Rola sygnałów chordin / Bmp w rozwoju gardła ssaków i rozwoju zespołu DiGeorge ’ a

wyniki

defekty gastrulacji u myszy Chrd -/ –

białko wiążące BMP wydzielane przez Chrd ulega ekspresji w węźle myszy i jego pochodnych, notochord i endodermie gardła(Fig. 1A-F). Proteina Chrd zawiera cztery domeny bogate w cysteinę (CR), z których wszystkie są w stanie wiązać Bmps.CR1 i CR3 wykazują najwyższe powinowactwo do Bmp4 i mogą antagonizować sygnały bmp poprzez wstrzyknięcie mRNA do zarodków Xenopus(Larrain et al., 2000). Aby wygenerować allel zerowy Chrd, przygotowaliśmy konstrukcję ukierunkowaną z kodonami zatrzymującymi translację w trzech możliwych klatkach odczytu w regionie peptydu sygnalnego. Po kodonach stop następowało przesunięcie ramki i wprowadzenie, po CR1, kaset IRES-lacZ i PGK-neo, które dodatkowo przerwały Gen Chrd(rys.1G). Transkrypty z tego allelu Chrdtm1DR(zwanego dalej Chrd-) były niewykrywalne w zarodkach inChrd-/- na etapie węzła(Fig. 1j, grot).

heterozygotyczne myszy Chrd były żywotne i płodne i były łączone z zarodkami Chrd o różnym rozwoju stages.At w dniu E8. 5 obserwowaliśmy obecność guzków resorpcyjnych w macicy ciężarnych samic i niewielkie zmniejszenie oczekiwanej liczby zarodków chrd / – (50 odzyskanych, 57 spodziewanych). Czterogenotypowe homozygotyczne zmutowane embriony wykazywały wyraźne zmniejszenie wielkości regionu embrionalnego, któremu towarzyszyło powiększenie allantoi z uwzględnieniem reszty embrionu (Fig.2A, A”). W sekcjach histologicznych występuje znaczna hipoplazja płytki nerwowej (rys.2B, B’), brak somitów i notochord(rys. 2C, C’) i anabundance pozamałżeńskich komórek mezodermalnych w allantoidzie(Fig. 2D, D’) były obserwowane. Reszta mutantów (46) była morfologicznie nie do odróżnienia od ich heterozygotycznych i dzikich gatunków. Fenotyp czwórnormalnych mutantów był podobny, ale mniej wyraźny niż brzuszność mezodermy obserwowanej w podwójnym homozygotycznym Chrd;Nogmutanty (Bachiller i in.,2000), w którym oprócz tego obecne były także przednie ścięcia neuralplate.

u danio pręgowanego i Xenopusa inaktywacja Chrd powoduje ekspansję mezodermy brzusznej i redukcję mezodermy grzbietowej i neuralplate(Schulte-Merker et al.,1997). U ssaków mezoderma formuje się podczas gastrulacji przez wydzielanie komórek epiblastowych przez prymitywną smugę. Komórki wychodzące na tylnym końcu prymitywnej smugi przemieszczają się w obszar pozamłodkowy, gdzie dają początek mezodermalnej linii (allantois, amnion i bloislands worka żółtkowego) równoważnej mezodermie brzusznej Xenopus. Natomiast komórki znajdujące się w bardziej przednich rejonach pnia pozostają we właściwym zarodku i wytwarzają paraksialną, pośrednią i boczną mezodermę płytkową przyszłego pnia. Wczesny fenotyp chrd – / – mutantów, w którym allantois jest rozszerzany w ekspresji mezodermy embrionalnej, jest zgodny z wczesną brzuszalizacją zarodka myszy. Ten fenotyp musi prowadzić do śmierci dotkniętych zwierząt, ponieważ żaden homozygotyczny mutant z nieprawidłowym allantoidem nie został odzyskany z rozszczepień w późniejszych stadiach. Analiza tego fenotypu za pomocą markerów molekularnych nie została przeprowadzona, ponieważ uzyskano tak niewiele nieprawidłowych zarodków.

