activarea proteazei ClpP rezultă din reorganizarea rețelelor de interacțiune electrostatică la porii de intrare

modul de legare a ACP1 la EcClpP

pentru a elucida baza structurală pentru activarea ClpP prin ACP128, structurile NmClpP și EcClpP (Fig. 1a) în complex cu analogi ACP1 au fost căutate. În timp ce o structură a NmClpP cu acp1 legat nu a fost realizată în ciuda încercărilor repetate, o structură a complexului EcClpP+ACP1-06 a fost determinată la rezoluția de 1,9 centi (Fig. 1b, c, Tabelul 1), conținând un tetradecamer în unitatea asimetrică (lanțuri A-N). Densitatea electronilor pentru reziduurile n-terminale care formează buclele axiale ale EcClpP este neclară în toate subunitățile (lanțul B), cu excepția unei singure. În structurile publicate anterior, aceste bucle axiale sunt foarte flexibile și sunt de obicei dezordonate în Cristal în absența activatorilor sau prin excludere prin ambalarea cristalului23. Densitatea electronică neechivocă a fost observată pentru o singură moleculă ACP1-06 într-un buzunar format din subunitățile D și E, prezentând două configurații diferite ale compusului (Fig. 2a, b). Ambele configurații au fost modelate în densitatea electronilor, în care prima configurație poziționează porțiunea trifluormetilpiridină a compusului într-un buzunar hidrofob (configurație în jos), în timp ce a doua îl poziționează din buzunarul hidrofob expus la solvent (configurație în sus) (Fig. 2a). Restul de 13 buzunare hidrofobe prezintă o densitate ambiguă a electronilor pentru ACP1-06. Am modelat și rafinat toate cele 14 molecule ACP1 – 06 atât în configurații în sus, cât și în jos, la o ocupare de 0,5, rezultând o densitate îmbunătățită a electronilor pentru fiecare ligand.

modurile de legare ale ACP1-06 (Fig. 2b-d) aproximează cele ale Adep observate în structurile cristaline ale diferitelor Clpp bacteriene (Fig. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Rețineți că compușii sintetizați de grupul nostru sunt numerotați ca ACP1-YY și ADEP-YY, în timp ce compușii din studiile altor grupuri sunt denumiți ca în lucrările publicate respective. Toate contactele Proteice cu ACP1-06 Sunt nepolare în natură, cu excepția a două legături electrostatice notabile care apar între (1) lanțul lateral hidroxil fenolic al Y76 și oxigenul amidic al ACP1-06 și (2) lanțul lateral guanidinil al R206 (penultimul Arg din EcClpP) și un oxigen sulfonil al ACP1-06 (Fig. 2b). Ultimele două interacțiuni sunt prezente în ambele configurații ale ACP1-06. În plus, R206 (lanțul E) este stabilizat prin legarea ionică cu E65 a unei subunități adiacente (lanțul D) (Fig. 3a, b).

în configurația în jos, trifluormetilpiridina parte a ACP1-06 ocupă o cavitate hidrofobă formată din L62, T93 și F96 (lanțul D) și Y74, Y76, I104, L203 și l128 (lanțul E) (Fig. 2b și 3b). Aceasta este aceeași cavitate ocupată de inelul reziduului exociclic Phe al diferiților analogi ADEP cocristalizați cu ClpP, cum ar fi în NmClpP+ADEP-0419 (Fig. 2e, f) sau structurile EcClpP+ADEP140 (Fig. 2c, d). În schimb, în configurația up, trifluorometilpiridina este rotită în jurul legăturii C–S și este expusă cu solvent în timp ce face contacte van der Waals cu Y74, I104, F126 și l203 (lanțul E) (Fig. 2b și 3b). Fragmentul gem-dimetil se suprapune pe inelul plat al Y74 (lanțul E), în timp ce lanțul alifatic extins care se termină cu un inel fenil Orto-clor-substituit, se află într-o canelură nepolară între două spirale din subunități adiacente (Fig. 3b). Această fisură de legare este formată din L62 (lanțul D), F63 (lanțul D), A66 (lanțul D), L37 (lanțul E), V42 (lanțul E) și porțiunea nepolară a E40 (lanțul E) (Fig. 2b și 3b).

