ascuns la vedere–Cloroflexi de apă dulce planctonice foarte abundente și diverse

Abundența și diversitatea Filului Cloroflexi în medii de apă dulce

bazat pe 16S rRNA citit abundențe din 117 metagenomi din lacuri, rezervoare și râuri, reprezentanții filului Cloroflexi au cuprins până la 7% comunitate procariotă în epilimnion (fig. 1a, b), cu toate acestea, cu fluctuații mari. Similar observațiilor anterioare, linia CL500-11 a dominat probele de hipolimnion (ajungând la cel puțin 16% în toate probele, cu excepția unui singur eșantion, și aproape 27% într-o probă din Lacul Biwa) (Fig. 1c), în afară de un grup mai puțin cunoscut denumit cluster TK10. Majoritatea secvențelor ARNr 16S legate de TK10 din Baza de date SILVA provin din sol, piele umană sau probe metagenomice necunoscute, în timp ce doar patru (1,5%) provin din apele dulci (fișier suplimentar 1: Figura s1a).

în mod surprinzător, probele de epilimnion au fost dominate de secvențe afiliate „SL56 marine group” (până la cca. 5% din totalul comunității procariote). Secvențele de SILVA legate de SL56 au fost recuperate dintr-un lac de apă dulce și din seturile de date Global Ocean Series (GOS) . Cu toate acestea, eșantionul GOS din care au fost descrise este de fapt un set de date de apă dulce, Lacul Gatun (Panama). Este destul de evident din rezultatele noastre (Fig. 1; fișier suplimentar 1: Figura S2) că acest grup se găsește în mod constant numai în lacuri, rezervoare și râuri, dar nu și în habitatul marin, sugerând că a fost denumit în mod incorect „grup marin.”Un alt grup de secvențe, denumit JG30-KF-CM66, descris din medii diverse (grămada de deșeuri miniere de uraniu, sol, apă dulce, coloană de apă marină și sedimente), s-a dovedit a fi distribuit preferențial în râuri (în special râul Amazon) decât lacuri (Fig. 1a, b), deși la abundențe foarte scăzute (maximum 1% din totalul procariotelor). Abundențe similare au fost găsite în Marea Caspică sălbatică (adâncimi 40 m și 150 m) (fișier suplimentar 1: Figura s2).

cu toate acestea, nu am putut găsi niciun suport pentru prezența clusterului SAR202 sau a surorii sale de apă dulce clade CL500-9 în toate seturile de date metagenomice de apă dulce examinate. În habitatele marine și salmastre, SAR202 se găsesc aproape exclusiv în straturile afotice întunecate, unde reprezintă până la 30% din comunitatea procariotă . Dacă există clade legate de SAR202 în habitatele de apă dulce, acestea nu sunt cu siguranță foarte abundente sau poate nu provin din coloana de apă din raportul original (fișier suplimentar 1: Figura S1). În general, chiar dacă abundențele relative de Cloroflexi în epilimnia de apă dulce sunt mult mai mici decât în apele mai adânci, ele găzduiesc o colecție bogată și răspândită de grupuri noi.

cu aceste observații, este, de asemenea, evident că în mediile acvatice examinate aici (Apă Dulce, salmastră și marină), diversitatea Reprezentanților Cloroflexi este substanțial diferită, mediile de apă dulce adăpostind un sortiment filogenetic mai divers de grupuri decât cele salmastre sau marine. În plus, există dovezi clare pentru prezența grupurilor numai de apă dulce (de ex., SL56) și grupuri numai marine și salmastre (SAR202), reiterând faptul că salinitatea este o barieră în calea tranzițiilor habitatelor microbiene între ecosistemele de apă dulce și marine . Nu este în niciun caz o barieră insurmontabilă, deoarece tranzițiile relativ recente de la apa dulce la cea marină (de exemplu, apa dulce „Ca. Methylopumilus spp.”și marine OM43 ) și în sens invers (pelagibacter marin și ld12 de apă dulce) au fost propuse ambele. Cu toate acestea, este probabil ca grupurile găsite în medii salmastre să fie pur și simplu mai bine „amorsate” pentru incursiuni mai reușite. Găsim Exemple de grupuri care sunt prezente în metagenomii de apă dulce și salmastră (JG30-KF-CM66 și CL500-11).

