anaerobul industrial Clostridium acetobutylicum folosește poliketide pentru a regla diferențierea celulară

tulpini bacteriene și medii

C. acetobutylicum ATCC 824 a fost cultivat într-o cameră anaerobă (produse de laborator Coy) care conține o atmosferă de 97% azot și 3% hidrogen. 2xytg medium67 conținea 16 g/l triptonă, 10 g/l extract de drojdie, 5 g/L NaCI și 10 g / L glucoză (dacă nu se specifică altfel) cu pH-ul ajustat la 5.2 pentru medii lichide și 5,8 pentru medii solide (conținând și 15 g/l agar). Mediul de creștere Clostridial (CGM)68 conținea 30 g/L glucoză (dacă nu se specifică altfel), 6,25 g/l extract de drojdie, 2,5 g/l sulfat de amoniu, 1,25 G/L Naci, 2,5 g/l asparagină, 0,95 g/l fosfat de potasiu monobazic, 0,95 g/l fosfat de potasiu dibazic, 0,5 g/l sulfat de magneziu heptahidrat, 13 mg/L sulfat de mangan heptahidrat și 13 mg/L sulfat de fier heptahidrat cu pH-ul ajustat la 6, 4. P2 medium69 conținea 80 g/L glucoză (dacă nu se specifică altfel), 1 g/l extract de drojdie, 2,2 g / l acetat de amoniu, 0.5 g / l fosfat de potasiu monobazic, 0,5 g/l sulfat de potasiu dibazic, 0,2 g/l sulfat de magneziu heptahidrat, 1 mg/l acid para-aminobenzoic, 1 mg/l clorhidrat de tiamină, 10 hectoxg/l biotină, 10 mg/l sulfat de mangan heptahidrat, 10 mg/l sulfat feros heptahidrat și 10 mg / l Naci cu pH ajustat la 6,4. Mediul bazal Clostridial (CBM) 70 conținea 10 G/L glucoză, 0,5 g/l fosfat de potasiu monobazic, 0,5 g/l fosfat de potasiu dibazic, 4 g/l triptonă, 0.2 g / l sulfat de magneziu heptahidrat, 10 mg/l sulfat de mangan heptahidrat, 10 mg/l sulfat feros heptahidrat, 1 mg/l acid para-aminobenzoic, 1 mg/l clorhidrat de tiamină și 2 nitroxg/l biotină cu pH-ul ajustat la 6,9. Pentru plăcile CGM solide, s-a adăugat 15 g / l agar. CBM-S (utilizat pentru testele de sporulare lichidă) a fost identic cu CBM, cu excepția utilizării a 50 g/L glucoză și a adăugării a 5 g/l CaCO3 chiar înainte de inocularea culturilor. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) a fost cultivat în mediul Luria-Bertani (LB) la 37 C. Pentru tulpinile adecvate de Clostridium, mediile de cultură au fost suplimentate cu eritromicină (Ery; 40%/ml pentru medii solide, 80%/mL pentru medii lichide) și/sau tiamfenicol (Th; 5%/mL pentru medii solide și lichide). Kanamicina (Kan; 60%/ml) sau cloramfenicolul (Cm; 25%/mL) au fost adăugate în mediile de cultură ale E. coli, conform indicațiilor. Tulpinile de Clostridium și E. coli au fost menținute ca stocuri de glicerol 20% v / v stocate la -80 C.

