1.4.1 mediu de omogenizare
cell disruption este de obicei efectuat fie într-un mediu ușor hipo-osmotic, fie într-un mediu izo-osmotic pentru a păstra integritatea morfologică. Sucroza este frecvent utilizată ca osmotic pentru a preveni organele subcelulare sau veziculele de la umflarea sau contracția adversă. Manitolul și sorbitolul au fost, de asemenea, utilizate atunci când s-a constatat că zaharoza interferează cu analiza biochimică a componentei subcelulare. Sucroza este preferată soluțiilor de sare, deoarece acestea din urmă tind să agregeze organele subcelulare. Mediile hipo-osmotice sunt adesea utilizate în izolarea fracțiunilor membranei plasmatice, deoarece în aceste condiții, celulele perturbate produc membrane plasmatice sub formă de fantome sau foi mari. Acest lucru reduce semnificativ gradul ridicat de variație a dimensiunii acestor fragmente înainte de centrifugare. Deși mediul de omogenizare este de obicei de natură apoasă, mediile neapoase, cum ar fi eterul/cloroformul, au fost utilizate pentru a izola organele subcelulare. Cu toate acestea, mediile neapoase pot inactiva unele enzime și pot reduce integritatea morfologică a unor țesuturi.
agenții chelatori (EDTA sau EGTA) pot fi adăugați la mediul de omogenizare pentru a îndepărta cationii bivalenți, cum ar fi Mg2+ sau Ca2+, care sunt necesari de proteazele membranare. Este important de reținut că inhibitorii de protează trebuie totuși incluși în mediu, deoarece reactivii EDTA și tiol pot activa unele enzime proteolitice. Cu toate acestea, multe enzime marker de membrană necesită acești cationi pentru activitate și pot fi inhibate după ce cationii au fost îndepărtați din extract. Adăugarea de Mg2 + sau Ca2 + la mediul de omogenizare menține integritatea nucleară. Cu toate acestea, acești ioni pot provoca agregarea membranei și pot reduce controlul respirator în mitocondrii.
perturbarea celulară a țesutului vegetal eliberează adesea fenoli care pot avea mai multe efecte dăunătoare asupra enzimelor plantelor. Compușii fenolici din plante cuprind în esență două grupe: compuși fenilpropanoizi (de exemplu, taninuri hidrolizabile) și flavonoide (de exemplu, taninuri condensate). Fenolii se pot lega de hidrogen cu legături peptidice de proteine sau pot suferi oxidare prin fenol oxidază la chinone. Chinonele sunt agenți oxidanți puternici care tind, de asemenea, să polimerizeze și să se condenseze cu grupuri reactive de proteine pentru a forma un pigment întunecat numit melanină care formează baza rumenirii țesutului vegetal. Atașarea melaninei la proteine poate inactiva multe enzime. Grupările hidroxil fenolice pot forma interacțiuni ionice cu aminoacizii bazici ai proteinelor sau interacționează hidrofob cu regiunile hidrofobe ale proteinelor. Prin urmare, este important să eliminați compușii fenolici cât mai repede posibil și acest lucru se realizează cel mai bine prin utilizarea adsorbanților care se leagă de fenoli sau chinone sau prin utilizarea agenților de protecție precum Borat, germanat, sulfiți și mercaptobenzotiazol care inhibă activitatea fenol oxidazei. În mediul de izolare se poate adăuga adsorbantul fenol, polivinilpirolidona, fie sub formă solubilă în apă, fie ca produs insolubil foarte reticulat Policlar. Polivinilpirolidona leagă acei compuși fenolici care formează legături puternice de hidrogen cu proteinele. S-a raportat, de asemenea, că albumina serică bovină reacționează cu fenolii din plante și este, de asemenea, un agent eficient de eliminare a chinonei.
