ADN tumoral circulant

considerații pre-analitice

când sângele este colectat în tuburile EDTA și depozitat, celulele albe din sânge încep să lizeze și să elibereze ADN genomic de tip sălbatic în probă în cantități de obicei de multe ori mai mari decât ctDNA este prezent în. Acest lucru face mai dificilă detectarea mutațiilor sau a altor biomarkeri ctDNA. Utilizarea tuburilor de stabilizare celulară disponibile în comerț poate preveni sau întârzia liza celulelor albe, reducând astfel efectul de diluare al adnct. Sherwood și colab au demonstrat detectarea superioară a mutațiilor KRAS în probele potrivite colectate atât în tuburile EDTA K3, cât și în Streck BCT. Avantajele tuburilor de stabilizare celulară pot fi realizate în situația în care sângele nu poate fi transformat imediat în plasmă.

alte proceduri pot reduce, de asemenea, cantitatea de ADN de tip sălbatic „contaminant” și pot face detectarea ctDNA mai fezabilă:

• nu înghețați niciodată o probă de sânge înainte de a extrage plasma pentru analiza ctDNA
• procesați proba în plasmă în decurs de 2-4 ore (dacă este colectată în tubul EDTA)
• nu utilizați niciodată tuburi heparinizate, heparina inhibă PCR prin imitarea structurii elicoidale a ADN-ului
• efectuați o dublă etapă de centrifugare (centrifugați sângele pentru a îndepărta plasma, apoi repetați îndepărtați resturile din partea inferioară a tubului) pentru a îndepărta mai multe resturi celulare înainte de extragerea ADN-ului.
• Plasma este mai bună decât serul pentru recuperarea ctDNA

extracția ctDNAEdit

principala atracție a analizei ctDNA este că este extrasă într-o manieră neinvazivă prin colectarea sângelui. Achiziționarea de cfDNA sau ctDNA necesită de obicei colectarea a aproximativ 3 ml de sânge în tuburi acoperite cu EDTA. Utilizarea EDTA este importantă pentru a reduce coagularea sângelui. Fracțiunile plasmatice și serice ale sângelui pot fi separate printr-o etapă de centrifugare. ctDNA sau cfDNA pot fi extrase ulterior din aceste fracții. Deși serul tinde să aibă niveluri mai mari de cfDNA, acest lucru este atribuit în primul rând ADN-ului din limfocite. Nivelurile ridicate de cfdna contaminante sunt sub-optime, deoarece acest lucru poate scădea sensibilitatea detectării ctDNA. Prin urmare, majoritatea studiilor utilizează plasmă pentru izolarea ctDNA. Plasma este apoi procesată din nou prin centrifugare pentru a elimina celulele sanguine intacte reziduale. Supernatantul este utilizat pentru extracția ADN-ului, care poate fi efectuată folosind kituri disponibile în comerț.

analiza ctDNAEdit

analiza ctDNA după extracție necesită utilizarea diferitelor metode de amplificare și secvențiere. Aceste metode pot fi separate în două grupuri principale pe baza faptului dacă scopul este de a interoga toate genele într-o abordare nedirecționată sau dacă scopul este de a monitoriza genele și mutațiile specifice într-o abordare țintită.

abordări neorientate

un genom întreg sau abordări întregi de secvențiere a exomului pot fi necesare pentru a descoperi noi mutații în ADN-ul tumoral în timp ce monitorizează povara bolii sau urmărește rezistența la medicamente. Abordările neorientate sunt, de asemenea, utile în cercetare pentru a observa eterogenitatea tumorii sau pentru a descoperi noi ținte medicamentoase. Cu toate acestea, în timp ce metodele neorientate pot fi necesare în anumite aplicații, este mai scump și are o rezoluție mai mică. Acest lucru face dificilă detectarea mutațiilor rare sau în situațiile în care sunt prezente niveluri scăzute de ctDNA (cum ar fi boala reziduală minimă). Mai mult, pot exista probleme care disting ADN-ul de celulele tumorale și ADN-ul de celulele normale folosind o abordare a genomului întreg.