construcție plasmidă

oligonucleotide au fost furnizate prin tehnologii ADN integrate (tabelul suplimentar 5). Polimeraza de Phusion (NEB) a fost utilizată pentru toate reacțiile PCR. Pentru izolarea ADN-ului genomic din C. acetobutylicum ATCC 824, a fost utilizată o metodă de liză alcalină71. C. acetobutylicum a fost cultivat peste noapte în 2xytg mediu până la faza staționară (OD600 > 2.0), moment în care 10 mL de cultură a fost centrifugat la 3500 centimetric g timp de 15 min (Temperatura camerei). Supernatantul a fost eliminat și peleta celulară a fost omogenizată în soluție tampon SET de 5 mL (75 mM NaCI, 25 mm EDTA pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Lizozimul a fost adăugat la o concentrație finală de 2 mg/mL, iar soluția a fost amestecată ușor. Amestecul s-a incubat la 37 centi C timp de 60 min cu amestecare ușoară efectuată la fiecare 15 min. După perioada de incubație, s-au adăugat 660 unqql de tampon de liză (1 m NaOH, 10% g/v SDS), iar soluția a fost bine amestecată. S-a adăugat proteinaza K la o concentrație finală de 0,5 mg/mL, iar soluția a fost incubată la 55 CTC timp de 1 oră. după această perioadă de incubație, s-a adăugat un volum egal de fenol:cloroform (1:1), iar soluția a fost amestecată prin inversare timp de 5 min. Soluția a fost apoi centrifugată la 3500 centimetric g timp de 15 min (Temperatura camerei), iar faza apoasă superioară a fost aruncată prin pipetare. La faza organică s-a adăugat 3 m acetat de sodiu (10% v/v în soluție finală). Pentru a precipita ADN genomic, s-au adăugat 2 volume de etanol și soluția a fost amestecată. ADN-ul genomic precipitat a fost colectat folosind un cârlig de sticlă și spălat cu 70% etanol. ADN-ul spălat a fost apoi uscat peste azot gazos timp de 15 minute, resuspendat în tampon te scăzut (10 mm Tris, 0,1 mm EDTA, pH 8,0) și dizolvat prin incubare la 50 C.

pentru construirea plasmidei pKO_mazF_mod (care va servi ulterior ca șablon pentru pKO_pks), primerii pKON_Fo și pKON_Ro au fost utilizați pentru a amplifica PCR o regiune de 5,0 kb din șablonul pko_mazf15. Acest pas a fost necesar pentru a elimina o regiune 677 bp din coloana vertebrală pKO_mazF, pe care nu am putut să o amplificăm prin PCR. Produsul 5.0 kb PCR a fost purificat în gel, digerat la capetele 5′ și 3 ‘ folosind PshAI, ligat pentru a forma pKO_mazF_mod și transformat în E. coli TOP10. Clonele transformante au fost analizate prin digestia testului plasmidic purificat, iar secvențierea Sanger a fost utilizată pentru a confirma secvența clonei finale pKO_mazF_mod. Pentru construirea plasmidei pko_pks (pentru ștergerea genei pks din C. acetobutylicum), o regiune de 3,8 kb care conține colE1, repL, bgaR și mazF au fost amplificate PCR din pKO_mazF_mod folosind primeri pKO_F și pKO_R. în plus, primerii UHR_Fo și UHR_Ro și DHR_Fo și DHR_Ro au fost utilizate pentru amplificarea PCR a regiunilor de 1 kb reprezentând regiunile omoloage DHR) flancând gena PKS (ca_c3355) de la un C. acetobutylicum ATCC 824 șablon ADN genomic. Gena de rezistență la cloramfenicol/tiamfenicol și promotorul constitutiv (p ptb din C. acetobutylicum) au fost amplificate PCR din pKO_mazF_mod folosind primeri CMR_F și CMR_R (Regiunea 1.1 kb). Aceste patru produse PCR au fost ligate prin ansamblul Gibson și transformate în E. coli TOP10. Clonele transformante au fost analizate prin digestia testului plasmidic purificat, iar secvențierea Sanger a fost utilizată pentru a confirma secvența clonei finale pKO_pks. Pentru construirea plasmidei pAN315 (necesară pentru metilarea pKO_pks și pCKO_pks înainte de transformarea în C. acetobutylicum), o regiune de 6,4 kb din plasmida pAN172 a fost amplificată folosind primeri pAN1_F și pAN1_R și o regiune de 1,0 kb care conține gena de rezistență la kanamicină din vectorul pCOLA_Duet a fost amplificată folosind primeri KAN_Fo și KAN_Ro. Produsele PCR extrase din gel au fost ligate prin asamblarea Gibson și transformate în E. coli TOP10. Clonele transformante au fost analizate prin digestia testului plasmidic purificat, iar secvențierea Sanger a fost utilizată pentru a confirma secvența clonei finale pAN3. Pentru construirea plasmidei pCKO_pks (pentru exprimarea genei pks sub promotorul constitutiv al crotonazei din C. acetobutylicum), primerii CPKS_Fo și CPKS_Ro au fost utilizați pentru a amplifica PCR 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 PKS genă (CA_C3355) cu suprapuneri adecvate pentru asamblarea Gibson. Coloana vertebrală pWIS_empty vector71 (conținând promotorul crt constitutiv în amonte de site-ul de clonare multiplă) a fost amplificată PCR folosind primeri pWIS_F și pWIS_R obținând un produs de 5,0 kb. Cele două produse PCR purificate cu gel au fost ligate prin ansamblul Gibson și transformate în E. coli TOP10. Clonele transformante au fost analizate prin digestia testului plasmidic purificat, iar secvențierea Sanger a fost utilizată pentru a confirma secvența clonei finale pCKO_pks.

