cisplatina ototoxicitatea implică citokine și rețeaua de semnalizare STAT6

reactivi

cisplatina și 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difenil-tetrazoliu bromură (MTT) au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, SUA). Materialele de cultură din plastic au fost cumpărate de la Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, SUA). Mediul esențial modificat de Dulbecco( DMEM), serul fetal bovin (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, SUA) și alți reactivi de cultură tisulară au fost obținuți de la Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, Statele Unite ale Americii). Proteina recombinantă de șoarece IL-4 și IL-13, anticorpii împotriva IL-4, IL-13, TNF-XV, IL-1, IL-6 și kiturile de testare imunosorbentă legată de enzime (Elisa) (QuantikineR) pentru citokine au fost achiziționate de la R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, Statele Unite ale Americii). Acești anticorpi au fost utilizați pentru imunohistochimie la o concentrație de 1:200. Anticorpii la P-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) și IkB au fost achiziționați de la Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, CA, Statele Unite ale Americii).

cultură celulară și viabilitate

stabilirea și caracterizarea celulelor auditive HEI-OC1 imortalizate condiționat a fost descrisă în raportul nostru anterior 1. Expresia markerilor specifici OHC, cum ar fi Math1 și miozina 7a sugerează că celulele HEI-OC1 reprezintă precursori OHC. Celulele HEI-OC1 au fost menținute în DMEM cu conținut ridicat de glucoză (Gibco BRL) conținând 10% FBS. Pentru experimentele descrise mai jos, celulele HEI-OC1 au fost cultivate în următoarele condiții permisive: 33 C și 5% CO2 în DMEM suplimentat cu 10% FBS. Celulele (3 celule 104 / sondă dintr-o placă cu 24 de godeuri) au fost incubate cu cisplatină de 20 de centimili timp de 24 de ore. pentru a determina viabilitatea celulară, MTT (0,25 mg) a fost adăugat la o suspensie celulară de 1 ml timp de 4 ore. după spălarea celulelor și trei spălări cu PBS (pH 7,4), produsul formazan insolubil a fost dizolvat în DMSO. Densitatea optică (OD) a fiecărui puț de cultură a fost apoi măsurată folosind un cititor de microplăci (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) la 590 nm. OD a celulelor de control a fost luată pentru a indica viabilitatea 100%. Pentru a examina efectele diferitelor citokine, anticorpii neutralizanți împotriva citokinelor au fost adăugați la culturi timp de 30 de minute, după care au fost cultivați cu 20 de cisplatină de 24 de ore.

animale

STAT4−/− (generația backcross N10), STAT6−/− (generația backcross N6) și șoarecii WT BALB/c au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME, SUA). Șoarecii homozigoți STAT4 și STAT6 ko au fost identificați prin PCR. Șoarecii KO nu au prezentat anomalii de dezvoltare. Experimentele au fost efectuate la șoareci în vârstă de 6 săptămâni, iar toți șoarecii au fost potriviți în vârstă în decurs de 3 zile. Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă comercială standard în timp ce au fost adăpostiți la o temperatură ambiantă de 20-22 centimetric C și o umiditate relativă de 50 centimetric 5% sub un ciclu 12:12 h lumină:întuneric într-o instalație specifică fără agenți patogeni. Toate studiile pe animale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la școala de Medicină a Universității Wonkwang.

testul Luciferase reporter

celulele au fost transfectate tranzitoriu cu plasmidă NF-kB luciferase reporter utilizând reactivul de transfecție, Lipofectamina 2000. După 36 de ore de incubare, celulele au fost tratate cu cisplatină timp de 12 ore în prezența anticorpilor citokinici neutralizanți. Celulele au fost apoi spălate de două ori cu tampon PBS și ulterior lizate în tampon de liză reporter (Promega, Madison, WI, SUA). O alicotă de 20-unqql a lizatului a fost apoi amestecată cu 100 unqql de reactiv de testare a luciferazei, după care intensitatea luminii emise a fost măsurată folosind un luminometru AutoLumat Lb953 (de exemplu și G Berthold, Bad Wildbad, Germania). În cele din urmă, activitatea luciferazei a fost măsurată în trei exemplare, mediată și apoi normalizată în raport cu activitatea galactozidazei cu ajutorul sistemului de testare a galactozidazei (Galacto-Light, Tropix Inc., MA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului.