principalii reprezentanți ai cloroflexiei de apă dulce

binning-ul automat al contigurilor legate de Cloroflexi din ansambluri din fiecare 57 de seturi de date aparținând a 14 medii diferite (28 lacuri/rezervoare, 26 râuri și 3 seturi de date salmastre) a dus la segregarea a 102 Magi (genomi asamblați cu metagenom) în total (fișier suplimentar 2: Tabelul S1). Analiza filogenomică a MAGs cu completitudine 30% sau mai mare (n = 53) arată că o diversitate remarcabil de mare de MAGs a fost recuperată din practic toate clasele cunoscute de Cloroflexi (Fig. 2). Treizeci și cinci de MAGs au constituit trei noi linii separate la nivel de clasă, fără reprezentanți culturali disponibili (SL56, TK10 și JG30-KF-CM66).

în timp ce hibridizarea fluorescenței in situ urmată de depunerea reporter catalizată (CARD-FISH) a detectat un număr mare de celule CL500-11 în epilimnionul lacului Zurich în timpul mixisului parțial în timpul iernii, nivelurile maxime de abundență au fost întotdeauna găsite în zonele mai adânci, atât în Lacul Zurich (până la 11% din toate procariotele; Fig. 3a) și Lacul Biwa (până la 14%; Fig. 3d). Abundența CL500-11 S-a corelat negativ atât cu temperatura, cât și cu concentrația de clorofilă a (fișier suplimentar 1: Figura S3). Cu toate acestea, în eșantioanele de rezervor de la Centimov, CL500-11 a fost sub limita de detecție (< 0,18%), sugerând că acest habitat relativ superficial (adâncimea maximă 43 m) nu reprezintă o nișă preferată pentru acest grup de bacterii (fișier suplimentar 1: Figura S4). Celulele CL500 – 11 au fost vizualizate anterior de card-FISH și s-au dovedit a fi celule mari, curbate . Forme și mărimi similare s–au observat la probele de pește din Lacul Zurich cu lungimi medii de 0,92 mm (interval 0,4–1,6 mm; n = 277) și lățimi de 0,28 mm (interval 0,19-0,39 mm). Analiza volumelor celulare (mediana 0.06 mm3) și Biomasă pentru acest cluster în comparație cu toate procariotele (Fig. 3C) sugerează o contribuție extrem de mare a populației CL500-11 la biomasa microbiană totală. Raportul lor biomasă / abundență este de aproape 2, adică la 10% abundență ele cuprind aproape 20% din totalul biomasei procariote, indicând o adaptare remarcabilă la hipolimnionul profund relativ oligotrof, atingând populații mari chiar și cu dimensiunile mari ale celulelor.

am recuperat 11 MAGs (10 ape dulci, 1 salmastră) pentru CL500-11 în total. Toate cele patru Magi ale lacului Biwa din diferite luni formează o singură specie. Cu toate acestea, cele două specii din Lacul Zurich par să coexiste pe tot parcursul anului (martie, mai și noiembrie), o specie ramificându-se împreună cu MAG-ul descris anterior din Lacul Michigan (CL500-11-LM), iar celelalte specii având reprezentanți apropiați și în Marea Caspică sălbatică (> 95% ANI) și modele similare de recrutare a fragmentelor metagenomice (Fig. 2 și 4c). Propunem genul candidat Profundisolitarius (Pro.fun.di.so.li.ta’ri.us. L. adj. profund; L. adj.solitarius singur; N. L. masc. n. Profundisolitarius un singur pustnic din adânc) în cadrul Candidatus Profundisolitariaceae fam. nov. pentru cluster CL500 – 11 (Clasa Anaerolinea).

pe de altă parte, grupul SL56 este descendența dominantă în rezervorul de la Centimov (maxim 1.1%), atât prin analiza ARNr 16S, cât și prin analiza CARD-FISH (Fig. 1 și 3). Abundențele maxime au fost aproape întotdeauna găsite la aproximativ 5-20 m la temperaturi de cca. 15 C, sugerând că acest grup este în primul rând epilimnetic (fișier suplimentar 1: figurile S3 și S4). Această regiune a coloanei de apă (termoclină), pe lângă faptul că are un gradient de temperatură, are, de asemenea, o intensitate a luminii semnificativ mai mică în comparație cu straturile de suprafață. Abundențele de vârf ale cyanobacterium planctothrix rubescens adaptate la lumină scăzută la aproximativ 13 m adâncime în profilurile de vară stratificate ale lacului Zurich coincid cu abundențele maxime ale SL56 (fișier suplimentar 1: Figura S3). Celulele SL56 sunt în formă de tijă și alungite (lungimea medie = 0,68 0,25 0,25 0,25 0,35 0,09 0,09, n = 6; Fig. 3e). Din câte știm, acesta este primul raport al unui grup de cloroflexi specific apei dulci care pare să prospere în epilimnion.

un total de 14 MAGs au fost recuperate pentru clusterul SL56 (1 conținând ARNr 16S) și formează o descendență la nivel de clasă, considerabil divergentă față de toate Cloroflexiile cunoscute (Fig. 2). Singura lor rudă este un singur MAG (Cloroflexi CSP1-4) descris din sedimentul acvifer . Clada 16S rRNA la care CSP1-4 se afiliază este gitt-GS-136 , iar majoritatea secvențelor din această cladă provin fie din sol, fie din sedimente fluviale (informații din taxonomia SILVA). Cu toate acestea, nu am putut detecta nicio secvență ARNr 16S (parțială sau completă) în secvența genomului disponibilă a CSP1-4. Următoarea cladă cea mai apropiată (în taxonomia rRNA 16S) de Gitt-GS-136 și SL56 este KD4-96, ale cărei secvențe au fost obținute din aceleași habitate (Vezi fișierul suplimentar 1: Figura S1B). În plus, toate secvențele 16S rRNA cunoscute din grupul SL56 provin numai din apele dulci (Lacul Gatun, Lacul Zurich etc.). Luate împreună, se pare că cele mai apropiate rude filogenetice ale liniei sl56 de apă dulce locuiesc în habitatele solului sau sedimentelor.

Mags SL56 au fost reconstruite din locații îndepărtate geografic (Europa, America de Nord și de Sud, Fig. 2) și au putut fi detectate cel puțin nouă specii diferite (ANI, Fig. 1). Nu s-au obținut MAGs din probele Lake Biwa, dar trei secvențe 16S rRNA au fost recuperate în contiguri fără legături. MAGs reconstruite sunt distribuite la nivel global de-a lungul seturilor de date de apă dulce de la epilimnion (nici unul detectat în hipolimnion profundă) (Fig. 4 și fișier suplimentar 1: Figura S6). Niciun MAG SL56 nu a fost reconstruit din Marea Caspică și niciunul dintre genomii recuperați nu a fost recrutat din metagenomi sălbatici. Propunem genul candidat Limnocylindrus (Lim. no. CY. lin ‘ Drus.Gr. fem. n. limne un lac; L. masc. n. cylindrus un cilindru; N. L. masc. n. Limnocylindrus un cilindru dintr-un lac) în cadrul limnocylindraceae fam. nov., Limnocylindrales ord.nov., și Limnocylindria classis. nov. pentru clusterul Chloroflexi SL56.