pentru construirea plasmidei pET24b_pks, gena 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 PKS (ca_c3355) a fost amplificată din ADN-ul genomic C. acetobutylicum folosind primeri PKS_Fo și PKS_Ro. Vectorul pET24b dublu digerat (ecori / xhoi digerat) a fost ligat cu produsul PCR PKS dublu digerat (ecori/xhoi digerat), iar produsul de ligare a fost transformat în E. coli TOP10. Clonele transformante au fost analizate prin digestia testului plasmidic purificat, iar secvențierea Sanger a fost utilizată pentru a confirma secvența clonei finale pET24b_pks.

Electro-transformarea C. acetobutylicum

înainte de transformarea în C. acetobutylicum, vectorul pko_pks a fost co-transformat cu pAN3 în E. coli TOP10 prin electroporare. Această procedură a permis metilarea pKO_pks necesară pentru depășirea sistemului nativ de modificare a restricțiilor activ în C. acetobutylicum 72. Purificarea plasmidă A E. s-a efectuat cultura lichidă coli pko_pks/pAN3, iar amestecul plasmidic rezultat a fost utilizat pentru electroporări de C. acetobutylicum folosind metoda publicată anterior72 pe care o detaliem aici. Pentru a prepara celule electrocompetente, o singură colonie de C. acetobutylicum dintr-o placă de 2xytg (mai veche de 1 săptămână) a fost șocată de căldură la 80 centimetric C timp de 10 min și utilizată pentru inocularea a 10 mL CGM. După incubarea peste noapte la 37 C și atingerea fazei exponențiale medii (OD600 0,4-0,9), s–a utilizat cultura de 6 mL pentru inocularea a 54 mL 2xytg proaspeți. Această subcultură a fost incubată la 37 CTC până la atingerea OD600 1.2 (~5 h), moment în care subcultura a fost centrifugată la 3500 XTX g timp de 20 min (4 xtxc). După îndepărtarea supernatantului, peleta celulară a fost omogenizată în 20 mL tampon de electroporare rece ca gheața (EPB; 270 mm zaharoză, 5 mM NaH2PO4, pH 7,4). Celulele omogenizate au fost centrifugate la 3500 XCT timp de 10 min (4 XCT), supernatantul a fost eliminat, iar peleta celulară a fost omogenizată în 20 mL EPB rece ca gheața. După o granulare finală prin centrifugare la 3500 XCT timp de 10 min (4 XCT), supernatantul a fost aruncat, iar peleta a fost omogenizată în 2,3 mL EPB rece ca gheața. Această omogenizare finală a fost utilizată ca stoc de celule electrocompetente. Electro-transformările au fost efectuate prin amestecarea mai întâi (peste gheață) a 500 de celule competente de unqql și ~20 de unqql de soluție de ADN plasmidic (1-5 unqqg total) care urmează să fie transformate. Amestecul a fost transferat într-o cuvă de electroporare de 0,4 cm și lăsat să se incubeze pe gheață timp de 15 minute. S-au efectuat electroporatii cu urmatorii parametri: tensiune, 2000 V; Capacitate, 25 xiff; rezistenta, infinit XIF. După electroporare, probele au fost omogenizate în 1 mL 2xYTG și transferate într-o eprubetă conținând 9 mL 2xytg. După amestecarea prin inversiune, culturile au fost lăsate să se recupereze la 37 centi C timp de 4 h. culturile de recuperare au fost centrifugate la 3500 centi g timp de 15 min (Temperatura camerei), iar supernatantul a fost aruncat. Peletul celular a fost omogenizat în 500 xilt 2xytg, iar 100 xilt a fost placat pe plăci solide 2xytg completate cu antibioticul adecvat. Placa a fost incubată la 37 de centimetrii C timp de 2-3 zile, iar coloniile transformante au fost supuse verificării PCR.