transfecție cu siARN constructe

sirn-uri predefinite împotriva mouse-ului STAT4, STAT6 și control scrambled siARN au fost achiziționate de la Santa Cruz Biotechnology. Firele de sens ale siRNAs împotriva STAT4 și STAT6 sunt după cum urmează. Construcția STAT4 siRNAs este un grup de trei secvențe de siRNA după cum urmează: duplex 1 Sense Strand: 5′-IndexTermGUA GCU GUG Gua AUU UCA a-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA a-3′ și Duplex 3 Sense Strand: 5′-IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU cua a-3′ (numărul de aderare la ARNm: NM_011487). Construcția stat6 siRNAs este un grup de trei secvențe de siRNA după cum urmează: duplex 1 Sense Strand: 5′-IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC a-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG a-3′ și Duplex 3 Sense Strand: 5′-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG a-3′ (numărul de aderare la ARNm: NM_009284). Celulele au fost transfectate tranzitoriu cu 100 nM de construcții siRNA în reactivul de transfecție x-tremeGENE siRNA (Roche Applied Science, Penzberg, Germania) conform protocolului producătorului. După incubare la 33 C și 5% CO2 pentru 36 h, celulele au fost tratate în continuare cu cisplatină timp de 24 h. probele au fost apoi preparate și analizate pentru viabilitate sau analiza Western blot. Interferența expresiei a fost confirmată prin analiza imunoblotului.

măsurarea citokinelor proinflamatorii de către ELISA

pentru a măsura secreția citokinelor proinflamatorii din celulele tratate cu cisplatină, supernatanții de cultură au fost recoltați la fiecare moment și nivelurile citokinelor proinflamatorii secretate au fost apoi determinate de ELISA (kituri de citokine de Quantikină; R & D Systems Inc.) conform instrucțiunilor producătorului.

prepararea extractelor citosolice și nucleare

celulele au fost spălate cu PBS la rece ca gheața, răzuite și centrifugate la 1 000% g timp de 5 min la 4% C. peleta celulară a fost apoi omogenizată în 200% de tampon de liză (HEPES 10 mM, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mm KCl, 0,5 mM fluorură de fenilmetilsulfonil, și 0,5 mm ditiotreitol) și apoi incubat pe gheață timp de 15 min. La sfârșitul incubației, s-au adăugat 10 XQL de 10% NP-40 și tubul a fost vortexat timp de 10 s. După centrifugare la 13 000 XTX g timp de 1 min la 4 xtxc, supernatantul (extractul citosolic) a fost colectat și depozitat la -80 xtxc, în timp ce peleta a fost prelucrată ulterior pentru obținerea extractelor nucleare. Peleta a fost apoi resuspendată în tampon de extracție (HEPES de 5 mM, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, fluorură de fenilmetilsulfonil de 0,5 mM, EDTA de 0,2 mM, ditiotreitol de 0,5 mM și glicerol de 25% (vol/vol)) și incubată timp de 30 min la 4 centimetric C. extractele nucleare au fost izolate prin centrifugare la 13 000 centimetric g timp de 30 min la 4 Centimetric C. Supernatantul a fost apoi îndepărtat și depozitat la -80 C până când a fost utilizat pentru analiza western blot. În cele din urmă, concentrația de proteine a fost determinată prin metoda Lowry.