atât în structurile legate de ACP1-06, cât și în cele legate de ADEP1 ale EcClpP, se găsește puntea de sare intrasubunitară între R36 și E40, unde coada alifatică din apropiere a ADEP1 sau inelul fenil substituit cu clor al ACP1 – 06 formează o interacțiune hidrofobă cu lanțul lateral al E40 (Fig. 3b, c). Cei doi activatori sunt stabilizați în continuare în situsul hidrofob prin două modele distincte de legături de hidrogen. În timp ce ACP1-06 este asigurat printr-o interacțiune Ionică expusă la solvent între gruparea sa sulfonil și reziduul R206 terminal C (Fig. 3B), ADEP1 este ținut în loc de două legături de hidrogen cu gruparea hidroxil a Y76 retrasă în situl hidrofob (Fig. 3c). O legătură de hidrogen mediată de solvent între E65 și gruparea carbonil a lanțului lateral n-acil Phe al ADEP1 consolidează și mai mult interacțiunea sa cu EcClpP (Fig. 3c). Această legătură suplimentară de hidrogen, precum și dimensiunea mai mare a inelului depsipeptidic ciclic, care are mai multă suprafață cu care se formează interacțiuni van der Waals în comparație cu grupul trifluormetilpiridină mai mic al ACP1, poate reprezenta legarea în general mai strânsă observată pentru Adep decât ACP1s28.

în structura EcClpP + ACP1-06, am găsit o densitate electronică inexplicabilă în toate cele 14 subunități care se extind din reziduul nucleofil S111 al triadei catalitice, sugerând o modificare covalentă (Fig suplimentar. 1a, b). Densitatea se extinde la unghiuri aproximativ drepte în direcții opuse, departe de lanțurile laterale S111. În ciuda eforturilor extinse, nu a putut fi echipat în mod convingător cu peptide, produse de acilcetonă sau diverse molecule cunoscute de inhibitor de serină protează.

modul de legare al ADEP la NmClpP

NmClpP are o secvență pro mai scurtă la capătul N, în timp ce are patru reziduuri suplimentare la capătul C comparativ cu EcClpP (Fig. 1a). Deși NmClpP a fost exprimată ca o proteină de lungime întreagă care poartă un N-terminal his6-tag, am observat în mod repetat lipsa legării la rășina acidului Ni-nitrilotriacetic. Secvențierea N-terminală a proteinei purificate a arătat că nmclpp matur începe de la reziduul Y6 (Fig. 1A), indicând autoproteoliza pentru eliberarea secvenței sale pro-terminale n (1msfdn5).

anterior, am determinat structura NmClpP cu ADEP-0419. În acest studiu, s-a determinat structura apo-NmClpP la 2,0 și Nmclpp cu legătura ADEP-14 la 2,7 (Fig. 1b, c, suplimentar Fig. 1C, Tabelul 1). Structura apo-NmClpP conține un tetradecamer în unitatea asimetrică și nu prezintă o densitate clară pentru niciuna dintre cele 14 bucle axiale n-terminale. Densitatea slabă a electronilor este observată pentru buclele formate din reziduuri G133-G137 în catena xct8 a regiunii mânerului (Fig. 1a). Unitatea asimetrică pentru cristalul NMCLPP + ADEP-14 conține două tetradecamere (suplimentar Fig. 1d). Nu s-a observat o densitate de electroni pentru reziduurile 1-22 din toate cele 28 de subunități datorate ambalării cristalelor (Fig. 1C, suplimentar Fig. 1d). În plus, catena de la xixt8 (reziduuri 130-137; Fig. 1a) este doar parțial vizibil în toate subunitățile. ADEP – 14 este legat de NmClpP într-o configurație similară cu ADEP-04 (Fig. 2e, f și 3e, f). Pe scurt, partea difluorofenil a ADEP-14 ocupă un buzunar hidrofob format din Y67, L95, L97 și L119 ale unei subunități și V49, L53, T84 și F87 ale unei subunități adiacente (Fig. 3e). Inelul cu șase membri al fracțiunii de acid pipecolic este expus la solvent și este stabilizat de inelul fenil al F117 și lanțurile laterale hidrofobe ale L97, L119 și L196 (Fig. 3e). Substituția suplimentară de metil pe reziduul de Alo-treonină al inelului depsipeptidic (Fig. 1b) este expus la solvent. La fel ca ADEP-04, ADEP-14 este asigurat în buzunarul hidrofob extrem de complementar prin două interacțiuni de legare a hidrogenului între gruparea hidroxil fenolică a Y67, gruparea amino a reziduului difluorofenilalanină și gruparea carbonil alanină din inelul depsipeptidic și o legătură de hidrogen mediată de solvent cu E56 (Fig. 3e, f). Lanțul lateral al acidului octadienoic al ADEP-14 este situat în canalul hidrofob îngust format din L53, F54 și S57 al unei subunități și R27, L28, E31, I33, F35 și Y67 al subunității vecine (Fig. 3e).

