivă (Figura 7).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 7

(a) carcinom urotelial in situ cu imunostimulare puternică cu grosime completă pentru CK20 cu un strat bazocelular distinct pozitiv pentru CK5/6. (b) un alt carcinom urotelial in situ cu colorare puternică pentru CK20 și absența stratului bazal. (c) extinderea Pagetoidă a carcinomului urotelial demonstrată prin colorare citoplasmatică puternică pentru CK20 pe fundalul mai multor straturi de celule bazale reactive pentru CK5/6.

într-o minoritate de cazuri, carcinomul in situ poate fi Reactiv pentru CK5/6 indicând o diferențiere bazaloidă .

5. Diferențierea Urotelială embriologică versus Dediferențierea în neoplazia Urotelială

corelația strânsă dintre modelele de expresie a izotipului citokeratinei și diferențierea epitelială sugerează că citokeratinele sunt cruciale pentru structura și/sau funcția țesutului epitelial. Cu toate acestea, a fost dificil să se stabilească care sunt contribuțiile precise ale indivizilor sau combinațiilor de izotipuri de citokeratină la fenotipul și comportamentul celulelor epiteliale normale și neoplazice. Astfel, modificările imunolocalizării CK20 care indică un risc mai mare de recurență a carcinomului urotelial reflectă probabil o modificare secundară legată de dereglarea programului de diferențiere urotelială în timpul carcinogenezei, mai degrabă decât să indice că CK20 este direct implicat. Se poate specula că modelele de exprimare a CK20 și CK5/6 în diferite carcinoame uroteliale tind să imite etapele dezvoltării embriologice și diferențierea uroteliului. Astfel, carcinoamele uroteliale de grad înalt (cu sau fără invazie) care se caracterizează prin Expresie difuză CK20 fără niciun strat bazal pot reprezenta stadiul incipient al diferențierii uroteliale după separarea sinusului urogenital de cloaca . În această etapă de dezvoltare, uroteliul manifestă colorare difuză CK20, dar nu are un strat bazal. În unele carcinoame uroteliale de înaltă calitate, există o colorare uniformă a tuturor straturilor de către CK20, dar există și un strat bazal bine format demonstrabil prin expresia CK5/6. Aceasta poate fi echivalentă cu stadiul intermediar al diferențierii uroteliale embrionare. Carcinoamele uroteliale bine diferențiate se caracterizează prin prezența unui model Matur de Expresie CK20 în care expresia sa este limitată în cea mai mare parte la celulele umbrelă, în timp ce stratul de celule bazale bine definit imunoreactiv pentru CK5/6 este de asemenea prezent (figurile 8 și 9).

figura 8

(a) Desen animat care prezintă etapele diferențierii în timpul dezvoltării embriologice a uroteliului. În primele etape, uroteliul în curs de dezvoltare păstrează expresia CK20 văzută în mod normal în cloaca. În această etapă, nu este prezent niciun strat bazal. (b) în timpul dezvoltării uroteliului, stratul bazal nu poate fi demonstrat prin colorarea pentru CK5/6. (c) etapa finală a diferențierii uroteliale cu expresia normală a CK20 limitată la celulele umbrelă și prezența stratului bazal normal care manifestă expresia CK5/6.

Figura 9

(a) Desen animat care prezintă un model de colorare imunohistochimică într-un carcinom urotelial papilar de grad scăzut, cu expresia CK20 limitată la celulele umbrelă și prezența unui strat bazal bine definit care exprimă CK5/6. (b) carcinomul urotelial de grad înalt relevă expresia CK20 în toate straturile de uroteliu, cu excepția stratului bazal care conține CK5/6. Aceasta poate reprezenta o etapă intermediară de dediferențiere a tumorii. (c) în carcinomul urotelial de grad înalt, stratul bazal poate fi absent, dar modelul difuz de colorare ck20 este menținut. Aceste caracteristici pot indica o dediferențiere suplimentară a carcinomului.

acest model poate fi echivalent cu stadiul final al dezvoltării uroteliale și maturării în perioada intrauterină.

în rezumat, colorarea imunohistochimică a carcinomului urotelial pentru CK20 și CK5/6 poate oferi informații utile cu privire la natura carcinomului urotelial și comportamentul său clinic.

disponibilitatea datelor

nu au fost utilizate date în sprijinul acestui studiu.

conflicte de interese

autorii declară că nu au fonduri sau conflicte de interese de dezvăluit.

mulțumiri

autorii ar dori să recunoască asistența valoroasă și expertiza tehnică a următorului personal de supraveghere și tehnic al laboratorului nostru imunohistochimic în performanța colorării imunohistochimice în două culori: Doamna Rajaa al Abdulla, supervizor; doamna Huda Ahmed Al Hijji, supervizor; și doamna Zuhoor Ali, tehnolog senior.