ștergerea genei pks și completarea genetică

Ko vizat al genei pks (ca_c3355) în C. acetobutylicum ATCC 824 a fost realizat folosind metoda publicată anterior15. În detaliu, 5 ectg de amestec plasmidic metilat pko_pks / pAN3 a fost transformat în C. acetobutylicum folosind metoda descrisă mai sus. În urma recuperării în mediu lichid 2xytg timp de 4 ore, peletele celulare s-au colectat prin centrifugare (3500% g, 15 min, Temperatura camerei), omogenizate în 0,5 mL lichid proaspăt 2xYTG, iar 100% din cultura celulară omogenizată s-au placat pe plăci solide 2xytg + 5%/mL Th + 40 mM XT-lactoză. În aceste condiții de placare, se așteaptă să supraviețuiască numai celulele care au suferit evenimentul de recombinare omolog dublu încrucișat dorit. Contraselecția coloanei vertebrale vectoriale este asigurată de promotorul inductibil la lactoză (p bgaL ), care conduce gena toxinei mazF pe coloana vertebrală vectorială pKO_pks. În urma acestei proceduri de placare, s-au observat aproximativ 10 colonii pe plăcile de lactoză 2xytg + 5 hectog/mL Th + 40 mM. Dintre aceste 10 colonii, patru au fost de două ori restrânse și supuse verificării PCR a coloniei. Patru seturi de grunduri au fost utilizate ca bază a verificării PCR a coloniei, așa cum este detaliat în Fig suplimentar. 2.

pentru generarea tulpinii de completare genetică pks , s-a efectuat electroporarea PKS C. acetobutylicum cu un amestec plasmidic pCKO_pks/pAN3 așa cum s-a descris mai sus. În urma electroporării și recuperării, culturile au fost placate pe medii solide de 2xytg + 5%/mL Th + 40%/ml Ery. După ce s-au odihnit de două ori pe medii solide de 2xytg + 5%/mL Th + 40%/ml Ery, coloniile potențiale care adăposteau pCKO_pks au fost analizate prin PCR colony folosind primeri pCKO_F și pCKO_R.

analiza metabolomică LC-HRMS

pentru comparațiile metabolomice nedirecționate ale tipului sălbatic și ale PKS C. acetobutylicum, coloniile unice ale fiecărei tulpini au fost șocate termic la 80 C-C timp de 10 min și utilizate pentru inocularea a 10 mL de CGM lichid (30 g/L glucoză). După incubarea peste noapte (stagnantă) până la atingerea OD600 ~1,0, aceste culturi au fost utilizate pentru inocularea a 10 mL de CGM lichid (80 g/L glucoză) cu un inocul de 10% pentru subculturare. După ~5 ore (OD600 ~1.0) de creștere stagnantă, subculturile au fost utilizate pentru inocularea fermentațiilor cu balon cvadruplicat (70 mL CGM, 80 g/L glucoză + 5 ilectl antispumant 204, inocul 3%) agitate prin bare magnetice de agitare. Carbonatul de calciu (6 g / L) a fost suplimentat la mediul de fermentare pentru tamponarea pH-ului. Toate culturile s-au efectuat la 37% C. Aproximativ 5% g/mL Th au fost incluse în toate culturile de XCT, cu excepția culturii finale de fermentare, deoarece anumite antibiotice sunt cunoscute ca perturbând fazele de fermentare ABE. Probele de bulion de fermentație (1 mL) din fiecare replică au fost prelevate în timpul fazei staționare timpurii și extrase cu 3 mL de metanol cloroform 2:1. Amestecurile au fost vortexate, separate prin centrifugare (2700 g, 10 min), iar stratul inferior bogat în cloroform a fost transferat într-un flacon de sticlă. Aceste extracte organice au fost uscate cu azot gazos, omogenizate în 100 ilftil metanol, iar 10 ilft au fost injectate pe un instrument Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass QTOF LC-MS echipat cu o coloană Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 ilft 100 mm). S-a utilizat un gradient liniar de 2-98% CH3CN (vol/vol) peste 40 min În H2O cu 0,1% acid formic (vol/vol) la un debit de 0,5 mL/min. Platforma de analiză metabolomică XCMS16 (Institutul de Cercetare Scripps) a fost utilizată pentru a compara metabolomii tulpinilor PKS de tip sălbatic și de tip XV pe baza datelor cvadruplicate LC-HRMS. Valorile maxime ale MS unice pentru PC-urile de la mie (Fig. 1a) au fost identificate folosind următorii parametri: valoarea p < 0,01, schimbarea pliului > 10,0, intensitatea maximă > 5000.