legarea ACP1 și ADEP are ca rezultat efecte alosterice distincte asupra butoiului ClpP

folosind structuri de forme APO – și compuse legate de EcClpP și NmClpP (Fig. 1c), am cercetat efectele alosterice care apar la legarea activatorului. Așa cum se arată în Fig suplimentar. 2, legarea activatorului acționează ca o pană care provoacă deplasarea laterală a două subunități adiacente. Gradul de schimbare conformațională globală cauzată de legarea ACP1-06 (rmsd = 0,84 Inktq în raport cu apo-EcClpP) este similar cu cel pentru ADEP-04 (rmsd = 0.73 la sută în raport cu apo-NmClpP), dar mai mică decât cea pentru ADEP-14 (rmsd = 2,47 la sută în raport cu apo-NmClpP). Interesant este că direcția de deplasare este diferită între cele două clase de activatori (Fig suplimentar. 2 și filme suplimentare 1-4). Între cele două Adep-uri, ADEP-14 provoacă o perturbare structurală generală mai mare a cilindrului NmClpP (comparați filmele suplimentare 3 vs.4). Legarea ADEP are ca rezultat o extindere a suprafeței apicale a NmClpP însoțită de constricție în regiunea ecuatorială. Pivotul pentru această mișcare se află în regiunea mânerului compusă din helix ae și catena XV8. Acest fenomen este observat în toate structurile ClpP legate de ADEP cunoscute până în prezent,cu diferite grade de compactare a cilindrului Clpp15,18,19,23, 40. În schimb, legarea ACP1-06 la EcClpP determină o mișcare spre interior a tuturor subunităților, rezultând în strângerea cilindrului ClpP (filmul suplimentar 1). Astfel, structurile arată că Acp1-urile și Adep-urile activează ClpP prin inducerea unor efecte alosterice distincte.

în structurile ecclpp și nmclpp legate de activator, legăturile electrostatice ale interfeței inel-inel care stabilizează tetradecamerul rămân conservate în ciuda modificărilor conformaționale (Fig suplimentar. 3). Mai mult, în ciuda schimbării structurale globale la legarea activatorului, triadele catalitice Ser-His-Asp ale EcClpP și NmClpP mențin geometrii catalitice competente, deoarece doar schimbări minore ale coloanei vertebrale Ca apar în apropierea sitului activ (Fig suplimentar. 1a-c). Analiza tuturor structurilor existente legate de Acp1 și ADEP ale ClpP arată că legarea compusului are ca rezultat și contracția regiunii ecuatoriale (Fig suplimentar. 4).

am cuantificat compactarea cilindrului ClpP la legarea ACP1 sau ADEP prin măsurarea volumelor camerelor catalitice respective (Fig suplimentar. 4). Legarea ACP1-06 determină o scădere cu ~5% a volumului camerei catalitice în raport cu apo-EcClpP. ADER1-legarea la EcClpP are ca rezultat o scădere similară a volumului camerei catalitice. Acest lucru este observat și pentru alte structuri ClpP legate de activatori, cum ar fi NMCLPP legat de ADEP-14, BSCLPP legat de ADEP și complexul heterooligomeric MtClpP1P2 legat de ADEP (suplimentar Fig. 4).