śmiertelność okołoporodowa

tylko 49% (95 ze 194) spodziewanych zwierząt Chrd-/-zostało odzyskanych przy urodzeniu, wszystkie wykazują ten sam pełny penetrantfenotyp. Większość z nich była martwa, ale kilka próbowało,bezskutecznie, nadmuchać płuca. Zewnętrznie, homozygotyczne zmutowane noworodki były nieco mniejsze niż ich dzikie małpy i wykazywały sinicę, małogłowie i zmniejszenie ucha zewnętrznego, które zostało nieprawidłowo ustawione blisko oka (rys. 3A”).Badanie histologiczne (rys.3B ’- C’) ujawnił brak grasicy (t, pochodnej trzeciej torebki gardłowej) i podniebienia wtórnego (p) oraz hipoplazję ucha wewnętrznego (ie) u mutantów. Płat przedni i pars intermedia gruczołu przysadki mózgowej (pi), oba pochodzące z grzbietowej ektodermy jamy ustnej bezpośrednio sąsiadującej z kefaliczną granicą endodermy przedniej, były normalne(Fig. 3C, C”). W ten sposób zdefiniowano rostralną granicę fenotypu w jamie ustnej gardła, z formacjami ograniczonymi do pochodnych endodermy wyrażającej Chrd. Tarczyca, która tworzy się w endodermie brzusznej gardła w otworze oka, różnicowała się, ale była hipoplastyczna i miała nieregularny kształt (TH, Fig. 3C”). Gruczoły przytarczyc, pochodne torebek gardłowych 3 i 4, były nieobecne(dane nie zostały przedstawione), obserwacja zgodna z hipokalcemią noworodków u osób z zespołem DiGeorge ’ a (DiGeorge, 1968). Wnioskujemy, że fenotyp myszy chrd – / – martwych płodów podsumowuje większość cech opisanych u takich osobników.

wady szkieletu

w preparatach szkieletowych noworodków Chrd kości wyrostka robaczkowego i lędźwiowego były prawidłowe, ale podstawa czaszki i przedni szkielet osiowy wykazywały liczne wady. Zmiany w kości skroniowej obejmowały brak squama temporalis (st) i skrócenie łuku jarzmowego (rys.4A, A”). Zaobserwowaliśmy również znaczne niedorozwój kości krtaniowej oraz chrząstek tarczycy i krtani krtaniowej (rys. 4B’) oraz anabnormalnie małą szczękę (rys.4C”). W podstawie czaszki alisphenoid (as)wydawał się normalny, ale w linii środkowej kości podstawy potylicznej(bo) i basisphenoid (bs) zostały połączone, a prefenoid(ps) był hipoplastyczny (Fig. 4D, D”). Zgodnie z ustaleniami histologicznymi półki podniebienne nie rozciągały się przyśrodkowo do utworzenia podniebienia wtórnego. W uchu pierścień bębenkowy i Otic capsulewere zredukowane i zniekształcone (rys.4D”). Wady rozwojowe szkieletu obserwowano również w szyjnych i piersiowych rejonach kręgosłupa. Ciała kręgów(vb) były mniejsze u noworodków Chrd -/ – (rys. 4E’), z opóźnieniem i sporadyczną utratą innych elementów kręgów, takich jak procesy asspinous, łuki nerwowe i przedni łuk atlasu (rys. 4E ’ andFig. 5A”).

defekty szkieletowe mutantów Chrd były już wykrywalne w kondensacji przy E14.5 (Fig.5A,A”). Chrząstki baziokcipitalne i bazisphenoid zostały skostnione, a centrum kostnienia podstawy potylicy było węższe i osadzone w podstawisphenoid(Fig.5B,B”). Przedni notochord, który był obecny w temidline dzikiego typu basioccipital, był nieobecny w mutantach Chrd (Fig. 5B,B”). Brak przedniego otworu ortopedycznego potwierdzono badaniem histologicznym okolicy szyjnej W E14 .5 (Fig.5F”).

kości dotknięte mutacją Chrd mają bardzo różneoriginy. Basioccipital jest pochodzenia czysto somicznego; części basisphenoid powstają z endochondralnego kostnienia mezenchymy głowowej; thepalatine pochodzi z wewnątrzczaszkowego kostnienia mezenchymy wywodzącej się z grzebienia nerwowego; Otic capsules odróżniają się od mieszanki paraxial mesodermand neural crest cells; i gnykowy jest ściśle neural crest pochodną (Le Douarin i Kalcheim, 1999). Przy takiej różnorodności linii, jednoczącą zasadą fenotypu wydaje się być umiejscowienie zniekształconych struktur wprostyczności mezendodermy osiowej wyrażającej Chrd (rys. 1e). Interpretacja ta jest zgodna z obserwowaną przedwczesną degeneracją przednionotochordu u zwierząt Chrd – / – oraz z wymogiem sygnałów pochodzących od płytki chordowej i mezendodermy do rozwoju skeletonu głowy(Belo et al., 1998; Couly et al., 2002; David et al.,2002).

wady sercowo-naczyniowe typu DiGeorge

sinica obserwowana przy urodzeniu może być oznaką nieprawidłowego działania serca. W celu dalszego badania przeprowadzono rozwarstwienia na różnych etapach rozwoju zarodkowego. Na E14.5, serca zwierząt chrd – / – pokazały pojedyncze naczynie, zamiast dwóch, w przewodzie odpływowym serca (rys. 5D,D’,E,E’).Stan ten jest znany u ludzi jako uporczywy truncus arteriosus i jest istotną wadą rozwojową u osób z zespołem DiGeorge ’ a. Brak oddzielenia między aortą wstępującą a pniem płucnym może zwiększyć obciążenie robocze prawej komory powodując jej przerost, a także rozszerzenie naczyń, obrzęk i krwotok obserwowane u zarodków E14.5 (rys. 5C”). Jako zespół inDiGeorge ’ a, wady układu sercowo-naczyniowego rozciągały się poza przewód odpływowy i obejmowały wielkie naczynia pochodzące z łuku gardłowego (Fig. 6). U noworodków mutanty wspólne tętnice szyjne bezpośrednio łączyły się z tętnicą truncusarteriosus, co skutkowało brakiem tętnicy brachiocephalicznej i części łuku aorty (rys. 6A-C).Tętnice płucne pochodzą bezpośrednio z bliższego truncusarteriosus, co powoduje brak wspólnego pnia płucnego (rys. 6A-C). Ponadto zaobserwowano wady lateralizacji, z nieprawidłowym skręceniem aortainy w prawo 40% mutantów (Fig. 6, porównaj 6 z 6F). Gdy przeprowadzono rozwarstwienia z tyłu, itcould be seen that, W zależności od laterality aorty zstępującej, theight lub lewej tętnicy podobojczykowej przyjęła nieprawidłową retroeesophagealposition (rys. 6D-F). Podobne przypadki opisano w zarodkach kurzych z ablacjami komórek grzebienia nerwowego (Kirby et al., 1983) oraz inmice niosące delecje w regionie kongenicznym DiGeorge(Lindsay et al., 1999; Merscher et al., 2001) ormutations in Tbx1 and Fgf8(Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002; Jerome and Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Vitelli et al., 2002b).

po urodzeniu odkryto tylko 49% spodziewanych homozygotycznych mutantów Chrd. Jednak 48 Z oczekiwanych 56 (86%) zarodków Chrd-/-nadal żyło w miotach rozciętych W E14.5, częstość nie różniąca się znacząco od obserwowanej w E8.5 (88%). Gwałtowny wzrost śmiertelności po E14.5 pokrywa się z pełnym przejawem fenotypu sercowo-naczyniowego i sugeruje, że nieprawidłowe funkcjonowanie układu krążenia jest istotną przyczyną śmiertelności zarodków Chrd -/ – podczas ciąży.