fermentații Bioreactoare

pentru a compara profilele de fermentație ABE de tip sălbatic și PKS C de la XV. fermentațiile acetobutylicum, Bioreactoare au fost efectuate în Bioreactoare dasgip (4 vase GPI 100, sistem Dasgip Bioblock) cu volume de lucru de 500 mL. Culturile de peste noapte (10 mL CGM, 30 g/L glucoză, stagnante, 34% C) inoculate cu colonii individuale șocate termic de C. acetobutylicum au fost cultivate până la atingerea OD600 ~1. S-a folosit apoi un inocul de 10% pentru a începe o subcultură (30 mL Mediu P2, 80 g/L glucoză, stagnant, 34 C), iar subcultura a fost incubată până la atingerea OD600 ~1. Subculturile de 30 mL au fost apoi transferate aseptic în Bioreactoare dasgip individuale preîncărcate cu 500 mL Mediu P2 (80 g / L glucoză, 100 Ilfov antispumant 204, 34 Ilfov c). Fermentațiile au fost lăsate să continue timp de 54 de ore cu eșantionare periodică pentru măsurători ale densității optice, analiza produsului de fermentație și cuantificarea compușilor 1, 2 și 3. Temperatura a fost menținută la 34 de centi C pe toată durata fermentației, agitarea a fost asigurată prin agitare la 200 rpm, iar pH-ul a fost menținut peste 5,0 prin adăugarea automată de 3 M NH4OH. Pentru a menține condițiile anaerobe, gazul de azot fără oxigen a fost spart la o rată de 2 sL/h pe durata fermentației. Pentru cuantificarea compușilor 1, 2 și 3, s-a amestecat 1 mL bulion de fermentație cu 3 ml acetat de etil, vortexat, separat prin centrifugare (2700 g, 10 min, Temperatura camerei) și s-a izolat stratul organic superior. Stratul organic a fost uscat prin evaporare rotativa, resuspendat in 200 ilft metanol, iar 20 ilft a fost injectat pe un instrument Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (cu DAD) echipat cu o coloana Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 ilft 100 mm). S-a utilizat un gradient liniar de 2-98% CH3CN (vol/vol) peste 40 min În H2O cu 0,1% acid formic (vol/vol) la un debit de 0,5 mL/min. Compușii 1, 2 și 3 au fost identificați prin absorbție UV (240 nm) așa cum se demonstrează în Fig. 1B și au fost cuantificate în funcție de zona de vârf integrată (absorbanță la 240 nm).

proceduri analitice de fermentare

un spectrofotometru a fost utilizat pentru a determina densitățile celulare prin măsurarea densității optice la 600 nm (OD600). Un sistem Shimadzu proeminență uflc echipat cu o coloană BIORAD AMINEX HPX-87H (300 mm 7,8 mm) a fost utilizat pentru a analiza C. bulion de fermentare acetobutylicum pentru concentrația de glucoză și produse de fermentație (acetat, butirat, lactat, acetonă, butanol și etanol). Probele de bulion de fermentație (1 mL) au fost mai întâi granulate prin centrifugare la 10.000 de grame de hectolitri timp de 3 minute, urmate de filtrarea supernatantului folosind un filtru de seringă PVDF de 0,22 microni. Probele de supernatant filtrat (20 xqql) au fost injectate în sistemul UFLC cu 0,01 N fază mobilă de acid sulfuric care curge la 0,7 mL/min, Temperatura coloanei de 35 xqqc, și au fost cromatografiate timp de 35 min. Analiții au fost detectați prin utilizarea unui detector de indice de refracție (utilizat pentru cuantificarea concentrațiilor de glucoză, acetat, lactat, butanol și etanol) și a unui detector cu matrice de diode (utilizat pentru cuantificarea concentrațiilor de butirat (208 nm) și acetonă (265 nm)).

