zastosowanie systemu Cobas 4800 do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego wysokiego ryzyka u 5650 kobiet bezobjawowych

Streszczenie

badanie wysokiego ryzyka wirusa brodawczaka (HR-HPV) w połączeniu z cytologią poprawia wykrywanie zmian w szyjce macicy i zwiększa długość odstępów między badaniami przesiewowymi. W przypadku populacyjnego badania HR-HPV bardzo potrzebna jest automatyzacja testów. Cobas 4800 HPV Test System jest w pełni zautomatyzowanym testem, który może jednocześnie wykryć HPV16, HPV18 i inne 12 połączonych genotypów HR-HPV. System ten został zastosowany do badań przesiewowych HR-HPV w wielu krajach; Jednak takie zastosowanie u dużej populacji w Chinach nie zostało udokumentowane. W tym badaniu wykorzystaliśmy System Cobas 4800 HPV do wykrywania HR-HPV w próbkach cytologicznych szyjki macicy zebranych od 5650 bezobjawowych kobiet z regionu południowych Chin. Zgłaszaliśmy następujące przypadki: (1) częstość występowania 14 genotypów HPV wynosiła 12,96%; (2) u osób z zakażeniem HPV 2,25% było dodatnie dla HPV16, 0,50% dla HPV18, 9,15% dla 12 typów HPV i 1,06% dla wielu zakażeń HPV; oraz (3)nie stwierdzono istotnej różnicy w częstości występowania HPV w różnych grupach wiekowych. Wykazano, że HPV16 i HPV18 są dominującymi typami HPV występującymi u pacjentów z rakiem szyjki macicy w niektórych regionach Chin, co wskazuje, że w pełni zautomatyzowany test, taki jak Cobas 4800 HPV Test System, jest szczególnie cenny w populacyjnych badaniach przesiewowych HR-HPV w tych regionach, ponieważ ten test może jednocześnie wykrywać HPV16 i HPV18.

1. Wprowadzenie

wirus brodawczaka ludzkiego (HPV )jest dwuniciowym wirusem DNA z rodziny brodawczaków. Zidentyfikowano ponad 200 genotypów HPV, wśród których 15 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, i 82) są silnie związane z rakiem szyjki macicy . Rak szyjki macicy jest czwartym najczęstszym nowotworem u kobiet na świecie i szóstym najczęstszym nowotworem u kobiet w Chinach . Aby zmniejszyć obciążenie rakiem szyjki macicy, wczesne rozpoznanie zmian szyjki macicy, które mogą przejść do raka inwazyjnego, ma ogromne znaczenie. Cytologia szyjki macicy odgrywa ważną rolę w zapobieganiu rakowi szyjki macicy . Dodanie badania HPV do badań cytologicznych prowadzi do zwiększenia wykrywalności zmian w szyjce macicy o wysokim stopniu nasilenia, dlatego zaleca się włączenie do badań cytologicznych badań przesiewowych HPV wysokiego ryzyka (HR-HPV) w celu poprawy wykrywania choroby i wydłużenia odstępów między badaniami przesiewowymi .

do tej pory opisano różne metody genotypowania i wykrywania HPV . W przypadku badań przesiewowych opartych na populacji automatyzacja testów jest szczególnie przydatna, ponieważ automatyzacja posiada zdolność przetwarzania dużej liczby próbek w krótkim czasie i zmniejsza liczbę błędów ludzkich, które mogą wystąpić w operacjach ręcznych. Cobas 4800 HPV Test System (Roche Molecular Systems Inc. Rotkreuz, Szwajcaria), W pełni zautomatyzowany, został zaprojektowany do jednoczesnego wykrywania łącznie 14 typów HPV: HPV16 indywidualnie, hpv18 indywidualnie i 12 połączonych genotypów HPV (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, i 68). Ten system został zatwierdzony przez U. S. Food and Drug Administration do badań przesiewowych HR-HPV. System testowy Cobas 4800 HPV składa się z 2 części, tj., Instrument Cobas x 480, który służy do automatyzacji oczyszczania kwasu nukleinowego i pipetowania próbek PCR oraz analizator Cobas z 480, który służy do automatycznej amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym i późniejszej hybrydyzacji specyficznej dla typu. Chociaż w wielu krajach zgłoszono stosowanie systemu Cobas 4800 do badań HR-HPV, takie zastosowanie u dużej populacji w Chinach nie zostało udokumentowane. W tym badaniu wykorzystaliśmy System Cobas 4800 HPV do wykrywania HR-HPV w próbkach cytologicznych szyjki macicy pobranych od 5650 kobiet bezobjawowych.

