anticorpul scindat-Caspază-3 este un marker al activității Dronc asemănătoare caspazei-9 în Drosophila

etichetarea de către anticorpul scindat-Caspază-3 persistă în DCP-1 drice mutanți dubli

pentru a evalua specificitatea anticorpului scindat-Caspază-3 anticorpi, am analizat discurile Imaginale ale ochilor de la larvele de gradul trei. În discurile imaginale ale ochilor de tip sălbatic, anticorpul detectează câteva celule moarte împrăștiate pe disc (figura 1a). În mod surprinzător, în discurile de ochi dublu mutant pentru alelele nule dcp-1prev și drice XV1 (ref.14, 15), anticorpul scindat-Caspază-3 încă etichetează celulele (figura 1b). Etichetarea în mutanții dubli DCP-1prev drice 01 are loc în grupuri (figura 1b), similar cu ceea ce a fost observat anterior când moartea celulară a fost blocată de expresia inhibitorului caspazei-3 P35.3 Aceste observații ar sugera că anticorpul scindat-Caspază-3 detectează încă un epitop în absența proteinelor asemănătoare caspazei-3 DCP-1 și DRICE. Cu toate acestea, deoarece apoptoza în acest stadiu nu apare într-un model definit, am fost nesiguri cu privire la specificitatea acestor semnale de etichetare.

prin urmare, am folosit TRANSGENELE GMR-hid,un model apoptotic bine caracterizat, 5 pentru a examina în continuare specificitatea anticorpului scindat-Caspază-3. Prin expresia bazată pe GMR a genei Pro-apoptotice hid specific în jumătatea posterioară a ochiului în curs de dezvoltare, transgenele GMR-hid induc apoptoza în două unde distincte,așa cum se arată prin anticorpul scindat-Caspază-3 și etichetarea TUNELULUI28 (figura 1C, d). Pentru a evalua specificitatea anticorpului scindat-Caspază – 3, am examinat discurile de ochi GMR-hid care au fost dublu mutante pentru dcp-1prev și drice XV1. În concordanță cu așteptările, pierderea dcp-1prev și drice XV1 abrogă complet apoptoza TUNEL-pozitivă în discurile GMR-hid (figura 1F). În mod surprinzător, totuși, discurile de ochi DCP-1prev drice x1 mutant dublu GMR-hid au prezentat încă o imunoreactivitate puternică cu anticorp scindat-Caspază-3 (figura 1e). Astfel, anticorpul scindat-Caspază-3 nu detectează sau nu numai DRICE și/sau DCP-1. Observăm, totuși, că aspectul de etichetare al anticorpului scindat-Caspază-3 se modifică în absența DCP-1 și DRICE (comparați figura 1C și e). Semnalul de etichetare nu mai este limitat la două unde distincte (figura 1C), ci mai degrabă umple întregul compartiment posterior al discului ocular și este limitat la celulele intermatidiale (figura 1e). O modificare similară a modelului de etichetare a fost raportată pentru etichetarea anticorpilor CM1 la exprimarea inhibitorului caspazei P35.3 această modificare a modelului de etichetare este probabil din cauza faptului că celulele din discurile de ochi DCP-1prev drice xxx1 mutante duble GMR-hid nu mor (figura 1f) și, astfel, mențin epitopul detectat de anticorpul clivat-Caspază-3. Cu toate acestea, este important de menționat că această analiză demonstrează detectarea unui epitop în absența proteinelor asemănătoare caspazei-3 DCP-1 și DRICE prin anticorp scindat-Caspază-3.