analiza Western blot

analiza Western blot a fost efectuată după cum urmează. Pe scurt, celulele au fost recoltate și spălate de două ori cu PBS rece ca gheața. Lizele fracționate totale și nucleare / citosolice au fost apoi supuse electroforezei pe 12% geluri SDS-poliacrilamidă timp de 3 ore la 20 mA, după care au fost transferate în nitroceluloză. Membrana a fost apoi incubată în 5% (wt/vol) proteine din lapte uscat în PBS conținând 0,05% (vol/vol) Tween-20 (PBS-T) timp de 1 h, după care au fost spălate în PBS-T și apoi au reacționat în continuare cu anticorp primar (1:1 000) timp de 1 h. apoi, membrana a fost spălată extensiv cu PBS-T și apoi incubată cu anticorp IgG anti-iepure conjugat cu HRP (1:3 000) timp de 1 h. după spălări au fost vizualizate folosind reactivi chemiluminiscenți conform instrucțiunilor producătorului (substrat supersignal; Pierce, Rockford, IL, SUA).

experiment in vivo de ototoxicitate cisplatină

toți șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri de câte șase șoareci fiecare. Animalele din grupa 1, care au fost considerate un grup de control, au primit Injecție intraperitoneală de PBS. Animalelor din grupul 2 li s-a administrat cisplatină (4 mg/kg greutate corporală) prin injecție intraperitoneală timp de 4 zile consecutive. Animalele au fost apoi ucise sub anestezie folosind gaz CO2 în ziua următoare injectării finale a cisplatinei, după care osul temporal al urechii drepte a fost îndepărtat.

măsurarea ABR

pentru o analiză suplimentară a pragului auditiv, ABR a fost măsurată înainte și 24 de ore după tratamentul final al cisplatinei. Modificările pragului ABR între pre-tratament și post-tratament au fost apoi comparate. Șoarecii au fost anesteziați folosind un cocktail de ketamină (40 mg/kg) și xilazină (10 mg/kg) și s-au menținut la cald cu un tampon de încălzire în timpul înregistrării ABR. Un electrod de ac subdermic (activ) a fost introdus la vârf, în timp ce electrozii de sol și de referință au fost introduși subdermal în pielea liberă de sub vârfurile urechilor opuse. Stimulii de testare au constat în explozii de ton de fază alternante la frecvențe de 4, 8, 16 și 32 kHz. Semnalele au fost generate folosind Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, SUA) SigGen software. Fiecare explozie de ton (durata de 1 ms) a fost închisă printr-o fereastră Blackmann și a avut un timp de creștere-cădere de 0,5 ms fără platou. Stimulii au fost calibrați înainte de fiecare sesiune de testare, prin înregistrarea ieșirii difuzorului cu un microfon plasat la nivelul capului animalelor. Formele de undă ABR au fost medii ca răspuns la 300 de explozii de ton la fiecare frecvență testată. La fiecare frecvență, amplitudinea semnalului a fost atenuată automat în pași de 10 dB de la 90 dB SPL până când undele ABR au dispărut în urme înregistrate cu setări de filtrare de 100-3 000 Hz. Judecata pragului a fost făcută off-line de doi observatori independenți, orbi experimental, pe baza înregistrărilor ABR.

pregătirea suprafeței organului Corti explants

toți șoarecii au fost uciși în ziua următoare injectării finale a cisplatinei. Osul temporal a fost disecat și fixat în paraformaldehidă 4% Timp de 16 ore la 4 centimetric C și clătit cu 0,1 m PBS. Osul temporal a fost decalcificat în continuare cu 10% EDTA în PBS timp de 3 zile. Cohleea a fost disecată cu atenție. Apoi, stria vascularis și ligamentul spiralat au fost disecate, lăsând organul lui Corti. Rândul mijlociu al cohleei a fost scufundat în faloidină marcată cu TRITC (Sigma P1951, 1:100) în PBS timp de 20 de minute. După trei spălări cu PBS, specimenul a fost examinat sub microscop fluorescent folosind filtre adecvate pentru TRITC (excitație: 510-550 nm, emisie: 590 nm).

