test Immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) jest ważną metodą monitorowania regulacji transkrypcji z odkrytą wiedzą o interakcjach między określonymi białkami i regionem genomowego DNA. Biorąc pod uwagę fakt, że białka wiążące DNA (w tym czynniki transkrypcyjne i histony) w żywych komórkach mogą być usieciowane z DNA, które są wiążące, ChIP jest używany do immunoprecypitacji kompleksu białko-DNA z lizatów komórkowych przez odpowiednie przeciwciało. Immunoprecypitowane kompleksy są zbierane przez odwirowanie, a białka są eluowane do dalszej analizy, takiej jak western blot i LC/MS.analiza kwasu nukleinowego jest osiągana przez PCR, RT-PCR, sekwencjonowanie cDNA i mikromacierze. Protokół ten zapewnia szczegółową procedurę do osiągnięcia udanego testu ChIP w szybki i skuteczny sposób.
:
- 37% formaldehyd
- 1 m glicyna
- bufor do lizy komórek: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, z 1× koktajlem inhibitora proteazy.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Dodać 27 µL 37% Formaldehydu na 1 mL pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie na poziomie 1%, inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, powoli wstrząsając na urządzeniu do kołysania lub wstrząsania.
2. Połączenie sieciowe hartować przez dodanie 141 µL 1 m glicyny na 1 mL pożywki hodowlanej w celu uzyskania końcowego stężenia przy 125 mM, inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. W przypadku komórek pływających: komórki collet do stożkowej probówki o pojemności 15 mL wirować w temperaturze 2000 × g w temperaturze 4°C przez 5 minut. Wyrzucić supernatant i dwukrotnie umyć komórki zimnym PBS.
przejdź do kroku 5.
4. W przypadku komórek samoprzylepnych: usunąć podłoże, umyć komórki dwukrotnie zimnym PBS. Zeskrobać komórki na PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 mL, wirować w temperaturze 2000 × g w temperaturze 4°C przez 5 minut.
liza i sonikacja
5. Wyrzucić supernatant, dodać 1 mL buforu do lizy zimnych komórek na 1 × 107 komórek. Wymieszać osad przez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół i inkubować na lodzie przez 10 minut.
6. Sonikacji do ścinania chromatyny do 0,5 ~ 1 Kb fragment. Unikaj piany i trzymaj próbkę na lodzie.
Notki:
- warunki sonikacji powinny być zoptymalizowane w zależności od modelu próbki i sonikatora. Typowo stwierdzono, że działa sześć 15-sekundowych impulsów, po których następuje 45-sekundowy odpoczynek przy wyjściu 6.0. W celu analizy rozmiaru fragmentu, wyodrębnić niewielką objętość całkowitego DNA z porcji ściętej chromatyny, a następnie przeanalizować na żelu agarozowym (1~2%).
- objętości sugeruje się ≤ 1 mL, aby utrzymać skuteczność sonikacji.
7. Wirować w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4°C przez 10 minut i zatrzymywać supernatant.
8. Przenieść 0,5 mL supernatantu do świeżej 1.Rurka 5 mL do analizy fragmentów DNA.
Immunoprecypitacja
9. Dodać odpowiednie przeciwciała lub normalne IgG do próbki i inkubować przez 15 minut w ultradźwiękowej łaźni wodnej w temperaturze pokojowej.
Notki:
- wybrać IgG z tego samego gatunku, w którym wytworzono przeciwciała.
- czas inkubacji powinien być zoptymalizowany w zależności od przeciwciała i antygenu. W przypadku antygenów o niskim poziomie ekspresji inkubację można przeprowadzić w temperaturze 4°C przez noc na obrotowej platformie .
10. Przygotować białko a-agaroza koraliki: perełki przemyć trzykrotnie 1 mL buforu do lizy (bez inhibitora proteazy), odwirować w temperaturze 2000 × g przez kilka sekund w temperaturze 4°C, a następnie wyrzucić supernatant.
11. Rozcieńczyć kulki 1:1 buforem do lizy i dodać 50 µL do próbki.
12. Inkubować w temperaturze 4°C przez 30~45 minut w obrotowej platformie.
13. Wirować w temperaturze 2000 × g przez 1 minutę w temperaturze 4°C, a następnie wyrzucić supernatant.
14. 4 razy przemyć kulki 1 mL buforu do lizy (bez inhibitora proteazy), wyrzucić supernatant.
Oczyszczanie i analiza DNA
15. Umyte kulki wymieszać z 100 µL 10% Chelex 100.
16. Pipetą w górę iw dół przez kilka sekund, a następnie gotować próbkę przez 10 minut.
17. Odwirować w temperaturze 12 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 mL.
18. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA lub standardowego protokołu ekstrakcji fenolem: chloroformem.
19. Rozpuść DNA z 50 µL ddH2O i użyj 2~10 µL próbki DNA (25% objętości reakcji) w reakcjach PCR
dowiedz się o zasadzie ChIP
Reach to our ChIP servise
jeśli masz jakiekolwiek pytania, skontaktuj się z nami pod adresem: