1.4.1 Ośrodek homogenizacji
zaburzenie komórkowe jest zwykle wykonywane w lekko hipo-osmotycznym lub izo-osmotycznym ośrodku w celu zachowania integralności morfologicznej. Sacharoza jest powszechnie stosowana jako osmoticum w celu zapobiegania podkomórkowym organelom lub pęcherzykom przed niekorzystnym obrzękiem lub skurczem. Mannitol i sorbitol stosowano również, gdy stwierdzono, że sacharoza wpływa na analizę biochemiczną składnika subkomórkowego. Sacharoza jest preferowana w stosunku do roztworów soli, ponieważ te ostatnie mają tendencję do agregowania subkomórkowych organelli. Media hipo-osmotyczne są często stosowane w izolacji frakcji błon plazmatycznych, ponieważ w tych warunkach uszkodzone komórki wytwarzają błony plazmatyczne w postaci dużych widm lub arkuszy. To znacznie zmniejsza wysoki stopień zmienności wielkości tych fragmentów przed odwirowaniem. Chociaż podłoże homogenizacyjne jest zwykle wodne, niewodne media, takie jak eter/chloroform, zostały użyte do wyizolowania subkomórkowych organelli. Jednak niewodne media mogą inaktywować niektóre enzymy i zmniejszać integralność morfologiczną niektórych tkanek.
czynniki chelatujące (EDTA lub EGTA) można dodać do podłoża homogenizacyjnego w celu usunięcia kationów dwuwartościowych, takich jak Mg2+ lub Ca2+, które są wymagane przez proteazy błonowe. Ważne jest, aby pamiętać, że inhibitory proteazy nadal powinny być zawarte w pożywce, ponieważ odczynniki EDTA i tiolowe mogą aktywować niektóre enzymy proteolityczne. Jednak wiele enzymów markerów membranowych wymaga tych kationów do aktywności i mogą być hamowane po usunięciu kationów z ekstraktu. Dodanie Mg2+ lub Ca2+ do homogenizatora utrzymuje integralność jądrową. Jony te mogą jednak powodować agregację błon i zmniejszać kontrolę oddechową w mitochondriach.
rozpad komórek tkanki roślinnej często uwalnia fenole, które mogą mieć szkodliwy wpływ na enzymy roślinne. Roślinne związki fenolowe obejmują zasadniczo dwie grupy: związki fenylopropanoidowe (np. hydrolizowalne garbniki) i flawonoidy (np. skondensowane garbniki). Fenole mogą wiązać się Wodorem z wiązaniami peptydowymi białek lub ulegać utlenianiu przez oksydazę fenolową do chinonów. Chinony są silnymi środkami utleniającymi, które również mają tendencję do polimeryzacji i kondensacji z reaktywnymi grupami białek, tworząc ciemny pigment zwany melaniną, który stanowi podstawę brązowienia tkanki roślinnej. Przyłączenie melaniny do białek może inaktywować wiele enzymów. Fenolowe grupy hydroksylowe mogą tworzyć interakcje jonowe z zasadowymi aminokwasami białek lub oddziaływać hydrofobowo z hydrofobowymi regionami białek. Dlatego ważne jest, aby usunąć związki fenolowe tak szybko, jak to możliwe i najlepiej to osiągnąć stosując Adsorbenty, które wiążą się z fenolami lub chinonami lub stosując środki ochronne, takie jak boran, germanian, siarczyny i merkaptobenzotiazol, które hamują aktywność oksydazy fenolowej. Do podłoża izolacyjnego można dodać adsorbent fenolowy, poliwinylopirolidon w postaci rozpuszczalnej w wodzie lub jako silnie usieciowany nierozpuszczalny produkt „Polyclar”. Poliwinylopirolidon wiąże te związki fenolowe, które tworzą silne wiązania wodorowe z białkami. Stwierdzono również, że albumina surowicy bydlęcej reaguje z fenolami roślinnymi, a także jest skutecznym zmiataczem chinonów.