izolarea ARN și analiza ARN-Seq

probele (10 mL) de bulion de fermentație au fost prelevate în triplicat biologic din fermentații Bioreactoare de tip sălbatic și PKS C. acetobutylicum 26 h după inoculare. Probele au fost centrifugate (4000 xtcg, 10 min, 4 xtcc), iar peletele au fost omogenizate și depozitate în Reactiv celular RNAprotect (Qiagen). ARN-ul Total a fost extras folosind un Mini Kit RNeasy (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului. Un tratament cu Dnază pe coloană a fost efectuat utilizând Dnaza I (fără Rnază) (NEB). Controlul calității ARN, construcția bibliotecii și secvențierea bibliotecii au fost efectuate de laboratorul de Genomică funcțională QB3 al Universității din California-Berkeley și laboratorul de secvențiere genomică Vincent J. Coates. Calitatea și concentrația ARN-ului au fost evaluate folosind un nanochip pe un Bioanalizator Agilent 2100. ARNr bacterian 16S și 23S a fost îndepărtat folosind un kit RiboZero (Illumina). ARN-ul mesager rezultat (ARNm) a fost transformat într-o bibliotecă ARN-Seq folosind un kit de construcție a Bibliotecii mRNA-Seq (Illumina). Secvențierea bibliotecii ARN a fost efectuată pe un Illumina HiSeq4000 cu citiri cu un singur capăt de 50 bp. Secvențierea citește (50 bp ) au fost procesate și mapate la C. acetobutylicum ATCC 824 genomului (NCBI aderare NC_003030.1 și NC_001988.2) folosind CLC Genomics Workbench 9.0 cu parametrii implicite. Citirile care nu s-au aliniat în mod unic la genom au fost aruncate. Diferențele de exprimare a genelor între tipul sălbatic și PKS C. acetobutylicum au fost calculate utilizând același software. Genele au fost considerate diferențiate exprimate cu valoarea p < 0,003 (pe baza unui test t nepereche, n = 3) și |modificare normalizată a pliului |> 2,0. Corecțiile ratei de descoperire False la valorile p au fost calculate în CLC Genomics Workbench 9.0 folosind o metodă publicată73. Rezultatele analizei ARN-Seq sunt prezentate în date suplimentare 1. Analiza ȘIRULUI30 a fost efectuată pentru a determina interacțiunile proteine–proteine presupuse între genele exprimate diferențiat dezvăluite prin analiza ARN-Seq.

testele de comparare a fenotipului

testele de sporulare lichidă au fost efectuate cu modificări minore74. Probele au fost prelevate din culturi biologice lichide triplicate după 5 zile de incubare (30 mL CBM-S, 37 C). Cele 20 de probe au fost șocate termic (80 C, 10 min), diluții (101-106) au fost depistate pe plăci 2xYTG, iar coloniile au fost enumerate după 30 h de incubare (37 C) pentru a calcula numărul de unități de formare a coloniilor rezistente la căldură (cfu/mL). Pentru completarea chimică a XCV în testul de sporulare lichidă, clostrienoza purificată (concentrație finală 3,5 xcvm) a fost suplimentată în culturile CBM-s de xcvc C. acetobutylicum la momentul inoculării. Deoarece compusul 3 a fost adăugat sub formă de soluție concentrată în metanol, volumul echivalent de metanol (60 xqql) a fost adăugat la toate celelalte culturi de testare a sporulării lichide (PKS de tip sălbatic și noncomplementat) pentru a controla acest efect.

