uproszczone testy ChIP-exo

przeciwciała

królicze IgG (Sigma) sprzężone z Dynabeadami stosowano przeciwko szczepom oznaczonym TAP, w których Tap-tag zawierający białko a był celem. Przeciwciała Millipore 07-729 zastosowano przeciwko próbkom k562 ukierunkowanym na CTCF.

oczyszczanie Tn5

zamówiono niestandardową konstrukcję Tn5 E54k E110K P242A L372P14 w wektorze pET-45b ( + ) (GenScript), aby wyrazić hiperaktywny Tn5 za pomocą N-końcowego znacznika His6. Plazmid jest dostępny pod adresem Addgene (Addgene ID: 112112). Bl21 (DE3) właściwe komórki E. coli (New England Biolabs) przekształcono i pojedynczą kolonię hodowano w temperaturze 37 °C do OD600 0,4 W 500 ml LB + 50 µg / ml ampicyliny + 30 µg/ml chloramfenikolu. Komórki przeniesiono do inkubatora w temperaturze 25 °C i indukowano 0,5 mM izopropylo-β-D-galaktopiranozydem przez 4 godziny. komórki zebrano przez odwirowanie, przemyto raz buforem ST, a osad komórkowy zamrożono w ciekłym azocie.

Tn5 oczyszczono zgodnie z opisem poprzednio opisanym10, z niewielkimi modyfikacjami. Krótko mówiąc, komórki zawieszono w 10 objętościach (ml/g) buforu Tegx100 (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolu, 0,1% Triton-X 100) zawierającego CPI i fluorek fenylometylosulfonylu 100 µM i lizowano przez inkubację z lizozymem (Sigma; 1 mg / 1 g granulki komórkowej) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Lizat odwirowywano w temperaturze 20 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a supernatant wytrącano z 0,25% polietylenoiminy (Sigma) i odwirowywano w temperaturze 10 000 × g przez 15 minut. Supernatant wytrącono 47% nasyconym siarczanem amonu (0.28 g/ml) przez 30 minut inkubacji, a następnie odwirowywano w temperaturze 20 000 × g przez 15 minut.

pellet ponownie zawieszono w 50 ml buforu o powinowactwie niklowym (50 mM fosforanu potasu, pH 7,4, 50 mM KCl, 20% glicerolu) i załadowano na kolumnę HisTrap HP (GE Healthcare; 5 ml) z prędkością 1,5 ml/min zrównoważoną tym samym buforem. Kolumnę przemyto kolejno buforem płuczącym I (50 mM fosforan potasu, pH 7,4, 1 m KCl, 50 mm imidazol, 20% glicerol), buforem płuczącym II (50 mM fosforan potasu, pH 7.4, 500 mM KCl, 50 mM imidazol, 20% glicerol), a następnie TN5 eluowano buforem Eluującym powinowactwo do niklu (50 mM fosforan potasu, pH 7,4, 500 mM KCl, 500 mm imidazol, 20% glicerol) przy 2 ml/min. Eluat rozcieńczono do 300 mM KCl buforem rozcieńczającym (50 mM fosforan potasu, pH 7,4, 20% glicerol), a końcową objętość skorygowano do 50 ml buforem TEGX300 (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerol, 0,1% Triton-X 100).

następnie próbkę załadowano do kolumny heparyny HiTrap HP (GE Healthcare; 1 ml) równoważonej TEGX300 z prędkością 1 ml / min. Po umyciu 5 kolumnowymi objętościami buforu przeprowadzono liniowy gradient NaCl o pojemności 10 ml (od 300 mM do 1,2 M) w celu wymywania. Tn5 eluowane z kolumny przy około 600 mM NaCl. Frakcje zawierające główny pik elucyjny połączono (3,5 ml) i dializowano przez noc z buforem tegx300 zawierającym 30% glicerolu, a następnie przechowywano w temperaturze -80 °C.

preparat chromatyny drożdżowej

szczepy Saccharomyces cerevisiae (Open Biosystems) hodowano w 500 ml pożywek dekstrozowych peptonu drożdżowego do OD600 = 0,8 w temperaturze 25 °C. Komórki usieciowano formaldehydem w końcowym stężeniu 1% przez 15 minut w temperaturze pokojowej i hartowano w końcowym stężeniu 125 mM glicyny przez 5 minut. Komórki zebrano przez odwirowanie i przemyto w 1 ml buforu ST (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) w temperaturze 4 °C i podzielono na dwie porcje. Komórki ponownie granulowano, supernatant usunięto, a pellet zamrożono.

250 ml pożywki lizowano w 750 µl buforu Lizy FA (50 mm Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% deoksycholanu sodu i CPI) i 1 ml objętości 0,5 mm koralików cyrkoniowo-krzemionkowych przez ubijanie koralików w maszynie Mini-Beadbeater-96 (Biospec) przez trzy cykle 3-minutowych cykli włączania/5-minutowego wyłączania (próbki trzymano w lodzie podczas cyklu wyłączania). Lizat przeniesiono do nowej probówki i mikrocentryfikowano z maksymalną prędkością przez 3 minuty w temperaturze 4 °c w celu granulowania chromatyny. Supernatant odrzucono, a osad ponownie zawieszono w 750 µl buforu Lizy FA uzupełnionego 0,1% SDS i przeniesiono do 15 ml polistyrenowej rurki stożkowej. Próbkę następnie sonikowano w Bioruptorze (Diagenode)przez 15 cykli z interwałami włączania/wyłączania 30 s w celu uzyskania fragmentów DNA o wielkości od 100 do 500 bp. W jednym teście ChIP-exo przetworzono równowartość 50 ml hodowli komórkowej (~6 × 108 komórek). Oznacza to wygodną kwotę, a nie minimalną wymaganą kwotę.

preparat chromatyny K562

ludzkie komórki przewlekłej białaczki szpikowej (K562, ATCC) utrzymywały się między 1 × 105 A 1 × 106 komórek/ml w pożywce dmem uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Komórki przemyto PBS (8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl i 2,7 mM KCl), następnie usieciowano z formaldehydem w końcowym stężeniu 1% przez 10 minut w temperaturze pokojowej i hartowano w końcowym stężeniu 125 mm glicyny przez 5 minut. Supernatant usunięto, a komórki ponownie zawieszono w 1 ml PBS do przemywania. Komórki podzielono tak, aby zawierały 100 milionów komórek, odwirowano, supernatant usunięto, a pellet zamrożono.

lizowano 100 milionów komórek (do stosowania w wielu chipach) w 500 µl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0.5% NP40 i kompletny inhibitor proteazy (CPI, Roche)) przez inkubację na lodzie przez 10 minut. Lizat poddano mikrokrążeniu przy 2500 obr. / min przez 5 minut w temperaturze 4 °C. supernatant usunięto, osad ponownie zawieszono w 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,32% SDS i CPI) i inkubowano na lodzie przez 10 minut w celu lizy jąder. Próbkę rozcieńczono 600 µl buforu rozcieńczania immunoprecypitacji (Bufor rozcieńczania IP: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 i CPI) do końcowego stężenia (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-X 100, 0.2% SDS i CPI) i sonikowane Bioruptorem (Diagenode)przez 10 cykli z 30-sekundowymi przerwami włączania/wyłączania w celu uzyskania fragmentów DNA o wielkości od 100 do 500 bp.

przygotowanie tkanki myszy

16-tygodniowy dorosły męski mózg, płuca, wątroba i nerki zostały hojnie dostarczone przez dr Yanming Wang tkanki myszy przetwarzano w dawce 100 mg i generowano chromatynę, jak poprzednio opisano21 z niewielkimi modyfikacjami. Krótko mówiąc, 100 mg tkanki myszy mielono na kawałki na lodzie, utrwalano 1% formaldehydem przez 10 minut, a następnie hartowano w końcowym stężeniu 125 mM glicyny przez 5 minut. Komórki przędzono, przemyto PBS, a następnie ponownie zawieszono w 1 mL zimnego buforu do lizy komórek Farnhama (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 i CPI). Następnie komórki inkubowano na rototorce przez 20 minut w temperaturze 4 ° C. wyizolowane jądra wyizolowano przez spun down i zawieszono w buforze rozpadu jądrowego RIPA (1 × PBS, 1% NP-40, 0,5% Nadeoksycholanu, 0,5% SDS i CPI). Jądra następnie sonikowano za pomocą Bioruptora (Diagenode) przez 10 cykli z 30-sekundowymi interwałami włączania/wyłączania w celu wytworzenia DNA w zakresie wielkości 100-500 bp. Liczbę komórek wątroby oszacowano zgodnie z wcześniej opisanym22, stosując Współczynnik konwersji 1 mg mokrej masy tkanki równy ~250 000 komórek.

immunoprecypitacja chromatyny

50 ml ekwiwalentu posiewu drożdży lub 10 milionów ekwiwalentu komórkowego chromatyny k562 rozcieńczono do 200 µl buforem rozcieńczającym IP i inkubowano przez noc w temperaturze 4 °c z odpowiednim przeciwciałem. Do próbek drożdży Dodano 10 µl złoża IgG-Dynabeads; do próbek k562 Dodano 3 µg przeciwciała anty-CTCF z 10 µl zawiesiny równoważnika białka a Mag Sepharose (GE Healthcare).

ChIP-exo 1.1

Chip-exo 1.1 został wykonany jak poprzednio opisane7,8,23. W skrócie, następujące etapy enzymatyczne przeprowadzono z immunoprecypitowaną chromatyną nadal na żywicy z wieloma płukaniami solnymi między każdym etapem: Polinukleotydowa kinaza T4, fragment a-tailing klenow, ligaza adaptera Read_2 mediowana przez ligazę DNA T4, wypełnienie polimerazy DNA fi29, druga kinaza polinukleotydowa T4, trawienie egzonukleazy lambda i trawienie egzonukleazy RecJf. Po całonocnym odwrotnym usieciowaniu i leczeniu Proteinazą K, przeprowadzono następujące etapy w roztworze: rozszerzenie startera phi29, drugie ogonowanie fragmentu A Klenowa, ligazowanie adaptera Read_1 za pośrednictwem ligazy DNA T4 i PCR.

ChIP-exo 3.0 i 3.1 (wersja oparta na tagmentacji)

po immunoprecypitacji przeprowadzono następujące kroki na żywicy. W celu złożenia Transposazy, Tn5 inkubowano w mieszaninie 10 × Transposazy zawierającej następujące składniki i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej: 12,5 µM Tn5, 50% glicerolu i 7,5 µM adaptera (NexA2 / ME comp). Patrz dodatkowa Tabela 1 dla sekwencji oligonukleotydowych stosowanych w tym badaniu.

Materiał wiórowy na żywicy przemyto kolejno buforem Lizy FA, buforem NaCl (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% deoksycholanu sodu), Bufor LiCl (100 mm Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 1% deoksycholanu sodu) i 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 w temperaturze 4 °C.

reakcja tagmentacji (30 µl) zawierająca: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% dimetyloformamidu i 1 × mieszaninę znaczników z etapu 1 (stężenie końcowe: 1,25 µm TN5, 5% glicerolu, adapter 750 Nm) inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji żywicę przemyto dwukrotnie buforem chlorowodorku guanidyny (50 mm tris-hcl, pH 7,5, 500 mm chlorowodorku guanidyny, 2 mm EDTA, 1% Triton-X 100, 0.

reakcję wypełnienia (30 µl) zawierającą: 10 U polimerazy phi29 (NEB), 1 × bufor reakcji phi29 (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA i 165 µM dNTPs inkubowano przez 20 minut w temperaturze 30 °C. C; następnie przemyto 10 mm tris-HCL, pH 8,0 w 4 °C. reakcję kinazy (30 µl) zawierającą: 10 U T4 PNK (Neb), 1 × T4 Bufor ligazy DNA (neb) i 2 × BSA inkubowano przez 15 minut w 37 °C; następnie przemyto 10 mm tris-HCL, PH 8,0 w 4 °C. trawienie egzonukleazy λ (100 µl) zawierające: 20 U λ exonuclease (NEB), 1 × λ exonuclease Reaction buffer (NEB), 0,1% Triton-X 100 i 5% DMSO inkubowano przez 30 minut w 37 °C; następnie przemyto 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 w 4 °C. trawienie egzonukleazy RecJf (100 µl) zawierające: 75 U Egzonuclease RecJf (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0,1% Triton-X 100 i 5% DMSO inkubowano przez 30 minut w 37 °C; następnie przemyto 10 mm tris-Hcl, Ph 8,0 w 4 °C.

