w tym filmie zobaczysz, jak wykonać test uwalniania chromu i określić potencjał cytotoksyczny komórek efektorowych.
komórki odpornościowe są odpowiedzialne za identyfikację i usuwanie potencjalnie szkodliwych komórek, takich jak komórki nowotworowe lub zakażone wirusem, z organizmu, co jest integralną częścią odpowiedzi immunologicznej. Wiele komórek odpornościowych, takich jak komórki T i komórki NK, posiada właściwość znaną jako potencjał cytotoksyczny, czyli zdolność do identyfikacji komórek docelowych i wydzielania białek, które indukują degradację białek, lizę i śmierć tych komórek docelowych. Kwantyfikacja potencjału cytotoksycznego ma kluczowe znaczenie dla pomiaru aktywacji i siły działania komórek odpornościowych, w tym celu powszechnie stosuje się test uwalniania chromu.
ta metoda umożliwia użytkownikom porównanie cytotoksyczności indukowanej przez określone typy komórek odpornościowych w różnych warunkach, co jest cenne w badaniach immunoterapii nowotworów i chorób związanych z odpornością. Na początek komórki docelowe, podobnie jak komórki nowotworowe, inkubuje się z radioaktywnym izotopem chromu 51, który jest pobierany przez komórki. Następnie, te znakowane radiowo komórki są współwystępowane z wyizolowanymi komórkami odpornościowymi, zwanymi również komórkami efektorowymi, W okrągłym dnie, 96-studzienkowej płytce, aby ułatwić interakcję między dwoma typami komórek.
ogólna konfiguracja testu obejmuje inkubację określonej liczby komórek docelowych o różnych stężeniach komórek odpornościowych, wraz z odpowiednimi kontrolami. Współkultura pozwala komórkom efektorowym na indukcję apoptozy i lizy w komórkach docelowych, co skutkuje uwolnieniem wewnątrzkomórkowego chromu 51 do supernatantu. Następnie, w preoptymizowanym punkcie czasowym, supernatant zawierający uwolniony chrom jest zbierany ze wszystkich studni. Chrom 51, będąc radioaktywnym, spontanicznie ulega rozpadowi promieniotwórczemu, emitując promieniowanie gamma. Poziomy promieniowania gamma w supernatantach ze wszystkich studzienek w płytce testowej reprezentują wymierny wynik lizy komórek docelowych. Jest to mierzone za pomocą licznika gamma, który jest następnie używany do określenia potencjału cytotoksycznego komórek odpornościowych.
aby rozpocząć, komórki docelowe, ludzka linia komórkowa czerniaka WM793 w tym przykładzie, są przygotowywane do zawiesiny pojedynczej komórki. Aby to zrobić, najpierw usuń pożywkę z kolby do hodowli tkankowej i umyj komórki pięcioma mililitrami 1x PBS. Odcedzić PBS, a następnie dodać jeden mililitr trypsyny do płytki na około dwie minuty. Delikatnie stuknij kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni kolby, a następnie dodaj pięć mililitrów mediów RPMI do kolby. Pipety mediów w górę iw dół, aby zebrać komórki i dodać tę zawiesinę do 15 mililitr stożkowej rurki.
umieść rurkę w wirówce na pięć minut przy 1200 obr. / min. Następnie wyjmij media z rurki, upewniając się, że nie zakłócają granulki komórek. Delikatnie przesuń dno rurki, aby zakłócić osad komórkowy i dodaj 10 mililitrów mediów do rurki. Następnie delikatnie pipetować media w górę i w dół, aby doprowadzić komórki do zawiesiny. Następnie określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru i przenieś dwa mililitry pierwotnej zawiesiny komórkowej do nowej 15 mililitrowej stożkowej rurki. Umieść rurkę w wirówce i granuluj komórki przy 1200 obr. / min przez pięć minut. Po odwirowaniu nadmiar mediów wylać z rurki do pojemnika na odpady. Krótko wirować rurkę, aby wymieszać osad komórkowy w małej objętości pozostawionej pożywki.
następnie przygotuj się do użycia Chromium 51, przenosząc się do laboratorium poświęconego tej konkretnej radioaktywności. Należy zapewnić wystarczającą osłonę ołowianą dla bezpiecznego przechowywania i użytkowania chromu 51 na wszystkich etapach, a także odpowiednie oznakowanie wskazujące, gdzie przechowywane są próbki chromu 51. Licznik Geigera wyposażony w sondę naleśnikową jest również niezbędny do serwowania w przestrzeni w celu ewentualnego zanieczyszczenia.
po skonfigurowaniu do właściwego stosowania radioaktywności, dodać 100 mikrocząsteczek chromu 51 bezpośrednio do zawiesiny komórki docelowej. Następnie dodaj mały kawałek taśmy radioaktywnej do probówki, aby wskazać, że próbka i probówka są teraz radioaktywne. Umieść probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z ołowianą osłoną i inkubuj przez godzinę, przesuwając probówkę co 15 do 20 minut.
podczas znakowania komórek docelowych przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek efektorowych. W tym przykładzie mono-jądrowe komórki ludzkiej krwi obwodowej lub Pdmc wyizolowano z krwi pełnej przez standardowe odwirowanie gradientu gęstości do stężenia 5 razy 10 do 6. Przenieść zawiesinę komórki efektorowej do jednorazowego zbiornika odczynnika, a następnie dodać 200 mikrolitrów tej zawiesiny do każdej studzienki rzędu B W 96-studzienkowej płytce z okrągłym dnem. Następnie dodaj 100 mikrolitrów RPMI do każdej studzienki w wierszu C przez G płytki.
teraz, rozpocząć wykonywanie seryjnych rozcieńczeń PBMC, aby uzyskać Zakres liczby komórek efektorowych, najpierw usuwając 100 mikrolitrów komórek w studzienkach w wierszu B i dodając to do wiersza C. Następnie dalej rozcieńczyć komórki efektorowe, przenosząc 100 mikrolitrów komórek z wiersza C do wiersza D. kontynuować seryjne rozcieńczenie. Gdy rząd G zostanie osiągnięty, przesuń 100 mikrolitrów ze studni, aby pozostawić końcową objętość 100 mikrolitrów w każdej studni w tym rzędzie. Następnie dodać 100 mikrolitrów pożywki do hodowli tkankowej do studzienek w wierszu A, aby służyć jako kontrola spontanicznego uwalniania chromu 51 z komórek docelowych, ponieważ do tego wiersza nie należy dodawać komórek efektorowych. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki docelowe będą gotowe do dodania.
po okresie inkubacji usunąć komórki docelowe z inkubatora i przemyć 5 mililitrami FBS, aby usunąć nadmiar chromu 51. Następnie umieść rurkę w wyznaczonej wirówce i wiruj z prędkością 1200 obr. / min przez 5 minut. Usunąć radioaktywny FBS wash do odpowiedniego pojemnika na odpady i powtórzyć etap mycia, mieszając osad w świeżych 5 mililitrach FBS. Umieść rurkę w wyznaczonej wirówce i ponownie obracaj ogniwa przy 1200 obr. / min przez 5 minut. Usunąć drugie płukanie i sprawdzić, czy osad nie zawiera radioaktywności za pomocą licznika Geigera. Na koniec, wymieszać osad w 10 mililitrach kompletnego pożywki i wlać zawiesinę komórek docelowych oznaczoną chromem 51 do jednorazowego zbiornika odczynnika. Następnie dodaj 100 mikrolitrów tych oznaczonych komórek docelowych do każdej studzienki płytki komórek efektorowych z 96 studzienkami. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 1% NP-40 w wodzie do studni w wierszu H, aby zsynchronizować wszystkie komórki docelowe w każdym wierszu. Studzienki te będą używane jako kontrola do określenia całkowitej liczby na minutę lub cpm.
teraz, gdy płyta jest przygotowana, zabezpiecz pokrywę, dodając mały kawałek taśmy z każdej strony płyty i umieść na pokrywie kawałek taśmy radioaktywnej, aby wskazać, że zawiera chrom 51. Następnie umieść płytkę w wirówce oznaczonej do obsługi próbek radioaktywnych. Jeśli używana jest tylko jedna płytka doświadczalna, dodaj płytkę równoważącą do wirówki. Ustaw wirówkę na 1200 obr. / min i przyspiesz talerz. Po osiągnięciu prędkości zatrzymaj maszynę. Wyjąć płytkę z wirówki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z małym kawałkiem ołowiu osłaniającym płytkę dla dodatkowego bezpieczeństwa. Inkubować przez 16 godzin, aby umożliwić komórkom docelowym lyse.
pod koniec okresu inkubacji ostrożnie usuń taśmę wokół krawędzi płytki i zdejmij pokrywę. Następnie umieść ramę do zbioru na płycie, upewniając się, że małe tarcze filtracyjne są na miejscu dla każdej z bawełnianych zatyczek. Teraz powoli i delikatnie wciśnij bawełniane zatyczki do studni. Po około dziesięciu sekundach zwolnij nacisk na zatyczki bawełniane, a następnie przenieś zatyczki bawełniane na paski rurki. Umieść każdą z tych rur do wtórnej rury FACS. Na koniec załaduj rury FACS na licznik gamma i uruchom próbki, aby określić ilość chromu 51 uwolnionego w każdym stanie. Dokładnie Zapisz kolejność, w jakiej rury zostały załadowane do lady.
tutaj unstimulated PBMC zostały dodane do pierwszych 3 pasów, a stymulowane CPG pmbc zostały dodane do pasów od 4 do 6. W tym przykładzie liczby na minutę wprowadzono do komórek arkusza kalkulacyjnego w taki sam sposób, w jaki próbki zostały ułożone na oryginalnej płytce i obliczono średnie z triplikatów. Na przykład dla pierwszego warunku komórki A1, A2 i A3 uśredniono w komórce i3. Po określeniu średnich procent właściwej lizy dla każdego warunku można obliczyć za pomocą tego wzoru. Na przykład, aby obliczyć procentową specyficzną lizę dla niestymulowanych komórek, które miały stosunek 50 do 1 komórek efektorowych do komórek docelowych, spontaniczny CPM, który w tym przykładzie wynosi 1164,67, został odjęty od eksperymentalnego CPM, 1129. 67. Liczbę tę można następnie podzielić przez różnicę między maksymalnym CPM a spontanicznym CPM, a następnie pomnożyć przez 100, aby uzyskać procentową właściwą lizę. Jest to następnie obliczane dla każdego warunku. Dane te można następnie przedstawić na wykresie w celu wykazania porównania stosunku E do T z procentową właściwą Liz zarówno dla niestymulowanych PBMC, jak i stymulowanych CPG PBMC. W tym przykładzie komórki efektorowe stymulowane CPG skuteczniej zabijały komórki docelowe, gdy zwiększał się stosunek komórek efektorowych do komórek docelowych. Tego wzrostu nie obserwowano w niestymulowanych komórkach PBMC, co wskazuje, że stymulacja CPG jest konieczna do obserwowanego wzrostu lizy komórek docelowych.