2. Metody

to badanie zostało zatwierdzone przez Komitet przeglądu badań medycznych Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine. Wszyscy uczestnicy uzyskali świadomą zgodę.

2.1. Pobieranie próbek szyjki macicy

bezobjawowe kobiety w wieku 20-65 lat zostały włączone do tego badania od stycznia 2018 r.do grudnia 2018 r. z kosztami badania pokrytymi przez uczestników badania lub ich pracodawców lub w połączeniu. Kryteria włączenia obejmują Ukończenie 20 lat lub więcej, brak ciąży, nienaruszoną macicę, aktywność seksualną lub aktywność seksualną w wywiadzie. Wszyscy pacjenci zostali poinformowani o niestosowaniu leków dopochwowych, środków antykoncepcyjnych dopochwowych lub smarów przez 48 godzin przed pobraniem próbek szyjki macicy. Próbki do cytologii szyjki macicy pobierano za pomocą urządzenia Combi Cervex-Brush (Rovers Medical Devices) w następujący sposób: część próbkowania endocerwialnego urządzenia wprowadzono do kanału endocerwialnego, aby umożliwić boczne szczeciny pełne zetknięcie się z ektocerwisem, a następnie urządzenie obrócono o dwa pełne obroty zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Po pobraniu, urządzenie z pobranymi komórkami natychmiast wstawiono do fiolki zawierającej roztwór konserwantu (Hologic Inc., Bedford, MA, USA) i energicznie wirował. Próbki wykorzystano do wykrywania DNA HPV, jak opisano poniżej.

2.2. HR-HPV Detection Using the Cobas 4800 HPV Test System

Bufor Lizy, Bufor myjący, Bufor Elucyjny, zestawy kontroli dodatniej i ujemnej HPV oraz wszystkie inne odczynniki zostały zakupione od Roche Molecular Systems Inc. Każda próbka miała kontrolę wewnętrzną, β-globinę, w celu monitorowania adekwatności komórek, a każda próba obejmowała Zestaw Kontroli dodatnich i ujemnych HPV. Ekstrakcję i oczyszczanie DNA przeprowadzono przyrządem Cobas x 480 zgodnie z zaleceniami producenta. Krótko, próbki roztworu Konserwcyt wirowano i umieszczano na nośniku próbki, a odczynniki, np. Bufor Lizy, Bufor płuczący i bufor Elucyjny, ładowano do odpowiednich nośników zbiornika odczynnika. Po załadowaniu próbki i odczynnika, przygotowanie DNA zostało zakończone automatycznie, a końcowe produkty DNA zebrano do płytki mikrofalowej. Następnie płytkę mikrofalową zawierającą DNA zamknięto ręcznie i załadowano do analizatora Cobas z 480, a amplifikację i hybrydyzację zakończono automatycznie.

2.3. Analiza statystyczna

analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu SPSS 13.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Do oceny zmiennych kategorycznych użyto testu χ2. Wszystkie testy statystyczne były dwustronne, a wartości mniejsze niż 0,05 uznano za istotne statystycznie.

3. Wyniki

łącznie 5650 bezobjawowych kobiet w wieku 20-65 lat ze średnią liczbą lat spełniło wymagania badania i zostało włączonych do tego badania. Spośród tych uczestników 732 (12,96%) wykryto jako HPV-dodatnie, w tym 127 (2,25%) z zakażeniem HPV16, 28 (0,50%) z zakażeniem HPV18, 517 (9,15%) z połączonymi 12 typami HPV i 60 (1,06%) z wieloma zakażeniami HPV (HPV16 mieszane z HPV18, HPV16 mieszane z 12 połączonymi typami, HPV18 mieszane z 12 połączonymi typy lub HPV16 zmieszane z hpv18 i 12 połączonymi typami) (tabela 1).

w zależności od wieku uczestników podzielono na 4 grupy: 20-30, 31-40, 41-50 i >51 lat. Jak pokazano w tabeli 2, w grupie 31-40 lat najwyższy wskaźnik zakażenia HPV wynosił 15,32%, a następnie w grupach >50 lat, 41-50 lat i 20-30 lat, chociaż nie zaobserwowano istotności statystycznej wśród częstości zakażeń w tych grupach.

