aplicarea sistemului Cobas 4800 pentru detectarea papilomavirusului uman cu risc ridicat la 5650 de femei asimptomatice

rezumat

testarea papilomavirusului cu risc ridicat (HR-HPV) combinată cu citologia îmbunătățește detectarea leziunilor cervicale și crește durata intervalelor de screening. Pentru un sondaj HR-HPV bazat pe populație, automatizarea testării este foarte necesară. Sistemul de testare cobas 4800 HPV este un test complet automatizat care poate detecta simultan HPV16, HPV18 și alte 12 genotipuri HR-HPV grupate. Acest sistem a fost utilizat pentru screeningul HR-HPV în mai multe țări; cu toate acestea, o astfel de aplicare la o populație mare din China nu a fost documentată. În acest studiu, am folosit sistemul de testare cobas 4800 HPV pentru a detecta HR-HPV în probele de citologie cervicală colectate de la un total de 5650 de femei asimptomatice dintr-o regiune din sudul Chinei. Am raportat următoarele: (1) prevalența celor 14 genotipuri de HR-HPV a fost de 12,96%; (2) pentru cei cu infecție HR-HPV, 2,25% au fost pozitivi pentru HPV16, 0,50% pentru HPV18, 9,15% pentru 12 tipuri HPV grupate și 1,06% pentru infecția multiplă cu HPV; și (3) nu a existat nicio diferență semnificativă în prevalența HR-HPV în rândul diferitelor grupe de vârstă. HPV16 și HPV18 s-au dovedit a fi tipurile HPV predominante găsite la pacienții cu cancer de col uterin în unele regiuni din China, indicând faptul că un test complet automatizat, cum ar fi sistemul de testare HPV Cobas 4800, este deosebit de valoros pentru screeningul HR-HPV bazat pe populație în aceste regiuni, deoarece acest test poate detecta simultan HPV16 și HPV18.

1. Introducere

papilomavirusul uman (HPV) este un virus ADN dublu catenar din familia Papilomaviridae . Există mai mult de 200 de genotipuri de HPV care au fost identificate, printre care 15 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, și 82) sunt foarte asociate cu cancerul de col uterin . Cancerul de col uterin este al patrulea cel mai frecvent cancer la femeile din întreaga lume și al șaselea cel mai frecvent cancer la femeile din China . Pentru a reduce povara cancerului de col uterin, identificarea timpurie a leziunilor cervicale care probabil progresează spre cancer invaziv este de o importanță capitală. Citologia cervicală joacă un rol important în prevenirea cancerului de col uterin . Adăugarea testării HPV la citologie are ca rezultat o detectare crescută a leziunilor cervicale de grad înalt și, prin urmare, se recomandă ca screeningul HPV cu risc ridicat (HR-HPV) să fie încorporat în citologie pentru a îmbunătăți detectarea bolii și a crește durata intervalelor de screening .

până în prezent, au fost raportate diferite metode pentru genotiparea și detectarea HPV . Pentru screeningul bazat pe populație, automatizarea testării este utilă în special, deoarece automatizarea are capacitatea de a procesa un număr mare de probe într-un timp scurt și de a reduce erorile umane care pot apărea în operațiile manuale. Sistemul de testare cobas 4800 HPV (Roche Molecular Systems Inc., Rotkreuz, Elveția), complet automatizat, este conceput pentru a detecta simultan un total de 14 tipuri HR-HPV: HPV16 individual, HPV18 individual și 12 genotipuri HR-HPV grupate(31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, și 68). Acest sistem a fost aprobat de Administrația SUA pentru alimente și medicamente pentru screeningul HR-HPV. Sistemul de testare cobas 4800 HPV este format din 2 părți, adică., un instrument Cobas x 480 care este utilizat pentru automatizarea purificării acidului nucleic și pipetarea probei PCR și un analizor Cobas z 480 care este pentru amplificarea automată a PCR în timp real și hibridizarea ulterioară specifică tipului. Deși utilizarea sistemului Cobas 4800 pentru testarea HR-HPV a fost raportată în mai multe țări , o astfel de aplicare la o populație mare din China nu a fost documentată. În acest studiu, am folosit sistemul de testare cobas 4800 HPV pentru a detecta HR-HPV în probele de citologie cervicală colectate de la un total de 5650 de femei asimptomatice.