activarea ClpP are ca rezultat reorganizarea rețelei de legătură electrostatică la porii axiali

în structura apo-NmClpP, două legături electrostatice în apropierea porilor axiali stabilizează interfața oricăror două subunități adiacente (Fig. 3d, suplimentar Fig. 5). În primul rând, grupul carboxilat E58 încărcat negativ al unei subunități formează o pereche de ioni cu grupul guanidinium R27 încărcat pozitiv al subunității adiacente. În al doilea rând, grupările S57 hidroxil și E31 carboxilat ale două subunități adiacente formează o legătură de hidrogen. La legarea ADEP, aceste două legături necovalente se rup, în timp ce legătura ionică dintre R27 și E31 a aceleiași subunități este scurtată, adică întărită (Fig. 3e, f). În apo-EcClpP, o singură legătură ionică între E67 și R36 leagă două subunități adiacente, deoarece reziduul echivalent cu S57 al NmClpP este o alanină în EcClpP și, prin urmare, nu poate forma o legătură de hidrogen cu E40 (Fig. 3a). Ca și în NmClpP, legarea ACP1 sau ADEP1 la EcClpP elimină legătura ionică intersubunitară E67-R36 și dă naștere unei legături ionice intrasubunitare mai puternice Între R36 și E40 (Fig. 3b, c, suplimentar Fig. 5).

pentru a verifica în continuare aceste observații, am proiectat mutanți punctuali nmclpp și EcClpP care duc la pierderea legăturilor electrostatice intersubunitare de mai sus. Așa cum se arată în Fig. 4a, în timp ce WT NmClpP nu a putut degrada cazeina proteică, s-a constatat că mutantul nmclpp e58a degradează cazeina la o rată mai mare decât mutantul E31A. Important, mutantul dublu e31a + e58a a avut o activitate chiar mai mare decât mutanții unici. Gradul de activare a nmclpp mutant dublu este similar cu cel observat în prezența a 1 0xtm Adep sau 10 XTM Acp1 (Fig. 4a). Comportament Similar a fost observat pentru EcClpP cu mutații similare (E40a și E67a; Fig. 4b). Mutantul dublu EcClpP respectiv nu este solubil și nu a putut fi testat.

ulterior, am determinat structurile cu raze X ale mutanților nmclpp e58a și nmclpp e31a + e58a (Tabelul 1). Siturile catalitice din ambii mutanți nu sunt perturbate (Fig suplimentar. 1e). În mutantul unic nmclpp e58a, mutația elimină legătura ionică intersubunitară E58–R27 și dă naștere unei interacțiuni intrasubunitare mai puternice R27-E31, în timp ce legătura de hidrogen dintre S57 și E31 rămâne (Fig. 4c). Un „efect de pană” similar este astfel observat în structură, așa cum arată schimbarea conformațională subtilă globală a coloanei vertebrale ca a mutantului nmclpp (rmsd = 0,33 Inqt față de WT NmClpP) (filmul suplimentar 5). Mutația atât a E31, cât și a E58 la alanină pentru a genera mutantul dublu nmclpp E31A + E58A (rmsd = 0,29 Irakt față de WT NMCLPP) elimină cele două interacțiuni electrostatice intersubunitare Stabilizatoare, precum și legătura ionică intrasubunitară R27–E31 prezentă în mutantul unic nmclpp E58A (Fig. 4D și filmul suplimentar 6) și în NMCLPP legat de ADEP (Fig. 3e, f). Astfel, mutantul dublu nmclpp E31A + e58a este diferit de NMCLPP legat de ADEP cu legătura ionică intrasubunitară eliminată, dar este totuși o proteină activată cu activitate proteolitică intrinsecă comparabilă cu cea a ClpP activat cu molecule mici (Fig. 4a). La fel ca NMCLPP legat de ADEP, ambele mutante simple și duble nmclpp au volume reduse ale camerei catalitice datorită compactării butoiului ClpP (Fig suplimentar. 4).