pentru testele de sporulare solidă, a fost utilizată o metodă descrisă anterior75 cu unele modificări. În detaliu, s-au cultivat colonii individuale în medii lichide (10 ml CGM, 37 LTCC) timp de 24 h. culturile au fost diluate cu un factor de 106 și placate pe CBM solid. Eșantionarea a fost efectuată la 1, 2, 3, 4 și 6 zile după placarea inițială. Pentru prelevarea de probe, trei colonii individuale au fost combinate și omogenizate temeinic în 60 uqql de CGM lichid. 20 unqtl din amestecul de colonii omogenizate au fost apoi șocate termic (80 untc, 10 min), diluții (101-106) au fost observate pe plăci de 2xYTG, iar coloniile au fost enumerate după 30 h de incubare (37 untc) pentru a calcula numărul de unități de formare a coloniilor rezistente la căldură (cfu/colonie). Toate probele au fost efectuate ca triplicate biologice.

s-au efectuat teste de acumulare a granulozei prin colorare cu iod53. Culturile lichide de fază medie (OD600 ~0.6) (P2, 37 C) au fost placate pe un mediu solid de 2xytg cu niveluri ridicate de glucoză (50 g/L) pentru a permite producerea granulozei. Plăcile au fost incubate la 30 C timp de 4 zile, moment în care au fost colorate prin expunerea la un pat de cristale de iod timp de 10 min. Plăcile au fost apoi lăsate să se desprindă timp de 10 minute înainte de imagistică. Pentru complementarea chimică a pks-urilor de tip centimetric în testul de acumulare a granulozei, clostrienoza purificată (concentrația finală a plăcii 4.0-centimetric) a fost încorporată în plăci solide de 2xytg înainte de placarea culturii PKS de tip centimetric de tip centimetric. Deoarece clostrienoza a fost adăugată la plăcile 2xYTG sub formă de soluție concentrată în metanol (amestecată în mediul topit înainte de solidificare), volumul echivalent de metanol (6 ilqutl) a fost adăugat la toate celelalte plăci 2xytg utilizate în testele de acumulare a granulozei pentru a controla acest efect.

coloniile individuale de C. acetobutylicum cultivate pe plăci CBM timp de 48 de ore (37 CT) au fost vizualizate și imaginate folosind un microscop de disecție Leica MZ16 F echipat cu o cameră Leica DFC300 FX.

testele de împrăștiere a uleiului au fost efectuate conform descrierii anterioare76,77,78. În detaliu, un pahar de sticlă de 400 mL (Diametru interior de 7,5 cm) a fost umplut cu 300 mL apă și s-a adăugat o picătură de ulei de lampă de parafină de 10 ilqql și s-a lăsat să se răspândească într-o peliculă subțire pe suprafața apei pe o perioadă de 5 min (~25 mm în diametru). Soluțiile de surfactină, clostrienoză purificată și un tampon tampon fosfat de potasiu au fost preparate la pH-ul și concentrația indicate (preparate în tampon fosfat de potasiu de 10 mM). Aproximativ 10 unqql de probă a fost adăugat cu atenție în centrul filmului de ulei, iar efectul asupra filmului de ulei a fost observat. Se așteaptă ca probele cu activitate de surfactant să formeze zone de curățare circulare stabile în pelicula de ulei, cu o activitate de surfactant mai puternică corespunzătoare zonelor de curățare mai mari (sau dispersia completă a peliculei de ulei pentru activitate de surfactant foarte mare). Au fost efectuate teste de prăbușire a picăturii77, 79, 80. Microwell-urile circulare (Diametru interior de 8 mm) din capacul de polistiren al unei plăci de 96 microwell (12,7 8,5 cm) au fost acoperite cu un strat subțire de ulei de lampă de parafină prin adăugarea a 2,0 unqql de ulei de lampă de parafină în fiecare godeu și permițând picăturii să se răspândească uniform pe microwell pe o perioadă de 1 oră. Probele de surfactină, clostrienoză purificată și controlul fosfatului de potasiu au fost preparate ca și pentru testele de împrăștiere a uleiului. Aproximativ 5 unqq de probă a fost adăugată cu grijă în centrul microwell-ului. După 5 minute, s-a observat forma și gradul de răspândire a picăturii. În timp ce controalele tampon sunt de așteptat să formeze bile stabile pe suprafața microwell, probele care conțin surfactant sunt de așteptat să se prăbușească și să se răspândească pe suprafața microwell, cu o activitate mai puternică a surfactantului care corespunde unui grad mai mare de răspândire a picăturilor.