2. Metode

acest studiu a fost aprobat de Comitetul de revizuire a cercetării medicale din Spitalul Zhongshan de Medicină Tradițională Chineză. Consimțământul informat a fost obținut de la toți participanții.

2.1. Recoltarea probelor de col uterin

femeile asimptomatice în vârstă de 20-65 de ani au fost înscrise din ianuarie 2018 până în decembrie 2018 pentru acest studiu, cu costul de testare acoperit de subiecții studiului sau de angajatorii lor sau în combinație. Criteriile de includere includ a fi de 20 de ani sau mai mult, a nu fi însărcinată, a avea uter intact, a fi activ sexual sau a avea antecedente de activitate sexuală. Toți subiecții au fost informați că nu au utilizat medicamente vaginale, contraceptive vaginale sau lubrifianți timp de 48 de ore înainte de prelevarea de probe de col uterin. Probele citologice de col uterin au fost colectate cu ajutorul dispozitivului Combi Cervex-Brush (dispozitive medicale Rovers) după cum urmează: partea de prelevare endocervicală a dispozitivului a fost introdusă în canalul endocervical pentru a permite perilor laterali să intre complet în contact cu ectocervixul, iar dispozitivul a fost apoi rotit cu două rotații complete în sensul acelor de ceasornic. După extragere, dispozitivul cu celulele recoltate a fost introdus imediat într-un flacon care conține soluție de conservant (Hologic Inc., Bedford, MA, SUA) și s-a învârtit puternic. Probele au fost utilizate pentru detectarea ADN-ului HPV, așa cum este descris mai jos.

2.2. Detectarea HR-HPV utilizând sistemul de testare HPV Cobas 4800

tampon de liză, tampon de spălare, tampon de eluție, kituri de control HPV pozitive și Negative și toți ceilalți reactivi au fost achiziționați de La Roche Molecular Systems Inc. Fiecare probă a avut un control intern, globină, pentru a monitoriza adecvarea celulelor, iar fiecare probă a inclus un set de controale HPV pozitive și Negative. Extracția și purificarea ADN-ului s-au făcut cu instrumentul Cobas x 480 conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, probele de soluție conservant au fost vortexate și plasate pe suportul de probă, iar reactivii, de exemplu, tampon de liză, tampon de spălare și tampon de eluție, au fost încărcați în suporturile rezervorului de reactiv respectiv. După încărcarea probei și a reactivului, prepararea ADN-ului a fost finalizată automat și produsele ADN finale au fost colectate într-o placă microwell. Ulterior, placa microwell care conține ADN a fost sigilată manual și încărcată pe analizorul Cobas z 480, iar amplificarea și hibridizarea au fost finalizate automat.

2.3. Analiza statistică

analiza statistică a fost efectuată utilizând SPSS 13.0 (IBM Corp., Armonk, NY, SUA). Pentru evaluarea variabilelor categorice, s-a utilizat testul de la categoria A 2-a. Toate testele statistice au fost pe 2 fețe, iar valorile mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative statistic.

3. Rezultate

un total de 5650 de femei asimptomatice în vârstă de 20-65 de ani cu vârsta medie de ani au îndeplinit cerințele studiului și au fost incluse în acest studiu. Dintre acești participanți, 732 (12,96%) au fost detectați ca HPV-HR pozitiv, inclusiv 127 (2,25%) cu infecție cu HPV16, 28 (0,50%) cu HPV18, 517 (9,15%) cu 12 tipuri HPV cumulate și 60 (1,06%) cu infecție HPV multiplă (HPV16 amestecat cu HPV18, HPV16 amestecat cu 12 tipuri 12 tipuri cumulate sau HPV16 amestecate cu hpv18 și 12 tipuri cumulate) (tabelul 1).

în funcție de vârstă, participanții au fost împărțiți în 4 grupe: 20-30, 31-40, 41-50 și >51 de ani. După cum se arată în tabelul 2, Grupul de 31-40 de ani a avut cea mai mare rată de infecție HR-HPV de 15,32% urmată de grupurile de >50 de ani, 41-50 de ani și 20-30 de ani, deși nu s-a observat nicio semnificație statistică în rândul ratelor de infecție ale acestor grupuri.