DNA eluowano z żywicy i przeprowadzono odwrotne sieciowanie i obróbkę proteinazą k (40 µl) zawierającą: 30 µg proteinazy k, 25 mm tris-Hcl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl i 0,5% SDS inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 65 °C. supernatant następnie przeniesiono do nowej probówki i oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych Agencourt AMPure (Beckman Coulter) zgodnie z instrukcjami producenta i przy użyciu 1,8 × objętości zawiesiny AMPure dodawanej do objętości DNA (72 µl).Próbkę eluowano z perełek AMPure w 10 µl wody i w roztworze przeprowadzono następujące etapy enzymatyczne.

ligacja adaptera (Wersja 3.0): Dla reakcji rozszerzenia podkładu (całkowita objętość reakcji 20 µl); do wymieszanej próbki Dodano 1 × bufor reakcyjny phi29, 2 × BSA, 100 µM dNTPs i 0,5 µM OLIGONUKLEOTYD sekwencji ME (łącznie 9 µl) i inkubowano przez 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie 10 minut w temperaturze 45 °C, aby czas oligo mógł się wyżarzać. Próbkę przesunięto do temperatury 30 °C przed dodaniem 10 U polimerazy phi29 (1 µl) i inkubowano przez 20 minut w temperaturze 30 °C; następnie przez 10 minut w temperaturze 65 ° C w celu inaktywacji i przesunięto do temperatury 37 °C.

dla reakcji a-tailing (całkowita objętość reakcji 30 µl); do reakcji przedłużania startera Dodano 10 U fragmentu Klenowa, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (łącznie 10 µl) i inkubowano przez 30 minut w 37 °C, następnie przez 20 minut w 75 °C w celu inaktywacji i przesunięto do 25 °C. Dla drugiej reakcji ligacji adaptera (całkowita objętość reakcji 40 µl); do reakcji a-tailing dodano 2000 u ligazy DNA T4 (enzymatyki), 1 × bufor szybkiego ligowania nebnext (neb), adapter 375 nm (exa1-58/13) i inkubowany przez 1 h w temperaturze 25 °C.

ligacja szyny (Wersja 3.1): Dla ligacji adaptera (40 µl); do wymieszanego DNA dodano ligazę 1200 U T4 DNA, Bufor ligazy 1 × T4 DNA, adapter 375 nM (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.

zarówno w wersji 3.0, jak i 3.1: reakcję ligacji oczyszczono za pomocą kulek AMPure i wymieszano w 15 µl wody. Następnie próbkę Amplifikowano za pomocą PCR. Do amplifikacji PCR (całkowita objętość reakcji 40 µl); do wymieszanego DNA Dodano 2 U Phusion Hot Start polymerase (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM każdy Starter (P1.3 i NexA2-iNN) i Amplifikowano przez 18 cykli (20 s przy denaturze 98 °C, 1 min przy wyżarzaniu 52 °C i 1 min przy przedłużeniu 72 °C). Jedną czwartą reakcji Amplifikowano przez dodatkowe sześć cykli (łącznie 24), a obecność bibliotek oznaczono elektroforezą na 2% żelu agarozowym.

wybór wielkości: 200-500 bp produktów PCR oczyszczono w żelu z 2% żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick (Qiagen).

ChIP-exo 4.0 i 4.1 (wersje ligacji jednoniciowej DNA)

po immunoprecypitacji przeprowadzono następujące kroki na żywicy. Materiał wiórowy na żywicy przemyto kolejno buforem Lizy FA, buforem NaCl, buforem LiCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 w temperaturze 4 °C. reakcję końcowej naprawy (50 µl) zawierającą: polimerazę DNA 7,5 U T4 (NEB), polimerazę DNA 2,5 U i (NEB), 25 U T4 PNK, Bufor ligazy DNA 1 × T4 i 390 µM dNTPs inkubowano przez 30 minut w temperaturze 12 °C; następnie przemyto 10 mM tris-HCL, pH 8,0 w 4 °C. trawienie egzonukleazy λ (100 µl)zawierające: 20 u egzonukleazy λ, 1 × Bufor reakcji egzonukleazy λ, 0,1% Triton-X 100 i 5% DMSO inkubowano przez 30 minut w 37 °C; następnie przemyto 10 mm tris-hcl, pH 8.0 W 4 °C. trawienie egzonukleazy RecJf (100 µl)zawierające: 75 U egzonukleazy RecJf, 2 × NEBuffer 2, 0,1% Triton-X 100 i 5% DMSO swas inkubowano przez 30 minut w 37 °C; następnie przemyto 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 w 4 °C.

pierwsze ligowanie adaptera: ligacja ssDNA (Wersja 4.0, 40 µl): do ligacji adapterionu Ligazę 1200 U T4 dna, Bufor ligazy 1 × T4 dna i adapter jednoniciowy o długości 375 nm (Exa1-58-N5) inkubowano przez 1 h W temperaturze 25 °C; następnie przemyto 10 mm tris-hcl, pH 8,0 w temperaturze 4 °C.

ligacja szyn (Wersja 4.1, 40 µl): 1200 U ligazy DNA T4, Bufor ligazy DNA 1 × T4 i adapter 375 nM (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) inkubowano przez 1 h w temperaturze 25 °C; następnie przemyto 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 w temperaturze 4 °C.

obie wersje 4.0 i 4.1: DNA eluowano z żywicy i przeprowadzono odwrotne usieciowanie i leczenie Proteinazą K (40 µl) zawierający: 30 µg proteinazy K, 25 mm Tris-Hcl, pH 7,5, 2 mm EDTA, 200 mm NaCl i 0,5% SDS inkubowany przez 16 h w temperaturze 65 °C.

supernatant został następnie przeniesiony do nowej probówki i oczyszczony za pomocą kulek magnetycznych Agencourt AMPure (Beckman Coulter) zgodnie z instrukcjami producenta (1,8 × objętość). Próbkę eluowano z kulek AMPure w 20 µl wody i w roztworze przeprowadzono następujące etapy enzymatyczne.

drugie ligowanie adaptera: ligacja ssDNA (Wersja 4.0, całkowita objętość reakcji 40 µl): do wymieszanego DNA dodano ligazę 1200 U T4 DNA, Bufor ligazy 1 × T4 DNA, adapter 375 nM (ExA2. 1-N5 / ExA2.1-20) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.

ligacja adaptera szyny (Wersja 4.1, całkowita objętość reakcji 40 µl): do wymieszanego DNA dodano ligazę 1200 U T4 DNA, Bufor ligazy 1 × T4 DNA, adapter 375 nM (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.

zarówno Wersja 4.0, jak i 4.1: reakcję ligacji oczyszczono za pomocą kulek ampure (1,8 × objętość) i wymieszać w 15 µl wody. Następnie próbkę Amplifikowano za pomocą PCR. Do amplifikacji PCR (całkowita objętość reakcji 40 µl); do wymieszanego DNA Dodano 2 U Phusion Hot Start polymerase( Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM każdy Starter (P1.3 i NexA2-iNN) i Amplifikowano przez 18 cykli (20 s przy denaturze 98 °C, 1 min przy wyżarzaniu 52 °C, 1 min przy przedłużeniu 72 °C). Jedną czwartą reakcji Amplifikowano przez dodatkowe sześć cykli (łącznie 24), a obecność bibliotek oznaczono elektroforezą na 2% żelu agarozowym. Wybór wielkości: 200 do 500 bp produktów PCR oczyszczono w żelu z 2% żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick (Qiagen).

Uwaga: ChIP-exo 4.0 / 4.1 zawiera Uniwersalny adapter Read_2, z kodem kreskowym dodanym później podczas PCR z długimi podkładami. Ilekroć długie startery PCR były używane w konstrukcji biblioteki, która wymagała trawienia egzonukleazy lambda, biblioteki cierpiały na niską wydajność i wysokie dimery adaptera. Teraz używamy tylko adapterów pełnej długości i podkładów PCR o minimalnej długości.