o astfel de reorganizare a rețelei de legătură este observată pentru toate structurile ClpP activate disponibile în PDB, fie în prezența activatorilor cu molecule mici, fie datorită mutațiilor specifice (Fig suplimentar. 6). De exemplu, legarea activatorului cu molecule mici la B. subtilis ClpP (BsClpP), S. aureus ClpP (SaClpP), M. tuberculosis ClpP (MtClpP) și Homo sapiens ClpP (HsClpP) elimină una sau două legături electrostatice intersubunitare în apropierea porului axial și dă naștere unei interacțiuni ionice intrasubunitare mai puternice (Fig suplimentar. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. În MtClpP2, legătura ionică intersubunitară echivalentă cu interacțiunea E58–R27 în nmclpp nu există18. Reziduul echivalent pentru E58 de NmClpP este L66 în MtClpP2 și nu poate participa la o interacțiune Ionică cu K35 de MtClpP2 (echivalent cu R27 de NmClpP). În schimb, o legătură de hidrogen intersubunitară între S65 și E39 stabilizează interfața (Fig suplimentar. 6g, h). Legarea ADEP de MtClpP2 rupe legătura de hidrogen S65-e39 și întărește legătura ionică intrasubunitară dintre K35 și e3918.

interesant, chiar și varianta SaClpP y63a activată41, cu mutația Activatoare Găsită în centrul sitului hidrofob și, prin urmare, nu este echivalentă cu mutațiile activatoare ale NmClpP prezentate aici, susține modelul propus de reorganizare a rețelei de legare a hidrogenului în jurul porilor axiali la activarea ClpP (Fig suplimentar. 6f). În structura mutantului SaClpP Y63A, distanța dintre perechea Ionică intersubunitară (Q54–R23) este mărită, în timp ce puntea de sare intrasubunitară (R23–D27) este întărită (Fig suplimentar. 6d, f). De asemenea, am generat mutația echivalentă Y63A atât în EcClpP, cât și în NmClpP. Mutantul NMCLPP Y67A a fost insolubil, în timp ce EcClpP Y76A a avut o activitate ușor mai mare decât mutantul E40A, dar mai mică decât cea a mutantului e67a (Fig. 4b).

ClpP activare rezultate în reducerea structurale eterogenitatea N-terminale axiale bucle

Cum sa discutat mai sus, în comandate axial bucla de NmClpP+ADEP-04 complexe care formează β1–β2 viraj ac de păr, ADEP obligatorii comunicate R27 de la o intersubunit ionic bond cu E58 și întărește intrasubunit ionic bond cu E31 de helix aA (Fig. 5a). În consecință, R27 formează o legătură ionică cu D23 din catena XV1 a buclei axiale. Această interacțiune Stabilizatoare este observată în toate structurile legate de activator ale ClpP unde sunt ordonate buclele axiale (Fig. 5a-e).

pentru structura EcClpP+ACP1-06, buclele axiale (reziduuri 14-31) sunt parțial ordonate în cristal cu doar 1 din 14 bucle axiale care formează virajul acului de păr de la 7–12 (Fig. 1C-comanda completă pare a fi parțial împiedicată de efectele de ambalare a cristalelor). În bucla axială ordonată a subunității A, eliberarea R36 din legătura ionică intersubunitară cu E67 îi permite să formeze o legătură ionică intrasubunitară mai puternică cu E40 de helix aA (Fig. 5f). Cu toate acestea, nu există nici o interacțiune Ionică Stabilizatoare între E22 a catenei XV1 și R36 a helix aA, probabil datorită ordonării parțiale (Fig. 5f). O legătură suplimentară de hidrogen între D32 a catenei XV2 și S21 a helix aA ancorează bucla axială la domeniul de bază EcClpP (Fig. 5f). În mod similar, buclele axiale din structura Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4 sunt doar parțial ordonate21. Legătura de hidrogen conservată între reziduul ARG al helix aA și un reziduu încărcat negativ al catenei XV1 nu se observă în buclele axiale EfClpP parțial ordonate, deși EfClpP are reziduuri potențiale de formare a legăturii de hidrogen pe catena XV1 (T6) și pe catena de legătură a buclei de legătură între catenele x1 și X2 (E9, Q10, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