secvențele ARNr TK10 16S au fost găsite la cele mai mari abundențe în probele de Hipolimnion Lake Biwa (maxim cca. 2%) (Fig. 1a, c). Celulele au fost ovoide cu o lungime estimată de 1,08 0,1 0,1 0,84 0,09 0,09 (N = 12; Fig. 3e). Un cluster coerent de nouă MAGs (trei conținând 16S rRNA fișier suplimentar 1: Figura S1) din locații îndepărtate geografic (Europa, Asia și America de Nord) a fost recuperat. Aceste organisme remarcabil de cosmopolite care înfloresc în straturile mai adânci ale lacului nu sunt foarte diverse (valori ANI > 95%). Această diversitate aparentă scăzută ar putea fi o consecință a unei nișe foarte specializate sau ceea ce este mai probabil, un rezultat al unei tranziții relativ recente la apa dulce, similar cu „Ca. Fonsibacter ” (Ld12 Alphaproteobacteria) . 16S reprezentanții ARNr au fost detectați cu încredere în metagenomii marini sau sălbatici, deși unele secvențe ARNr 16S ale bazei de date SILVA au fost obținute din sedimentele marine și coloana de apă (fișier suplimentar 1: Figura S1). Cele mai apropiate rude din ARNr 16S par a fi fie din sol, fie din probe de sedimente, sugerând că acestea ar putea fi habitatul lor original. Interesant este că clusterul TK10 este, de asemenea, ramificat adânc, numai după SL56 și CSP1-4 în arborele filogenetic al Cloroflexi în general și toți ceilalți reprezentanți ai Cloroflexi (MAGs sau izolați genomi) par a fi descendenți dintr-o ramură distinctă de ambele. Vă sugerăm genul candidat Umbricyclops (Um.bri.cy clops. L. fem. N. umbra umbra; L. masc. n. ciclopi (din Gr. Ochi rotunzi; Cyclops) a cyclops; N. L. masc. n. Umbricyclops un ochi rotund care trăiește la umbră) în cadrul Umbricyclopaceae fam. nov., Umbricyclopales ord.nov., și Umbriciclopia classis nov. pentru acest grup de organisme.

rezultatele CARD-FISH arată că celulele JG30-KF-CM66 sunt sferice, cu un diametru estimat de 0,56 milimetri (0,15 milimetri); N = 8; Fig. 3E); cu toate acestea, s-au observat proporții foarte mici (< 0,28%) pentru jg30-KF-CM66 în Lacul Zurich și profilurile de adâncime ale rezervorului de la Oktimov (fișier suplimentar 1: figurile S3 și S4). Am obținut 12 MAGs, în mare parte din coloana de apă adâncă (opt salmastre, patru apă dulce), una cu o secvență aproape completă 16S, care a format o nouă linie la nivel de clasă în analiza filogenomică (Fig. 1). Cele mai apropiate rude ale acestor MAGs sunt marine SAR202 și Dehalococcoidea (Fig. 1 și fișier suplimentar 1: Figura S1). În cadrul acestui grup, se pot distinge grupuri distincte de magi sălbatici și de apă dulce. Vă sugerăm genul candidat Bathosphaera (Ba.tho.sphae ‘ ra. Gr. adj. bathos adânc; L. fem. n. sphaera o sferă; N. L. fem. n. Bathosphaera o bacterie coccoidă care trăiește în adâncime)în cadrul familiei Bathosphaeraceae. nov., Bathosphaerales ord.nov., și Bathosphaeria classis. nov. pentru clusterul Cloroflexi JG30-KF-CM66.

de asemenea, am recuperat MAGs în clasele Cloroflexia (patru MAGs) și Caldilineae (două MAGs) (Fig. 1). Cloroflexia MAGs au fost legate de mezofil Oscilochloris trichoides DG-6 în subordine Chloroflexineae (un MAG) și alte trei MAGs la Kouleothrix aurantiaca în kouleotrichaceae fam. nov. formarea unei noi subcomenzi pentru care propunem denumirea de Subcomandă Kouleothrichniae. nov. Nici unul dintre aceste MAGs arată orice recrutare fragment semnificativ în afară de locul lor de origine. Încă 14 Mag-uri de la Caspian afiliate clusterului SAR202, care nu vor fi discutate în continuare aici, așa cum au fost deja descrise .

contribuția cloroflexiei de apă dulce în funcționarea ecosistemului

perspective metabolice în Mags cloroflexi reconstruite (completitudine 30%) sugerează un stil de viață în primul rând heterotrofic care, în unele grupuri, este stimulat de generarea de energie bazată pe lumină fie prin rodopsine (CL500-11, Cloroflexale, SL56 și TK10), fie prin fototrofie anoxigenică aerobă (Cloroflexale). MAGs din fiecare grup conțin gene necesare pentru metabolismul central al carbohidraților, inclusiv glicoliza, gluconeogeneza și ciclul acidului tricarboxilic. Genele cheie pentru reducerea sulfatului asimilator (3′-fosfoadenozină 5 ‘ – fosfosulfat (PAPS) sintază și sulfat adenililtransferază) au fost absente în majoritatea MAGs sugerând utilizarea compușilor exogeni cu sulf redus . Genele de denitrificare (nitrat reductază/nitrit oxidoreductază alfa și beta subunități și nitrit reductază) au fost găsite în Tk10 MAGs, dar enzimele ulterioare responsabile de producerea azotului molecular au fost absente.

în mediile acvatice, Thaumarchaeota și cianobacteriile sunt principala sursă de cobalamină și precursorii săi corrinoizi pentru comunitatea mare de auxotrofi sau cei puțini capabili de salvare . Sinteza de novo a cobalaminei are un cost metabolic ridicat, iar ipoteza Reginei Negre a fost prezentată ca o explicație pentru motivele pentru care doar câțiva membri ai comunității își asumă producția . Niciunul dintre magii cloroflexi reconstruiți nu codifică genele necesare pentru biosinteza inelului corrin de la zero și cobalamina cu afinitate ridicată (BtuBFCD) sau alți transportori suspectați de corrinoid (DET1174-DET1176) lipseau, de asemenea, ceea ce poate fi o consecință a incompletenței genomului sau a utilizării unui transportor nedescris. Cu toate acestea, nu toate aceste organisme par a fi auxotrofe, deoarece Magii clusterului JG30-KF-CM66 codifică gene pentru calea de salvare a cobinamidei la cobalamină care utilizează corrinoizii importați împreună cu intermediari din calea biosintezei riboflavinei pentru a sintetiza cobalamina . ZH-chloro-G3 MAG conține o salvare aproape completă a cobalaminei (lipsește doar CobC) și calea de biosinteză a riboflavinei (fișier suplimentar 3: tabelul s2).

genele de asamblare flagelară au fost prezente în mai multe MAGs de clustere CL500-11 și TK10 (Fig. 1 și fișier suplimentar 3: tabelul S2). Cu toate acestea, componentele inelului L și P care ancorează flagelul la membrana exterioară lipseau în toate Magele flagelate și genomii Cloroflexi de referință (de exemplu , Termomicrobium, Sphaerobacter ). În plus, genomii MAGs și cloroflexi de referință nu au codificat gene pentru biosinteza LPS și nu au fost detectate sisteme de secreție, în afară de Sec și Tat (sistemele de secreție de tip I–IV care sunt ancorate în membrana exterioară sunt absente) (fișier suplimentar 3: tabelul s2). Luate împreună, genomica comparativă a genomilor cloroflexi disponibili susține inferențele că, în timp ce micrografele electronice sugerează două straturi dense de electroni în majoritatea membrilor acestui filum, Cloroflexi posedă probabil o singură membrană lipidică (monoderm) mai degrabă decât două (diderms) .