secvențierea genomului întreg sau a exomului utilizează de obicei tehnologii de secvențiere a ADN-ului cu randament ridicat. Limitarea secvențierii doar la întregul exom poate reduce cheltuielile și crește viteza, dar cu prețul pierderii informațiilor despre mutații în regiunile de reglementare necodificate ale ADN-ului. În timp ce simpla examinare a polimorfismelor ADN prin secvențiere nu diferențiază ADN-ul de tumoră sau de celulele normale, această problemă poate fi rezolvată prin compararea cu o probă de control a ADN-ului normal (de exemplu, ADN obținut printr-un tampon bucal.) Important, genomul întreg și secvențierea întregului exom sunt utile pentru descoperirea inițială a mutației. Aceasta oferă informații pentru utilizarea unor tehnici vizate mai sensibile, care pot fi apoi utilizate în scopuri de monitorizare a bolilor.

secvențierea întregului genom permite recuperarea proprietăților structurale ale cfDNA, dimensiunea fragmentelor și modelele lor de fragmentare. Aceste modele unice pot fi o sursă importantă de informații pentru a îmbunătăți detectarea ctDNA sau pentru a localiza țesutul de origine al acestor fragmente. Selectarea dimensiunii fragmentelor scurte (<150bp) cu metode in vitro sau in silico ar putea îmbunătăți recuperarea mutațiilor și a aberațiilor numărului de copii.

karyotyping Digital

această metodă a fost dezvoltată inițial de laboratorul lui Bert Vogelstein, Luis Diaz și Victor Velculescu de la Universitatea Johns Hopkins. Spre deosebire de cariotiparea normală în care un colorant este utilizat pentru a pata benzile cromozomiale pentru a vizualiza cromozomii, cariotiparea digitală folosește secvențe ADN de loci în întregul genom pentru a calcula variația numărului de copii. Variațiile numărului de copii sunt frecvente în cazurile de cancer și descriu situațiile în care pierderea heterozigozității unei gene poate duce la scăderea funcției datorită expresiei mai mici sau duplicării unei gene, ceea ce duce la supraexprimare.

analiza personalizată a capetelor rearanjate (PARE)Edit

după ce întregul genom este secvențiat folosind o metodă de secvențiere cu randament ridicat, cum ar fi Illumina HiSeq, PARE este aplicat datelor pentru a analiza rearanjările și translocațiile cromozomiale. Această tehnică a fost inițial concepută pentru a analiza ADN-ul tumoral solid, dar a fost modificată pentru aplicațiile ctDNA.

metilarea și Hidroximetilarea ADN-ului

marcarea epigenetică adecvată este esențială pentru expresia genică normală și funcția celulară, iar modificările aberante ale modelelor epigenetice sunt un semn distinctiv al cancerului. O stare epigenetică normală este menținută într-o celulă cel puțin parțial prin metilarea ADN-ului. Măsurarea modelelor aberante de metilare în ctDNA este posibilă datorită metilării stabile a regiunilor ADN denumite „insule CpG”. Metilarea ctDNA poate fi detectată prin tratamentul cu bisulfit. Tratamentul cu bisulfit transformă chimic citozinele nemetilate într-un uracil, lăsând în același timp citozinele metilate nemodificate. ADN-ul este ulterior secvențiat și pot fi identificate orice modificări ale modelului de metilare a ADN-ului. Hidroximetilarea ADN-ului este o marcă asociată în mod similar, care s-a dovedit a fi un marker predictiv al Condițiilor sănătoase față de cele bolnave în cfDNA, inclusiv cancerul. Măsurarea modelelor de hidroximetilare aberante în ctDNA a fost dovedită de cercetătorii de la Universitatea din Chicago (Chuan he lab) Universitatea Stanford (Quake lab) și compania Cambridge Epigenetix.