în plus față de interacțiunile electrostatice conservate, contactele hidrofobe extinse cu domeniul capului ClpP stabilizează buclele axiale. În EcClpP + ACP1-06, reziduurile n-terminale nepolare ale catenei XV1 și bobina structurată precedentă participă la interacțiuni hidrofobe cu reziduurile nepolare ale helix aA din aceeași subunitate și pe fețele hidrofobe ale helicelor aA’ și aB’ ale unei subunități vecine (Fig suplimentar. 7a). Reziduurile nepolare de pe helicele aA, aB’, și XV3 ‘ constituie un plasture hidrofob continuu pe circumferința porului axial (suplimentar Fig. 7b) 15.

pentru a obține o imagine mai clară a eterogenității conformaționale a buclelor axiale ClpP, au fost apoi efectuate experimente RMN metil-TROSY. Inițial, o singură mutație a cisteinei a fost introdusă în buclele axiale ale NmClpP(T10C). Proteina uniform deuterată a fost produsă și ulterior a reacționat cu 13C-metil-metanetiosulfonat (MMTS). Acest lucru are ca rezultat atașarea unei singure grupări 13CH3–s vizibile RMN la lanțul lateral al cisteinei, ducând la formarea unui reziduu s-metiltio-cisteină (MTC) 42. Această metodă oferă o modalitate ușoară de monitorizare a structurii și dinamicii complexelor mari în soluție. Monitorizarea corelațiilor RMN ale sondei de spin atașate în forme libere, legate de activator sau mutante ale enzimei asigură o citire a conformației soluției porilor axiali.

inițial, au fost efectuate experimente de control pentru a se asigura că introducerea părții T10MTC nu perturbă structura NmClpP. Pe scurt, corelațiile de coerență cuantică multiplă heteronucleară 1H-13C (HMQC) ale WT și T10MTC nmclpp etichetate 13CH3 la lanțul lateral al reziduurilor ILVM într-un fundal altfel complet deuterat au fost comparate și s-au dovedit a fi practic identice. Ulterior, corelațiile HMQC 1H-13C ale NmClpP T10MTC au fost obținute în diferite stări (Fig. 6a). Forma apo (contururi albastre) are un număr mare de corelații, indicând bucle axiale eterogene structural. Adăugarea unui exces molar dublu de ADEP – 28 (activitate dată în Fig. 4a) peste ClpP monomeric a redus semnificativ numărul de corelații (contururi roșii), indicative de rigidificare sau ordonare structurală. În schimb, legarea ACP1-17 (exces molar de două ori peste ClpP monomeric; activitate dată în Fig. 4a) are ca rezultat modificări nedetectabile ale corelațiilor observate (contururi verzi), ceea ce înseamnă că buclele axiale nu sunt afectate.

această abordare a fost, de asemenea, exploatată pentru a monitoriza efectul activării mutațiilor (Fig. 4a, b) pe buclele axiale. În aceste experimente, mutațiile Activatoare au fost introduse în fundalul mutației T10C (etichetare). Așa cum se arată în Fig. 6A, corelațiile mutantului nmclpp T10MTC/e31a (contururi roșii) sunt puțin mai puțin eterogene decât forma pseudo WT, în timp ce cele ale mutantului nmclpp T10MTC/e58a (contururi portocalii) sunt practic neschimbate. Prezența simultană a ambelor mutații activatoare (NMCLPP T10MTC/e31a + e58a) are un efect mult mai dramatic decât mutațiile unice și elimină un număr mare de corelații corespunzătoare buclelor axiale (contururi negre). Acest lucru este în concordanță cu observația că mutantul dublu este mai activ decât mutanții unici (Fig. 4a).