4. Dyskusja

w tym badaniu wykorzystaliśmy System Cobas 4800 do wykrycia HPV u 5650 kobiet bezobjawowych i stwierdziliśmy: (1) częstość występowania 14 genotypów HPV wynosiła 12,96%; (2) spośród 732 kobiet z dodatnim wynikiem HPV 2,25% było dodatnie dla HPV16, 0,50% dla HPV18, 9,15% dla łącznych 12 typów HPV i 1,06% w przypadku wielu infekcji HPV; oraz (3)nie stwierdzono istotnej różnicy w częstości występowania HPV w różnych grupach wiekowych.

zarówno Test wysokiego ryzyka HPV w czasie rzeczywistym firmy Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, IL, USA) oraz system Cobas 4800 HPV są klinicznie zwalidowanymi, w pełni zautomatyzowanymi testami PCR do wykrywania HR-HPV . Jedną z zalet tych dwóch testów jest to, że mogą one jednocześnie wykrywać i rozróżniać HPV16 i HPV18, co jest ważne w badaniach przesiewowych raka szyjki macicy, ponieważ HPV16 i HPV18 stanowią około 70% nowotworów szyjki macicy na całym świecie . W kilku badaniach porównano te 2 testy w wykrywaniu HR-HPV w próbkach klinicznych. Park i in. zbadano 365 próbek wymazu z szyjki macicy i stwierdzono, że test wysokiego ryzyka HPV w czasie rzeczywistym wykazał czułość 78,3% ze swoistością 99,2%, podczas gdy czułość i swoistość systemu Cobas 4800 wynosiły odpowiednio 91,7% i 97,0%. Cuzick et al. przebadano 6000 Kobiet I stwierdzono, że u 16,0% wykryto HR-HPV-dodatni w systemie Cobas 4800, natomiast u 13,4% wykryto HR-HPV-dodatni w teście wysokiego ryzyka w czasie rzeczywistym . Dane te wskazują, że system Cobas 4800 ma większą czułość wykrywania.

kilka klinicznie zatwierdzonych molekularnych systemów wykrywania DNA HR-HPV zostało włączonych przez Światową Organizację Zdrowia w 2016 r.do podręcznika Integrating HPV Testing in Cervical Cancer Screening Programs-a Manual for Program Managers (https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2016/manual-VPH-English—FINAL-version.pdf). Testy te składają się z testów opartych na hybrydyzacji, tj. techniki Hybrid Capture 2 i testu CareHPV oraz testów opartych na PCR, np., Cobas HPV test, Abbott Realtime High Risk HPV test, Cervista HPV HR test i BD HPV test. Wszystkie testy oparte na PCR wymagają izolacji DNA, podczas gdy testy oparte na hybrydyzacji nie. Spośród wszystkich metod, TEST HR Cervista na obecność HPV trwa 6-7 godzin, a test Abbott na obecność HPV wysokiego ryzyka w czasie rzeczywistym trwa 6-8 godzin, co może nie spełniać celu „widzieć i leczyć” tego samego dnia. Natomiast wszystkie pozostałe metody, w tym system Cobas 4800, wymagają jednak maksymalnego czasu trwania około 5 godzin, odpowiedniego dla pacjentów, aby ukończyć „zobacz i leczenie” podczas jednej wizyty.

na całym świecie częstość występowania HPV różni się w zależności od kontynentu . W Chinach do badania częstości występowania HPV stosowano różne metody . Wu et al. zastosowano Hybrydowy Test Capture 2 (Qiagen, Hilden, Niemcy) do wykrywania HR-HPV 13 połączonych typów (HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, i 68) w sumie 4215 kobiet w wieku 17-54 lat z 5 różnych obszarów geograficznych Chin i odkryło, że częstość występowania HPV wynosiła 12,4% . Stosując tę samą metodę co Wu et al. , Zhao et al. znalazłem 15.U 2% ze 1274 kobiet z regionu w północnych Chinach stwierdzono obecność HPV . Chen et al. zastosował zestaw do genotypowania HPV (Yaneng Biotechnology Limited Corp., Shenzhen, Chiny) W sumie 961 029 testów HPV u kobiet w wieku od 16 do 83 lat z południowo-wschodnich Chin i ujawnił wskaźnik zakażenia HPV HR na poziomie 16,61% . Jing i in. zastosował test spektrometryczny mas do badania HPV-DNA u 78 355 kobiet w wieku od 18 do 75 lat z południowych Chin i zgłosił częstość występowania <7,3% HR-HPV . Badania te wykazały, że odsetek zakażeń HPV u chińskich kobiet wynosi około 10-15%, co jest zgodne z naszym odkryciem. Jednak metoda, której użyliśmy w niniejszym badaniu, jest prostsza i mniej pracochłonna w porównaniu z tymi stosowanymi w poprzednich badaniach .