abordări Țintiteedit

într-o abordare țintită, secvențierea ctDNA poate fi direcționată către un panou genetic construit pe baza hotspot-urilor mutaționale pentru cancerul de interes. Acest lucru este deosebit de important pentru informarea tratamentului în situațiile în care mutațiile sunt identificate în țintele care pot fi administrate. Personalizarea analizei țintite a ctDNA pentru fiecare pacient este posibilă și prin combinarea biopsiilor lichide cu biopsiile tisulare primare standard. Întregul genom sau secvențierea întregului exom al biopsiei tumorale primare permite descoperirea mutațiilor genetice specifice tumorii unui pacient și poate fi utilizată pentru secvențierea ulterioară țintită a ctDNA-ului pacientului. Cea mai mare sensibilitate a detectării ctDNA se realizează prin secvențierea țintită a polimorfismelor unice nucleotidice specifice (SNP). Genele mutante frecvent, cum ar fi oncogenele, care au de obicei mutații hotspot, sunt candidați buni pentru abordări de secvențiere vizate. În schimb, majoritatea genelor supresoare tumorale au o gamă largă de posibile pierderi de mutații funcționale în întreaga genă și, ca atare, nu sunt potrivite pentru secvențierea țintită.

abordările vizate au avantajul amplificării ctDNA prin reacții în lanț ale polimerazei (PCR) sau PCR digital. Acest lucru este deosebit de important atunci când se analizează ctDNA nu numai pentru că există niveluri relativ scăzute de ADN care circulă în fluxul sanguin, ci și pentru că ctDNA reprezintă o mică parte din ADN-ul total fără celule extras. Prin urmare, amplificarea regiunilor de interes poate îmbunătăți drastic sensibilitatea detectării ctDNA. Cu toate acestea, amplificarea prin PCR poate introduce erori având în vedere rata de eroare inerentă a ADN polimerazelor. Erorile introduse în timpul secvențierii pot, de asemenea, să scadă sensibilitatea detectării mutațiilor ctDNA.

Droplet digital PCR (ddPCR)Edit

această metodă este derivată din PCR digital, numit inițial de grupul lui Bert Vogelstein de la Universitatea Johns Hopkins. Droplet digital PCR utilizează un generator de picături pentru a împărți bucăți unice de ADN în picături folosind o emulsie ulei/apă. Apoi, reacțiile individuale în lanț ale polimerazei apar în fiecare picătură folosind primeri selectați împotriva regiunilor ctDNA și continuă până la punctul final. Prezența secvențelor de interes este măsurată prin sonde fluorescente, care se leagă de regiunea amplificată. ddPCR permite o evaluare foarte cantitativă a frecvențelor alelelor și mutante în ctDNA, dar este limitată de numărul de sonde fluorescente care pot fi utilizate într-un singur test (până la 5). Sensibilitatea testului poate varia în funcție de cantitatea de ADN analizată și este de aproximativ 1 din 10.000.

margele, emulsificare, amplificare și Magnetics (BEAMing)Edit

această tehnică se bazează pe PCR digital cu picături pentru a identifica mutațiile în ctDNA folosind citometria în flux. După extragerea ctDNA din sânge, PCR se efectuează cu grunduri concepute pentru a viza regiunile de interes. Acești primeri conțin, de asemenea, secvențe ADN specifice sau etichete. ADN-ul amplificat este amestecat cu margele magnetice acoperite cu streptavidină și emulsionat în picături. Primerii biotinilați concepuți pentru a se lega de etichete sunt utilizați pentru a amplifica ADN-ul. Biotinilarea permite ADN-ului amplificat să se lege de bilele magnetice, care sunt acoperite cu streptavidină. După finalizarea PCR, margelele legate de ADN sunt separate folosind un magnet. ADN-ul de pe margele este apoi denaturat și lăsat să hibridizeze cu oligonucleotide fluorescente specifice fiecărui șablon de ADN. Complexele ADN-șirag de mărgele rezultate sunt apoi analizate folosind citometria în flux. Această tehnică este capabilă să capteze frecvențele alelelor și mutațiilor datorită cuplării cu ddPCR. Cu toate acestea, spre deosebire de ddPCR, un număr mai mare de secvențe de ADN pot fi interogate datorită flexibilității utilizării sondelor legate fluorescent. Un alt avantaj al acestui sistem este că ADN-ul izolat poate fi utilizat și pentru secvențierea în aval. Sensibilitatea este de 1,6 în 104 până la 4,3 în 105.

profilarea personalizată a cancerului prin secvențiere profundă (CAPP-Seq)Edit

această metodă a fost descrisă inițial de grupurile Ash Alizadeh și Maximilian Diehn de la Universitatea Stanford. Această tehnică utilizează sonde selector de oligonucleotide biotinilate pentru a viza secvențe de ADN relevante pentru detectarea ctDNA. Bazele de date de cancer disponibile publicului au fost utilizate pentru a construi o bibliotecă de sonde împotriva mutațiilor recurente ale cancerului prin calcularea indicelui lor de recurență. Protocolul a fost optimizat pentru nivelurile scăzute de ADN observate în colectarea ctDNA. Apoi, ADN-ul izolat suferă o secvențiere profundă pentru o sensibilitate crescută. Această tehnică permite interogarea a sute de regiuni ADN. Sensibilitatea de detectare a ctDNA a CAPP-Seq este raportată a fi de 2,5 molecule din 1.000.000.