activarea ClpP are ca rezultat reducerea eterogenității conformaționale a regiunii mânerului

aceeași abordare bazată pe RMN a fost utilizată pentru a sonda efectul legării activatorului și a mutațiilor asupra regiunii mânerului. Un mutant i144mtc (helix aE) al NmClpP a fost preparat și studiat de RMN în forme legate de apo-, ADEP-28-și ACP1-17. Apo-forma (contururi albastre, Fig. 6a) prezintă o pereche de vârfuri, indicând faptul că regiunea mânerului este asociată cu o pereche de conformații coexistente, așa cum se vede în lucrarea noastră anterioară despre EcClpP4. Interesant, adăugarea de ACP1 și ADEP duce la dispariția unuia dintre vârfuri. Având în vedere că situl de legare a activatorului este distal față de sonda de spin RMN, se pare că legarea ACP1 sau ADEP Selectează alosteric una dintre conformațiile din regiunea mânerului. Alternativ, activatorii ar putea fi capabili să lege ambele forme, dar să inducă o schimbare într-o singură stare.

experimente de schimb de magnetizare cu perioade de întârziere de amestecare a 100, 200, 300, 400, 500, și 600 ms la 40 CTC nu au putut detecta nicio interconversie între conformatorii observați pentru regiunea mânerului pentru WT NmClpP. Acest lucru indică faptul că procesul de schimb este prea lent pentru caracterizarea prin RMN.

SAXS demonstrează modificări conformaționale clpp induse de activator în soluție

pentru a sonda în continuare starea oligomerică și modificările structurale la legarea compusului, probele apo-NmClpP și NMCLPP+ADEP-04 au fost caracterizate de SAXS (Fig. 6b-g și suplimentar Fig. 8). Curbele finale îmbinate sunt prezentate în Fig. 6B, iar profilele SAXS obținute semănau cu cele ale structurilor cave43. Nu s-au constatat modificări semnificative în ceea ce privește plierea generală (Fig suplimentar. 8), raza de girație (Rg) și starea oligomerică când ADEP-04 a fost adăugat la NmClpP (suplimentar Fig. 8c). Pentru a analiza în continuare profilurile NMCLPP SAXS și pentru a genera soluții ab initio structuri, programul GNOM a fost utilizat pentru a construi funcții de distribuție a distanței pereche, p(r). Apo-NmClpP p(r) a dezvăluit o schimbare subtilă la dreapta și o dimensiune maximă mai mare (Dmax) în comparație cu NMCLPP legat de ADEP-04 (Fig. 6c și suplimentar Fig. 8c). Ulterior, modelele atomice fictive (baraje) au fost generate folosind datele SAXS pentru a analiza vizual structurile soluției nmclpp (Fig. 6d-g). Au fost generate zece modele pentru apo-NmClpP și ADEP-04-legat NmClpP, iar cele mai probabile au fost alese. Aceste modele au arătat că, în general, cele două structuri de soluție NmClpP sunt similare (cilindri goi). Cu toate acestea, atunci când sunt suprapuse cu structurile cristaline corespunzătoare, diferențele care sunt de acord cu structurile de înaltă rezoluție au fost ușor observate (Fig. 6d, e). O măsură a înălțimilor axiale ale tuturor celor zece baraje pentru nmclpp legat de apo și ADEP-04 a avut ca rezultat valori de 93,0 la 5,4 la 5 pentru apo și 103,5 la 6,1 la 04 Pentru forma legată de ADEP. Pentru a corobora în continuare această observație, hărțile cu probabilitate medie a barajelor și hărțile cu cea mai mare ocupare a DAs (Fig. 6F, g) au fost analizate. Înălțimile axiale au înregistrat o creștere de circa 10% pentru NMCLPP legat de ADEP-04 în comparație cu apo-NmClpP. Mai mult, nmclpp legat de ADEP-04 a afișat o circumferință a porilor axiali mai mare decât apo-Nmclpp (Fig. 6f, g). Astfel, în ciuda rezoluției scăzute a tehnicii SAXS, rezultatele sugerează că legarea ADEP-04 la NMCLPP nu afectează starea oligomerică a NmClpP, ci determină o expansiune a porilor axiali și o ocupare crescută în părțile superioare și inferioare ale barajului NMCLPP+ADEP-04 (Fig. 6e, g) în comparație cu apo-NmClpP. Acest lucru reflectă probabil modificările conformaționale care duc la scăderea eterogenității structurii buclelor axiale n-terminale ale NmClpP observate prin raze X și RMN.