colorare imunohistochimică și Test TUNEL

osul temporal îndepărtat a fost fixat în paraformaldehidă 4% Timp de 16 ore și apoi decalcificat cu EDTA 10% în PBS timp de 2 săptămâni, după care a fost deshidratat și încorporat în ceară de parafină. Secțiunile de 5 centimm au fost deparaffinizate în xilen și rehidratate prin concentrații gradate de etanol. Pentru studiul imunohistochimiei, a fost utilizat un kit de imunohistochimie (DAKO Lsab Universal K680, Carpinteria, CA, SUA) și procedurile au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului. Peroxidaza endogenă a fost apoi blocată cu 3% peroxid de hidrogen timp de 5 minute la temperatura camerei (RT). După ce secțiunile au fost spălate în PBS, legarea nespecifică a fost blocată cu 1% albumină serică bovină timp de 1 oră. anticorpii primari (diluați 1:200) au fost apoi adăugați la diapozitive, după care incubarea a continuat timp de 1 oră. după spălări repetate cu PBS, secțiunile au fost incubate cu anticorp secundar biotinilat timp de 30 min și apoi acoperite timp de 30 min cu un anticorp secundar care conține peroxidază de hrean. În cele din urmă, secțiunile au fost colorate într-o soluție de substrat proaspăt preparată (3 mg de 3-amino-9-etilcarbazol în 10 ml tampon de acetat de sodiu (pH 4,9), 500 inqql de dimetilformamidă, 0,03% peroxid de hidrogen) timp de 5 min. Nucleele celulelor imuno-colorate au fost apoi contracarate cu Hematoxilina lui Mayer (Sigma-Aldrich Co.). Celulele apoptotice au fost detectate in situ utilizând testul TUNEL (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Germania). Pe scurt, o secțiune a fost deparafinizată și rehidratată. După incubarea cu proteinază K de 20%/ml (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germania), peroxidaza endogenă a fost blocată prin incubarea probelor în 2% H2O2 în metanol timp de 30 min la RT. în continuare, secțiunile de țesut au fost spălate în PBS și incubate cu soluție de etichetare timp de 1 h la 37 CTC. nucleele au fost apoi contracarate cu iodură de propidiu (0,5%/ml, sonde moleculare) timp de 10 min la RT.după spălări cu PBS, specimenul a fost examinat microscop fluorescent.

amplificare reverstranscriptază-PCR

pentru PCR cohlear, osul temporal al urechii stângi a fost rapid recoltat și scufundat în RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, Statele Unite ale Americii) până la utilizarea la -20 C. Apoi, cohlee întregi au fost disecate și utilizate pentru a extrage ARN total prin utilizarea Trizolului (Invitrogen) în conformitate cu protocoalele producătorului. După extragerea ARN-ului total folosind Trizol (Invitrogen), ADNc monocatenar a fost sintetizat din ARN-ul total. În continuare, PCR cu ADN polimerază Taq (Takara, Takara Shuzo, Japonia) a fost efectuat prin supunerea probelor la 30 de cicluri de 95 C pentru 40 s, 58 C pentru 40 S și 72 C pentru 50 s. zece microlitri ai produselor PCR au fost apoi separați pe 1,2% gel de agaroză și vizualizați sub lumină UV. Secvențele primerilor utilizați pentru amplificarea PCR au fost următoarele: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, invers, 5 ‘- IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3’).

analiză statistică

fiecare experiment a fost efectuat de cel puțin trei ori, iar toate valorile raportate reprezintă media SD a analizelor triplicate. Analiza statistică multivariată a fost realizată prin analiza varianței și a testelor Duncan, utilizând software-ul statistic SPSS 11 (Chicago, IL, SUA). ANOVA bidirecțională și / sau ANOVA unidirecțională au fost utilizate pentru a determina semnificația rezultatelor. Rezultatele statistice au fost revizuite de un biostatistician la nivel de masterat. Valorile lui P < 0.05 au fost considerate semnificative statistic.