4. Discuție

în acest studiu, am folosit sistemul Cobas 4800 pentru a detecta HR-HPV la 5650 de femei asimptomatice și am constatat următoarele: (1) prevalența celor 14 genotipuri de HR-HPV a fost de 12,96%; (2) dintre cele 732 de femei HR-HPV pozitive, 2,25% au fost pozitive pentru HPV16, 0,50% pentru HPV18, 9,15% pentru 12 tipuri HPV pentru infecția multiplă cu HPV; și (3) nu a existat nicio diferență semnificativă în prevalența HR-HPV în rândul diferitelor grupe de vârstă.

atât testul HPV cu risc ridicat în timp real de la Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, IL, SUA) și sistemul de testare cobas 4800 HPV sunt validate clinic, teste PCR complet automatizate pentru detectarea HR-HPV . Un avantaj al acestor 2 teste este că pot detecta și distinge simultan HPV16 și HPV18, care este important pentru screeningul cancerului de col uterin, deoarece HPV16 și HPV18 reprezintă aproximativ 70% din cancerele de col uterin la nivel global . Puține studii au comparat aceste 2 teste în detectarea HR-HPV în probele clinice. Park și colab. a testat 365 de probe de tampon cervical și a raportat că testul HPV cu risc ridicat în timp real a prezentat o sensibilitate de 78,3% cu o specificitate de 99,2%, în timp ce sensibilitatea și specificitatea sistemului Cobas 4800 au fost de 91,7% și, respectiv, 97,0%. Cuzick și colab. a analizat 6000 de femei și a arătat că 16,0% au fost detectate ca fiind HR-HPV-pozitive de către sistemul Cobas 4800, în timp ce 13,4% au fost detectate ca fiind HR-HPV-pozitive de testul HPV cu risc ridicat în timp real . Aceste date indică faptul că sistemul Cobas 4800 are o sensibilitate mai mare la detectare.

mai multe sisteme moleculare validate clinic pentru detectarea ADN-ului HR-HPV au fost incluse de Organizația Mondială a Sănătății în 2016 în manualul integrarea testării HPV în programele de Screening pentru cancerul de col uterin-un Manual pentru managerii de programe (https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2016/manual-VPH-English—FINAL-version.pdf). Aceste teste constau în teste bazate pe hibridizare, adică tehnica Hybrid Capture 2 și testul CareHPV și teste bazate pe PCR, de ex., testul cobas HPV, testul Abbott în timp real HPV cu risc ridicat, testul CERVISTA HPV HR și testul bd HPV. Toate testele bazate pe PCR necesită izolarea ADN-ului, în timp ce testele bazate pe hibridizare nu. Dintre toate metodele, testul CERVISTA HPV HR durează 6-7 ore, iar testul Abbott realtime high Risk HPV durează 6-8 ore pentru a rula, ceea ce poate să nu îndeplinească obiectivul de „a se vedea și a trata” în aceeași zi. În schimb, toate metodele de odihnă, inclusiv sistemul Cobas 4800, necesită totuși un timp maxim de rulare de aproximativ 5 ore, potrivit pentru ca pacienții să finalizeze „vezi și tratamentul” într-o singură vizită.

la nivel global, prevalența HR-HPV variază de la un continent la altul . În China, pentru studiul prevalenței HR-HPV, au fost utilizate diferite metode . Wu și colab. s-a utilizat testul Hybrid Capture 2 (Qiagen, Hilden, Germania) pentru detectarea HR-HPV de 13 tipuri grupate (HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, și 68) într-un total de 4215 de femei în vârstă de 17-54 de ani din 5 zone geografice diferite din China și au descoperit că prevalența HR-HPV a fost de 12,4% . Folosind aceeași metodă ca Wu și colab. , Zhao și colab. am găsit că 15.2% din 1274 de femei dintr-o regiune din nordul Chinei au fost pozitive pentru HR-HPV . Chen și colab. a folosit un kit de genotipare HPV (Yaneng Biotechnology Limited corp., Shenzhen, China) pentru un total de 961.029 de teste HPV pentru femei cu vârste cuprinse între 16 și 83 de ani din sud-estul Chinei și a relevat o rată de infecție HR-HPV de 16,61%. Jing și colab. a aplicat un test spectrometric de masă pentru testarea ADN-HPV la 78.355 de femei cu vârste cuprinse între 18 și 75 de ani din China de Sud și a raportat o rată de prevalență a HR-HPV <7,3%. Aceste studii demonstrează o rată de infecție HR-HPV variind de aproximativ 10-15% la femeile din China, ceea ce este în acord cu constatarea noastră. Cu toate acestea, metoda pe care am folosit-o în studiul de față este mai simplă și mai puțin laborioasă în comparație cu cele utilizate în investigațiile anterioare .