imunoreactivitatea anticorpului scindat-Caspază-3 depinde de componentele APOPTOZOMALE DRONC și ARK

există două posibilități de ce anticorpul scindat-Caspază-3 etichetează celulele mutante duble DCP-1 drICE, deși nu sunt apoptotice. În primul rând, anticorpul poate să nu detecteze un epitop apoptotic; sau în al doilea rând, anticorpul poate detecta un epitop apoptotic generat în amonte sau în paralel cu DCP-1 și DRICE. Pentru a distinge între aceste posibilități, am examinat GMR-HID eye discs mutant pentru componentele APOPTOSOME DRONC și ARK, care acționează în amonte de DRICE și DCP-1. În discurile oculare GMR-hid mutante dronc și ark, atât tunelul,cât și anticorpii scindați-Caspază-3 sunt blocați (Figura 1 g,h; figura 3a, b). Aceste date confirmă faptul că anticorpul scindat-Caspază-3 detectează într-adevăr un epitop apoptotic în Drosophila. Mai mult, deoarece nu reușește să detecteze epitopul apoptotic în mutanții dronc și ark, dar nu în mutanții dubli DCP-1 drICE, este mai precis să se considere anticorpul scindat-Caspază-3 ca marker pentru activitatea DRONC, mai degrabă decât activitatea caspazei efectoare, în celulele Drosophila pe moarte.

tripeptida ETD este epitopul apoptotic detectat de anticorpul clivat-Caspază-3

epitopul detectat de anticorpul clivat-Caspază-3 depinde de activitatea DRONC. Este posibil ca anticorpul să recunoască direct dronc activat. Alternativ, este de asemenea posibil ca anticorpul scindat-Caspază-3 să detecteze un epitop generat prin scindarea unui substrat necunoscut de către dronc activ, independent de DRICE și DCP-1.

pentru a distinge între aceste două posibilități, am aliniat reziduurile de la cisteina catalitică (Cys163) la locul de clivaj la Asp175 al caspazei-3 umane (peptida Caspază-3) cu regiunile corespunzătoare ale caspazelor Drosophila (figura 2A; vezi și ref. 3). Cele mai multe reziduuri C-terminale ale peptidei Caspase-3, ETD, sunt conservate în DRICE și DCP-1 (Figura 2a). Similar cu caspaza-3,Acesta este locul de scindare pentru activarea a cel puțin DRICE, 29 și, eventual, DCP-1. Este interesant de observat că n-terminal, două treimi din peptida Caspază-3, are cea mai mare asemănare cu DRONC; șase din nouă reziduuri sunt conservate (figura 2a). Această parte a peptidei Caspase-3 este mai puțin bine conservată în drice, DCP-1 și restul Drosophila caspases. Deși scindarea între subunitățile mari și mici ale DRONC nu este necesară pentru activitatea sa,30, 31 și poate să nu apară in vivo, am luat în considerare posibilitatea ca anticorpii direcționați împotriva părții n-terminale a peptidei Caspase-3 să detecteze direct dronc activ în celulele moarte.

am folosit peptide blocante pentru a evalua ce epitopi ai peptidei Caspază-3 sunt detectați de anticorpul scindat-Caspază-3 în celulele Drosophila pe moarte. Secvențele peptidelor blocante sunt prezentate în figura 2b și subliniate în figura 2a. Peptida blocantă a (TETD) este derivată din DRICE și DCP-1,iar peptida blocantă B (CRGDEYDLG) corespunde regiunii cu cea mai mare similitudine în DRONC (figura 2A, b). Peptida C este o peptidă de control corespunzătoare reziduurilor imediat adiacente peptidei B din DRONC (figura 2A,b). Peptida D este o altă peptidă de control, care este foarte asemănătoare cu peptida a și este derivată din prodomainul DRONC în poziția 113. Dacă prodomainul DRONC este scindat în acest loc, acesta va expune ESD la capătul său C-terminal, care este foarte asemănător cu capătul C al peptidei Caspază-3 (ETD, peptida a) și poate fi, astfel, detectat de anticorpul scindat-Caspază-3.

peptidele blocante au fost amestecate cu anticorpul scindat-Caspază-3 cu 60 de minute înainte de incubare cu discurile imaginale oculare. Rezultatele experimentelor de blocare sunt rezumate în figura 2b, iar pentru peptidele a și B prezentate în figura 2c–f. Peptida a este suficientă pentru a bloca întreaga imunoreactivitate a anticorpului scindat-Caspază-3 în GMR-hid și în DCP-1 drice dublu mutant GMR-HID discuri oculare (figura 2C,d). În schimb, peptida B nu abrogă imunoreactivitatea anticorpului din aceste discuri (figura 2e,f). Peptidele de control C și D nu reușesc, de asemenea, să blocheze imunoreactivitatea scindată-Caspază-3 (figura 2b; datele nu sunt prezentate).