fracționarea celulară sau tisulară se efectuează invariabil la +4 CTC pentru a reduce activitatea proteazelor membranare. Proteazele pot fi împărțite în endopeptidaze și exopeptidaze. Endopeptidazele, care sunt enzime care scindează legăturile peptidice interne, includ: proteaze acide care au un pH optim de pH 2,5–3,8 și pot fi inhibate de inhibitorul stării de tranziție pepstatin; serin proteaze care pot fi inhibate de diizopropilfluorofosfat și fenilmetilsulfonilfluorură; și sulfhidril proteaze care sunt inhibate de N-etilmaleimidă sau E-64 (l-trans-epoxisuccinil-leucilamidă-Butan). Exemple de exopeptidaze includ carboxipeptidazele care sunt prezente în majoritatea țesuturilor plantelor și hidrolizează cu ușurință majoritatea aminoacizilor c-terminali. Toate carboxipeptidazele vegetale studiate până în prezent sunt inhibate de diizopropilfluorofosfat. Aminopeptidazele, dipeptidazele și tripeptidazele au fost, de asemenea, identificate la plante. Alți compuși utilizați în mediile de omogenizare includ agenți de reducere a disulfurilor, cum ar fi 2-mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol, glutation redus sau cisteină. Acest lucru se datorează faptului că multe enzime conțin un situs activ esențial sulfhidril grupare care trebuie să rămână redusă pentru a menține activitatea enzimei. Multe dintre problemele de izolare organelle sunt asociate cu ruperea membranelor fragile, de exemplu tonoplastul care înconjoară vacuolul. În afară de distrugerea fizică a acestor membrane, țesuturile vegetale conțin enzime lipolitice active care pot ataca direct componentele lipidice ale membranelor și pot perturba organele. Acizii grași liberi eliberați prin acțiunea hidrolitică a acil hidrolazelor pot inhiba activitățile ATPazei mitocondriilor, cloroplastului și membranei plasmatice. Alte efecte dăunătoare ale acizilor grași sunt, de asemenea, bine stabilite. Există anumite condiții care pot reduce descompunerea lipidelor prin lipaze și lipolitice acil hidrolaze în plante. Acestea includ utilizarea (1) unui mediu de izolare cu un pH de 7.5-8 la care majoritatea enzimelor lipolitice și lipooxigenazelor prezintă o activitate redusă, (2) agenți chelatori, cum ar fi EDTA, deoarece multe fosfolipaze sunt dependente de Ca2+; cu toate acestea, multe enzime lipolitice nu sunt afectate de agenții chelatori și (3) alți aditivi, cum ar fi antioxidanții, pentru a preveni descompunerea oxidativă a hidroperoxizilor de acizi grași, a agenților de reducere a disulfurilor, a inhibitorilor enzimatici specifici și utilizarea albuminei serice bovine fără acizi grași care leagă acizii grași liberi. Fiecare mediu de omogenizare individual este diferit și poate conține inhibitori specifici pentru enzime precum fosfolipaze sau phos-phataze. Glicerolul, de exemplu, este adesea adăugat la mediul de izolare pentru a inhiba fosfataza acidului fosfatidic. Etanolamina și clorura de colină sunt utilizate în mod obișnuit pentru a inhiba fosfolipaza D.
capacitatea de tamponare a mediului de omogenizare pentru fracționarea celulelor vegetale trebuie să fie ridicată pentru a compensa eliberarea acizilor organici de vacuolul perturbat care constituie un volum substanțial al celulei. Mediul de omogenizare poate fi formulat fie prin evaluare empirică, fie prin analiză rațională. De exemplu, pentru a se asigura că proteina purificată relevantă rămâne intactă, toți inhibitorii majori ai proteazelor pot fi adăugați la mediul de omogenizare sau, alternativ, pot fi copiate soluții fiziologice. Deoarece pH-ul citoplasmatic al celulei vegetale este în jur de 7,5-8,0, mediul de omogenizare ar trebui să reflecte starea fiziologică a celulei și, prin urmare, este slab tamponat la pH-ul citoplasmatic.