frakcjonowanie komórek lub tkanek jest niezmiennie wykonywane w temperaturze +4°c w celu zmniejszenia aktywności proteaz błonowych. Proteazy można podzielić na endopeptydazy i egzopeptydazy. Endopeptydazy, które są enzymami, które rozszczepiają wewnętrzne wiązania peptydowe, obejmują: kwaśne proteazy o optymalnym pH pH 2,5–3,8 i mogą być hamowane przez pepstatynę inhibitora stanu przejściowego; proteazy serynowe, które mogą być hamowane przez diizopropylofluorofosforan i fenylometylosulfonylofluorek; oraz proteazy sulfhydrylowe, które są hamowane przez N-etylomaleimid lub e-64 (L-Trans-epoksysukcyno-leucyloamid-Butan). Przykłady egzopeptydaz obejmują karboksypeptydazy, które są obecne w większości tkanek roślinnych i łatwo hydrolizują większość C-końcowych aminokwasów. Wszystkie dotychczas badane karboksypeptydazy roślin są hamowane przez diizopropylofluorofosforan. U roślin zidentyfikowano również aminopeptydazy, dipeptydazy i tripeptydazy. Inne związki stosowane w mediach homogenizacyjnych obejmują środki redukujące dwusiarczki, takie jak 2-merkaptoetanol, ditiotreitol, ditioerytrytol, Zredukowany glutation lub cysteina. Dzieje się tak, ponieważ wiele enzymów zawiera istotną grupę sulfhydrylową, która musi pozostać zredukowana w celu utrzymania aktywności enzymu. Wiele problemów izolacji organelli wiąże się z pękaniem delikatnych błon, na przykład tonoplast otaczający wakuolę. Oprócz fizycznego niszczenia tych błon, tkanki roślinne zawierają aktywne enzymy lipolityczne, które mogą bezpośrednio atakować lipidowe składniki błon i zakłócać organelle. Wolne kwasy tłuszczowe uwalniane w wyniku hydrolitycznego działania hydrolaz acylowych mogą hamować aktywność ATPazy mitochondriów, chloroplastów i błon osoczowych. Inne szkodliwe działanie kwasów tłuszczowych są również dobrze ugruntowane. Istnieją pewne warunki, które mogą zmniejszyć rozpad lipidów przez lipazy i lipolityczne hydrolazy acylowe w roślinach. Obejmują one zastosowanie (1) podłoża izolacyjnego o pH 7.5-8, przy których większość enzymów lipolitycznych i lipooksygenaz wykazuje niewielką aktywność, (2) czynniki chelatujące, takie jak EDTA, ponieważ wiele fosfolipaz jest zależnych od Ca2+; wiele enzymów lipolitycznych nie ma jednak wpływu na czynniki chelatujące i (3) Inne dodatki, takie jak przeciwutleniacze, aby zapobiec oksydacyjnemu rozkładowi hydroperoksydów kwasów tłuszczowych, środki redukujące dwusiarczki, specyficzne inhibitory enzymów i zastosowanie wolnej od kwasów tłuszczowych albuminy surowicy bydlęcej, która wiąże wolne kwasy tłuszczowe. Każde podłoże homogenizacyjne jest INNE i może zawierać swoiste inhibitory enzymów, takich jak fosfolipazy lub Fos-fatazy. Na przykład glicerol jest często dodawany do podłoża izolacyjnego w celu zahamowania fosfatazy kwasu fosfatydowego. Etanoloamina i chlorek choliny są powszechnie stosowane do hamowania fosfolipazy D.
zdolność buforowania podłoża homogenizacyjnego do frakcjonowania komórek roślinnych musi być wysoka, aby zrównoważyć uwalnianie kwasów organicznych przez zaburzoną wakuolę, która stanowi znaczną objętość komórki. Pożywkę homogenizacyjną można sformułować na podstawie oceny empirycznej lub racjonalnej analizy. Na przykład, w celu zapewnienia, że odpowiednie oczyszczone białko pozostaje nienaruszone, wszystkie główne inhibitory proteaz mogą być dodane do podłoża homogenizacyjnego lub alternatywnie można skopiować roztwory fizjologiczne. Ponieważ pH cytoplazmatyczne komórki roślinnej wynosi około 7,5-8,0, podłoże homogenizacyjne powinno odzwierciedlać stan fizjologiczny komórki i dlatego jest słabo buforowane do pH cytoplazmatycznego.