aceste date demonstrează că anticorpul scindat-Caspază-3 detectează în mod specific epitopul ETD în celulele apoptotice. Printre caspazele Drosophila, acest epitop este prezent doar în DRICE și DCP-1, ceea ce face foarte probabil ca anticorpul să detecteze într-adevăr aceste caspaze efectoare. În schimb, faptul că peptidele B, C și D derivate din DRONC nu reușesc să blocheze imunoreactivitatea sugerează că este puțin probabil ca anticorpul să detecteze direct dronc activ. Prin urmare, deoarece anticorpul scindat-Caspază-3 nu pierde imunoreactivitatea în mutanții dubli DCP-1 drICE (figura 1e), detectează cel puțin o altă proteină, care expune epitopul ETD într-o manieră dependentă de DRONC.

activarea DCP-1 independent de ARK restabilește imunoreactivitatea scindată-Caspază-3

analiza prezentată în Figura 2 sugerează, dar nu dovedește, că anticorpul scindat-Caspază-3 detectează într-adevăr scindat DCP-1 și DRICE. Pentru a testa în mod direct această posibilitate, am exprimat o transgenă GMR-XVN-dcp-1 în fundal mutant ark. -DCP-1 nu are prodomenul n-terminal al DCP-1. Se crede că producția de PRODOMAIN-DCP-1, epuizată, promovează cu ușurință autoprocesarea, iar expresia consecventă sub controlul GMR induce un fenotip de ablație a ochilor.32 acest fenotip de ablație oculară este cauzat de inducerea apoptozei (figura 3c,d). După cum sa menționat mai sus, clonele mutante ark în fundal GMR-hid nu reușesc să inducă apoptoza TUNEL-pozitivă (figura 3b), iar anticorpul scindat-Caspază-3 nu are nicio imunoreactivitate în clonele Ark (figura 3a) sugerând că nici DCP-1, nici DRICE, nici substraturile necunoscute DRONC nu sunt scindate în clonele mutante ark. Prin urmare, am testat dacă expresia de-DCP-1 în absența activității de APOPTOZOM, care este, în Clone ark, poate restabili scindat-Caspase-3 etichetarea anticorpilor. Comparativ cu țesutul de tip sălbatic (marcat de GFP în figura 3c,c’), numărul de celule pozitive scindate-Caspază-3 este puternic redus în clonele mutante ark (figura 3c,c’) sugerând că activarea lui XVN-DCP-1 este cel puțin parțial dependentă de apoptozom. Cu toate acestea, aproximativ 50% din clonele mutante ark (N=32) din fundalul GMR-XVN-Dcp-1 conțin celule imunoreactive scindate-Caspază-3 (săgețile din Figura 3c, c’). Acest lucru este puțin probabil să fie un artefact de etichetare, deoarece aceste celule sunt, de asemenea, TUNEL-pozitive (figura 3D, d’). Prin urmare, deoarece DRONC este inactiv în fundalul mutant ark, sugerând că semnalul de etichetare scindat-Caspază-3 nu este cauzat de substratul dronc necunoscut, această analiză demonstrează că anticorpul scindat-Caspază-3 detectează într-adevăr DCP-1 scindat. De asemenea, este posibil ca anticorpul scindat-Caspază-3 să detecteze drice scindat în acest experiment, deoarece DCP-1 poate procesa proteolitic DRICE, cel puțin in vitro.29, 32 o analiză similară cu DRICE nu a putut fi efectuată, deoarece GMR-DRICE și GMR-XVN-DRICE nu provoacă un fenotip de ablație a ochilor.32 Cu toate acestea, dacă DCP-1 scindează DRICE in vivo sau nu, având în vedere similitudinea secvenței DCP-1 și DRICE la capătul C al subunității mari și datele de blocare a peptidelor din Figura 2, Aceasta sugerează că anticorpul poate detecta, de asemenea, drice scindat.