secvențele asemănătoare rodopsinei au fost recunoscute în 18 magi din acest studiu de la reprezentanți ai CL500-11, Cloroflexie, SL56 și TK10 care sunt filogenetic cel mai aproape de xanthorhodopsine (fișier suplimentar 1: Figura S8A și B) și sunt reglate pentru a absorbi lumina verde similară cu alte rodopsine de apă dulce și de coastă (fișier suplimentar 1: Figura S8C). Mai multe MAGs codifică gene pentru biosinteza carotenoidelor, permițând posibilitatea unei antene carotenoide care este semnul distinctiv al xanthorhodopsinelor . Dintre reziduurile implicate în legarea salinixantinei (carotenoidul predominant al salinibacter ruber), am găsit un număr surprinzător de mare conservat (10 identice din 12 în cel puțin o secvență de rodopsină) (fișier suplimentar 1: Figura S8D), sugerând că o antenă carotenoidă poate fi legată, făcând cel puțin unele dintre aceste secvențe bonafide xanthorhodopsins.

chiar și reprezentanții CL500-11 și TK10 care se găsesc în principal în hipolimnion în timpul stratificării sunt capabili de fototrofie; cu toate acestea, pot accesa potențial zona fotică în timpul iernii și la începutul primăverii mixis. În afară de fotoheterotrofia pe bază de rodopsină, am recuperat și MAGs din clasa Cloroflexie codificarea genelor pentru fotosistemul proteinele Centrului de reacție de tip II l și M (pufL și pufM), bacterioclorofilă și biosinteza carotenoidelor. Secvențele genei pufM se grupează împreună cu alte secvențe pufM legate de Cloroflexi (fișier suplimentar 1: Figura S9). Cu toate acestea, nu s-au găsit dovezi pentru fixarea carbonului, fie prin calea 3–hidroxipropionat, fie prin ciclul Calvin-Benson în orice fotosistem care poartă MAG, care ar putea fi o consecință a incompletenței MAG. De asemenea, este posibil ca acestea să fie fototrofe anoxigenice aerobe care nu fixează carbonul, de exemplu, Gemmatimonadete de apă dulce și Acidobacterii (ambele aerobe) .

istoria evolutivă a cloroflexiei pelagice

este evident din analizele filogenomice că colecția de reprezentanți ai filumului Cloroflexi recuperat în această lucrare, împreună cu secvențele genomului existente din izolate și MAGs, oferă doar o schiță parțială a istoriei evolutive complexe a filumului în general. De exemplu, cele mai divergente ramuri „Ca. Limnocilindria „(cluster SL56)și ” Ca. Umbriciclopia „(clusterul TK10) nu are practic nicio rudă apropiată în afară de un MAG de sedimente acviferice (legat de „Ca. Limnocilindria”). Cu toate acestea, clonele 16S legate de ARNr au fost recuperate din sol/sedimente pentru ambele grupuri, sugerând Tranziții către un stil de viață pelagic (fișier suplimentar 1: Figura S1B).

luarea în considerare a absenței secvențelor rRNA marine 16S conexe pentru aceste grupuri, pe lângă nedetectabilitatea lor în seturile de date metagenomice marine sugerează, de asemenea, o ascendență din sol/sediment, mai degrabă decât din mediul salin. În timp ce posibilitatea unei origini marine nu poate fi exclusă în mod formal, direcționalitatea unei tranziții de la sol/sediment la coloane de apă dulce apare cel mai probabil. Mai mult, având în vedere că ” Ca. Limnocilindria ” și ” Ca. Umbriciclopia ” diferă înainte de divergența claselor Dehalococcoidea și marine SAR202 (clasa „Ca. Monstramaria”), care sunt singurele Cloroflexi marine relevante din punct de vedere ecologic cunoscute încă (primele în sedimentele marine și cele din urmă în coloana de apă adâncă a oceanului), este probabil ca cloroflexi ancestrali să provină dintr-un habitat de sol/sediment. Succesul marin SAR202 în oceanele adânci este remarcabil; este cel mai răspândit, probabil cel mai abundent grup de Cloroflexi din punct de vedere numeric de pe planetă. Cu toate acestea, unele secvențe de ARNr 16S de la rudele sale cele mai apropiate, Dehalococcoidea, au fost, de asemenea, recuperate din sedimentele de apă dulce, chiar dacă marea majoritate par a fi din sedimente marine adânci (ambele habitate anoxice).