dwa badania o największej wielkości próby przeprowadzone w Chinach porównały częstość występowania HPV w grupie wiekowej. Zeng et al. retrospektywnie przeanalizowano 671 163 testy HPV przeprowadzone metodą Hybrid Capture 2 w latach 2007-2014 i wykazano najwyższą częstość występowania HPV HR-36.9% w grupie wiekowej <20 lat, podczas gdy HR-HPV-dodatnie wskaźniki dla grup wiekowych 20-30, 30-40 i 40-50 lat wynosiły odpowiednio 24, 4%, 19, 7% i 19, 9%. Badanie HR-HPV z największą liczbą próbek (961 029 próbek) przeprowadzone przez Chen et al. ponownie pokazuje najwyższą częstość występowania HPV w grupie wiekowej <20 lat (22,3%), podczas gdy częstość występowania w grupach wiekowych 20-30, 30-40 i 40-50 lat wynosi odpowiednio 16,8%, 15,2% i 15,9%. Badania te ujawniają nieco wyższy wskaźnik rozpowszechnienia w grupie 20-30 lat niż w grupach 30-40 i 40-50 lat, co jest sprzeczne z naszymi wynikami, ponieważ zaobserwowaliśmy najniższą częstość występowania HPV w grupie 20-30 lat. Ta rozbieżność może wystąpić z powodu następujących czynników: (1) młodsze kobiety mają obecnie większy dostęp do programów edukacji zdrowotnej, zwłaszcza programów online z wykorzystaniem urządzeń elektronicznych, oraz (2) młodsze kobiety są bardziej chętne do uczenia się i akceptowania nowej wiedzy na temat warunków sanitarnych i zdrowia seksualnego.

HPV16 jest najczęstszym typem HPV występującym w próbkach szyjki macicy kobiet z północnych (Pekin i Henan, Shanxi i Xinjiang), Południowo-Wschodnich (Prowincja Szanghaj i Zhejiang) i południowych Chin (Prowincja Guangdong), z dodatnim wskaźnikiem wynoszącym od 1,5 do 3,6%, co odpowiada 2,25% wskaźnikowi infekcji HPV16 obserwowanemu u naszych badanych osób , które pochodzą z południowych Chin. HPV16 jest odpowiedzialny za około 50% raka szyjki macicy na świecie . Chociaż informacje na temat dystrybucji genotypu HR-HPV u chińskich pacjentów z rakiem szyjki macicy są nadal ograniczone, Li i wsp. zgłoszono, że u 1818 z 2309 pacjentów z rakiem szyjki macicy (78,7%) z zachodnich Chin stwierdzono dodatni wynik na obecność HPV16, a u około 90% tych pacjentów stwierdzono dodatni wynik na obecność HPV16 i HPV18 . 53,2% wskaźnik zakażeń HPV16 i HPV18 wykazano również u 326 pacjentów z rakiem szyjki macicy z prowincji Fujian w południowo-wschodnich Chinach . Dane te wskazują, że HPV16 i HPV18 są dominującymi typami HPV występującymi u pacjentów z rakiem szyjki macicy w tych regionach. W pełni zautomatyzowany test, taki jak Cobas 4800 HPV Test System, który może jednocześnie wykrywać i różnicować HPV16 i HPV18, będzie szczególnie cenny w populacyjnych badaniach przesiewowych HR-HPV w regionach, w których dominuje zakażenie HPV16 i HPV18.

dostępność danych

konflikty interesów

autorzy oświadczają, że nie występują w nich konflikty interesów.

wkład autorów

SW, XH, QP i LZ rekrutowały uczestników, zbierały próbki i przeprowadzały testy. SW i JZ napisali artykuł. FM dokonał przeglądu literatury i przeprowadził analizę statystyczną. JZ zaprojektował badanie, przeanalizował dane i ostatecznie zatwierdził rękopis.