ChIP-exo 5.0

po immunoprecypitacji przeprowadzono następujące kroki na żywicy. Materiał wiórowy na żywicy przemyto kolejno buforem Lizy FA, buforem NaCl, buforem LiCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 w 4 °C. Dla reakcji a-tailing (50 µl) zawierającej: 15 U Fragment Klenow,- exo (NEB), 1 × NEBuffer 2 i 100 µM dATP inkubowano przez 30 minut w 37 °C; następnie przemyto 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 w 4 °C. Pierwsze podwiązanie adaptera i reakcje kinazy (45 µl) zawierające: Ligazę DNA 1200 U T4, PNK 10 u T4, bufor szybkiej ligacji 1 × nebnext i adapter 375 nm (exa2_inn / exa2b) inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C, następnie przemyto 10 mm Tris-HCL, pH 8,0 w temperaturze 4 °C. Reakcję wypełniającą (40 µl) zawierającą: 10 u polimerazy phi29, 1 × bufor reakcyjny phi29, 2 × BSA i 180 µM dNTPs inkubowano przez 20 minut w temperaturze 30 °C; następnie przemyto 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 w temperaturze 4 °C. trawienie egzonukleazy λ (50 µl) zawierające: 10 u egzonukleazy λ, 1 × bufor reakcji egzonukleazy λ, 0,1% Triton-X 100 i 5% DMSO inkubowano przez 30 minut w 37 °C; następnie przemyto 10 mm tris-HCL, pH 8,0 w 4 °C.

DNA eluowano z żywicy i przeprowadzono odwrotne usieciowanie i obróbkę Proteinazą K (40 µl) zawierającą: 30 µg proteinazy K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl i 0,5% SDS inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 65 °C. supernatant następnie przeniesiono do nowej probówki i oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych Agencourt AMPure (Beckman Coulter) zgodnie z instrukcjami producenta (1,8 × objętość).Próbkę eluowano z kulek AMPure w 20 µl wody i w roztworze przeprowadzono następujące etapy enzymatyczne. Dla drugiego podwiązania adaptera (całkowita objętość reakcji 40 µl): do wymieszanego DNA dodano ligazę 1200 U T4 DNA, Bufor ligazy 1 × T4 DNA, adapter 375 nM (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C. Następnie reakcję ligacji oczyszczono kulkami AMPure (1,8 × objętość) i wymieszano w 15 µl wody.

próbka została następnie amplifikowana za pomocą PCR. Do amplifikacji PCR (całkowita objętość reakcji 40 µl); do wymieszanego DNA Dodano 2 U Phusion Hot Start polymerase (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM każdy Starter (P1.3 i P2.1) i Amplifikowano przez 18 cykli (20 s przy denaturze 98 °C, 1 min przy wyżarzaniu 52 °C, 1 min przy przedłużeniu 72 °C). Jedną czwartą reakcji Amplifikowano przez dodatkowe sześć cykli (łącznie 24), a obecność bibliotek oznaczono elektroforezą na 2% żelu agarozowym. Wybór wielkości: 200 do 500 bp produktów PCR oczyszczono w żelu z 2% żelu agarozowego za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick (Qiagen).

Uwaga: odkryliśmy, że zastosowanie metody innej niż oczyszczanie żelem na tym etapie prowadzi do niedopuszczalnie wysokiego poziomu dimerów adaptera w próbce końcowej. Oczyszczanie żelu może skutecznie oddzielić dimer adaptera (fragment 150 bp) i mniejsze fragmenty Biblioteki ChIP-exo (fragment 200 bp = Adaptery 150 bp + wkładka 50 bp).

sekwencjonowanie DNA

sekwencjonowanie DNA o wysokiej przepustowości przeprowadzono przy użyciu NextSeq 500 w trybie sparowanym, wytwarzając odczyty 2 × 40 bp. Odczyty sekwencji zostały następnie dopasowane do genomów drożdży (sacCer3) i ludzi (hg19) przy użyciu bwa-mem (v0.7.9 a)24. Wyrównane odczyty były filtrowane w celu usunięcia nie unikalnych wyrównań i duplikatów PCR. Duplikaty PCR definiowano jako odczyty sekwencji posiadające identyczne sekwencje Read_1 i Read_2.

dostępność danych

wszystkie pliki sekwencjonowania i pliki szczytowe z tego badania są dostępne w NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pod numerami akcesyjnymi GSE110681 i GSE114606. Pliki współrzędnych, parametry skryptu i niestandardowy kod używany do generowania liczb dla tego artykułu można pobrać z: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.

wszystkie inne dane są dostępne od autorów na uzasadnione żądanie.