purificarea și analiza in vitro a proteinei PKS

pentru a purifica proteina PKS etichetată His6 pentru analiza in vitro, pET24b_pks a fost transformată în E. coli BAP1. O singură colonie a fost inoculată în 10 mL lb + 50 hectolitri/mL kanamicină (Kan) pentru creștere peste noapte la 37 centimetrii C. Aproximativ 7 mL cultură peste noapte a fost utilizată pentru inocularea a 700 mL centimetrii + 50 centimetrii/mL Kan, iar cultura a fost agitată la 240 rpm și 37 centimetrii C până la atingerea OD600 de 0,5. După înghețarea culturii timp de 10 minute, s-a adăugat izopropil tio-implic-d-galactozidă (IPTG) la o concentrație finală de 0.1 mM pentru inducerea expresiei proteice, iar cultura a fost incubată la 16% C timp de 16 ore. celulele au fost recoltate prin centrifugare (5500% g, 4% C, 20 min), omogenizate în 25 mL tampon de liză (25 mm HEPES, pH 8,0, 0,5 m Naci, 5 mM imidazol) și lizate prin omogenizare peste gheață. Resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare (17.700 xtcg, 4 xtcc, 60 min), iar la supernatant s-a adăugat rășină de agaroză Ni-NTA (cultură de 2 mL/L). Amestecul a fost nutat la 4 centimetric C timp de 1 oră, încărcat pe o coloană de curgere gravitațională, iar proteina PKS a fost eluată cu concentrații crescânde de imidazol în tamponul A (20 mm HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). Proteina PKS purificată a fost concentrată și tamponul schimbat în tampon a + 10% glicerol folosind un Concentrator Centrifugal Vivaspin. Alicote de proteine PKS purificate au fost alicotate și înghețate flash în azot lichid. Randamentul aproximativ de proteine a fost de 5 mg / L (203 kDa).

un test de încărcare PKS cu substrat marcat cu 14C conținut, într-un volum total de 15 ilqutl, 4 mm ATP, 2 mM MgCl2, 1 mm TCEP, 0.5 mM CoA, 2-14C-acid malonic (0,1 centicci), 10 centicm MatB, 17 CENTICM PKS și 50 mm HEPES, pH 8,0. După 2 ore de incubare la 25 centi c, probele au fost stinse prin adăugarea unui volum egal de 1 centi SDS tampon de probă. În urma analizei SDS-PAGE cu un gel TGX de 4-15% (criteriu), gelul a fost uscat timp de 2 ore la 50 centimetric C și expus pe un ecran cu fosfor de stocare (20 centimetric 25 cm; dinamică moleculară) timp de 5 zile. Proteina radiomarcată a fost imaginată pe un Typhoon 9400 phosphorimager (modul de stocare a fosforului, rezoluție de 50 mm; Amersham Biosciences).

pentru testele in vitro ale produsului (50 ilft) ale proteinei PKS, 8 ilft de PKS au fost incubate cu malonil-CoA (2 mM) în tampon fosfat (100 mM, pH 7,0) la temperatura camerei timp de 2 ore pentru a genera compusul 4, identificat prin comparație cu un standard chimic. NADPH (2 mM) a fost adăugat la test pentru a genera compuși 5 și 6, ambii fiind identificați prin comparație cu standardele chimice. După incubare, amestecurile de testare au fost extrase de două ori cu 100 ecql de 99% acetat de etil/1% acid acetic (v/v). Extractele organice au fost uscate și resuspendate în 100 oktil de metanol, iar 10 oktil au fost injectate pe un instrument Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (cu DAD) echipat cu o coloană Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 oktil 100 mm). S-a utilizat un gradient liniar de 2-98% CH3CN (vol/vol) peste 40 min În H2O cu 0,1% acid formic (vol/vol) la un debit de 0,5 mL/min. Analiza LC-HRMS a extraselor de testare a fost efectuată pe un instrument Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass Qtof LC-MS echipat cu o coloană Agilent Eclipse Plus C18 (4.6-100 mm) utilizând același gradient de solvent și același debit descris mai sus.

disponibilitatea datelor

ARN-seq datele generate în acest studiu au fost depozitate în ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) sub numărul de aderare e-MTAB-6019. Toate celelalte date relevante sunt disponibile de la autori la cerere.