două studii cu cea mai mare dimensiune a eșantionului efectuate în China au comparat ratele de prevalență HR-HPV în rândul grupurilor de vârstă. Zeng și colab. a analizat retrospectiv 671.163 de teste HPV efectuate folosind metoda Hybrid Capture 2 din 2007 până în 2014 și a demonstrat cea mai mare prevalență HR-HPV din 36.9% în grupa de vârstă <20 de ani, în timp ce ratele HR-HPV-pozitive pentru grupele de vârstă de 20-30, 30-40 și 40-50 de ani au fost de 24,4%, 19,7% și, respectiv, 19,9%. Testarea HR-HPV cu cea mai mare dimensiune a eșantionului (961.029 probe) efectuată de Chen și colab. din nou arată cea mai mare rată de prevalență a HR-HPV în grupa de vârstă <20 de ani (22,3%), în timp ce ratele de prevalență pentru grupele de vârstă de 20-30, 30-40 și 40-50 de ani sunt de 16,8%, 15,2% și, respectiv, 15,9%. Aceste studii relevă o rată de prevalență ușor mai mare în grupul de 20-30 de ani decât în grupurile de 30-40 și 40-50 de ani, ceea ce este în contrast cu rezultatele noastre, deoarece am observat cea mai mică prevalență HR-HPV în grupul de 20-30 de ani. Această discrepanță poate apărea din cauza următorilor factori: (1) femeile mai tinere au în prezent mai mult acces la programe de educație pentru sănătate, în special programe online care utilizează dispozitive electronice și (2) femeile mai tinere sunt mai dornice să învețe și să accepte noi cunoștințe despre salubritate și sănătatea sexuală.

HPV16 este cel mai frecvent tip de HR-HPV găsit în probele de col uterin ale femeilor din provinciile nord (Beijing și Henan, Shanxi și Xinjiang), Sud-Est (provincia Shanghai și Zhejiang) și regiunile Chinei de Sud (provincia Guangdong), cu o rată pozitivă cuprinsă între 1,5 și 3,6%, ceea ce este în concordanță cu o rată de infecție cu HPV16 de 2,25% observată la subiecții noștri de studiu care sunt din China de Sud. HPV16 este responsabil pentru aproximativ 50% din cancerul de col uterin la nivel global . În timp ce informațiile privind distribuția genotipului HR-HPV la pacienții chinezi cu cancer de col uterin sunt încă limitate, Li și colab. a raportat că 1818 din 2309 pacienți cu cancer de col uterin (78,7%) din China de Vest au fost pozitivi pentru HPV16 și aproximativ 90% dintre acești pacienți au fost pozitivi pentru HPV16 și HPV18 . O rată de infecție de 53,2% pentru HPV16 și HPV18 a fost, de asemenea, arătată la 326 de pacienți cu cancer de col uterin din provincia Fujian din sud-estul Chinei . Aceste date indică faptul că HPV16 și HPV18 sunt tipurile HPV predominante găsite la pacienții cu cancer de col uterin din aceste regiuni. Un test complet automatizat, cum ar fi sistemul de testare cobas 4800 HPV, care poate detecta și diferenția simultan HPV16 și HPV18, va fi deosebit de valoros pentru screeningul HR-HPV bazat pe populație în regiunile care au o dominanță a infecției HPV16 și HPV18.

disponibilitatea datelor

datele utilizate pentru a susține rezultatele acestui studiu sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere.

conflicte de interese

autorii declară că nu au conflicte de interese.

contribuțiile autorilor

SW, XH, QP și LZ au recrutat participanții, au colectat probe și au efectuat teste. SW și JZ au scris articolul. FM a revizuit literatura de specialitate și a efectuat analize statistice. JZ a proiectat studiul, a analizat datele și, în cele din urmă, a aprobat manuscrisul.