Tagged AMplicon Deep Sequencing (TAM-Seq)Edit

tam-Seq permite secvențierea țintită a genelor întregi pentru a detecta mutații în ctDNA. Mai întâi se efectuează o etapă generală de amplificare folosind primeri care acoperă întreaga genă de interes în secțiunile 150-200bp. Apoi, un sistem microfluidic este utilizat pentru a atașa adaptoare cu un identificator unic la fiecare amplicon pentru a amplifica în continuare ADN-ul în reacții singleplex paralele. S-a demonstrat că această tehnică identifică cu succes mutațiile împrăștiate în gena supresoare a tumorii TP53 la pacienții cu cancer ovarian avansat. Sensibilitatea acestei tehnici este de 1 din 50.

Safe-Sequencing (Safe-Seq)Edit

această metodă a fost descrisă inițial de Bert Vogelstein și grupul său de la Universitatea Johns Hopkins. Safe-Seq scade rata de eroare a secvențierii masive paralele pentru a crește sensibilitatea la mutanții rari. Realizează acest lucru prin adăugarea unui identificator unic (UID) secvență la fiecare șablon ADN. ADN-ul este apoi amplificat folosind UID-urile adăugate și secvențiat. Toate moleculele de ADN cu același UID (o familie UID) ar trebui să aibă aceeași secvență ADN raportată, deoarece au fost amplificate dintr-o moleculă. Cu toate acestea, mutațiile pot fi introduse prin amplificare sau pot fi apelate atribuiri de bază incorecte în etapele de secvențiere și analiză. Prezența UID permite separarea acestor erori metodologice de mutațiile reale ale ctDNA. O mutație este considerată supermutantă dacă 95% din citirile secvențiate sunt de acord. Sensibilitatea acestei abordări este de 9 la 1 milion.

duplex sequencingEdit

această metodă este o îmbunătățire a UID-urilor unice adăugate în tehnica Safe-Seq. În secvențierea duplex, ADN-ul dublu catenar randomizat acționează ca etichete unice și sunt atașate la un distanțier invariant. Tag-uri sunt atașate la ambele capete ale unui fragment de ADN (α și β tag-uri), ceea ce duce la două template-uri unice pentru PCR – un singur fir cu o α tag-ul pe 5′ end și β tag la capătul 3′ și alte strand cu un β tag-ul pe 5′ end și un α tag la capătul 3′. Aceste fragmente de ADN sunt apoi amplificate cu primeri împotriva secvențelor Invariante ale etichetelor. ADN-ul amplificat este secvențiat și analizat. ADN-ul cu adaptoarele duplex sunt comparate și mutațiile sunt acceptate numai dacă există un consens între ambele fire. Această metodă ia în considerare atât erorile de la secvențiere, cât și erorile de la amplificarea PCR în stadiu incipient. Sensibilitatea abordării pentru descoperirea mutanților este de 1 la 10^7.

Integrated Digital error Suppression (iDES)-enhanced CAPP-SeqEdit

iDES îmbunătățește analiza CAPP-Seq a ctDNA pentru a reduce eroarea și, prin urmare, pentru a crește sensibilitatea detectării. Raportat în 2016, iDES combină CAPP-Seq cu tehnologia de secvențiere a codării de bare duplex și cu un algoritm de calcul care elimină erorile stereotipice asociate etapei de hibridizare CAPP-seq. Metoda integrează, de asemenea, secvențierea duplex acolo unde este posibil și include metode pentru o recuperare duplex mai eficientă din ADN-ul fără celule. Sensibilitatea acestei versiuni îmbunătățite a CAPP-Seq este de 4 din 100.000 de exemplare.