nieprawidłowości gardła

aby określić początek fenotypu gardła, wydzieliliśmy pregnantfemales z heterozygotycznych krycia w różnych okresach po zrośnięciu. Na E9.0,astage, przy którym Chrd jest wyrażona w endodermie gardła, Chrd – / – embriony mogą być zidentyfikowane przez Wcięcie w okolicy szyi (rys.7A’, strzała). Pęcherzyki otic mutantów zostały zredukowane do połowy ich normalnej średnicy (rys.7A’, grot strzałkowy), a drugi (gnykowy) łuk gardłowy został powiększony. Łuki gardłowe od trzech do sześciu nigdy nie powstały w zmutowanych zarodkach (rys. 7B ’ oraz dane nieujęte). Brakujące lub zniekształcone struktury są albo bezpośrednimi prekursorami, albo odgrywają rolę indukcyjną podczas rozwoju wielu narządów, które są skuteczne przy urodzeniu u myszy Chrd -/ -. Ponieważ większość nieprawidłowości fenotypowych obserwowanych u nowonarodzonych mutantów ma swoją embriologicznąoryginę w endodermie gardła i okolicy obwodowej gardła, przeanalizowaliśmy ekspresję wielu genów, o których wiadomo, że mają ważne role rozwojowe w ludzkiej dziedzicznej chorobie.

najpierw zbadaliśmy ekspresję Pax3, czynnika transkrypcyjnego ekspresji w grzebieniu nerwowym, grzbietowej rurce nerwowej i somitach (Goulding et al., 1991). Inhumans, PAX3 jest zmutowany w chorobach grzebienia neuronowego oznaczonych zespołem wardenburga typów 1 i 3(Strachan and Read, 1994) i jest współregulatorem, wraz z SOX10, genu microphthalmia orMITF (Bondurand et al., 2000), czynnik transkrypcyjny zmutowany w zespole Waardenburga 2a u ludzi (Tassabehji et al.,1994). Mutacja Pax3 u myszy plotch (Sp2H)powoduje wady serca, w tympersistent truncus arteriosus, a także wady rozwojowe grasicy, tarczycy i przytarczyc (Conway i wsp .,1997). Stwierdziliśmy,że ekspresja Pax3 była różna między zmutowanymi i dzikimi zarodkami w E7.5 (nie pokazano), ale w E10.5 zaobserwowano znaczące różnice. Pax3-dodatnie komórki grzebienia, które migrują przez łuki gardłowe 3, 4 i 6(rys. 7C, groty strzał) były słabo wykrywalne u zwierząt Chrd- / – (rys. 7C”). Te komórki neuralcrest wypełniają przegrodę oddzielającą aortę od tętnicy płucnej w przewodzie odpływowym lub regionie stożkowym serca (Li et al., 2000). Niepowodzenie w dotarciu do serca przez grzebień nerwowy serca tłumaczy brak dróg odpływu i późniejszy fenotyp sercowo-naczyniowy obserwowany u mutantów chrd. Co ciekawe, ekspresja Pax3 w innych tkankach, takich jak Składnik żuchwy (md) pierwszego łuku gardłowego, dermomiotomy(dm) i prekursory mioblastów w kończynach przednich (FL) nie uległa zmianie(Fig. 7C”).

następnie wykonaliśmy hybrydyzacje in situ z Sox10, genemutowanym u osób z zespołem Waardenburga typu 4(Pingault et al., 1998), które wyrażają się w komórkach Neural crest i Schwann. W E7.5 ekspresja sox10 była taka sama w embrionach Chrd-/- oraz w ich potomkach typu dzikiego (dane nie zostały przedstawione). W E9. 5 ekspresja Sox10 w zwojach korzeni grzbietowych (drg) tułowia była normalna(rys. 7B, B’), ale Dystrybucja komórek glejowych wyrażających Sox10 ujawniła specyficzne skutki w organizacji obwodowego układu nerwowego w okolicy szyi i głowy mutantów (Fig.7B”). W szczególności, zwoje czuciowe czaszki wykazały znaczonezgodności. Zwoje trójdzielne (tr) i przedsionkowo-ślimakowe (vc), odpowiadające odpowiednio nerwom czaszkowym V i VIII, zlokalizowane były razem w zarodkach Chrd-/- niż w zarodkach typu dzikiego. Ponadto zaobserwowano nieprawidłowe projekcje nerwów łączących oba te elementy (ryc. 7B’, arrowhead). Najbardziej dotknięte były zwoje genikul (g), petrosal (p) i nodoza (n), odpowiadające nerwom czaszkowym VII, IX I X, wykazując skrajne zmniejszenie rozmiaru lub całkowity brak. Te trzy gangliaoriginate od epibranchial placodes, i są znane wymagać inductivesignals od przedniego endoderma dla ich prawidłowego rozwoju(Begbie et al., 1999). Brak zwojów nadbrzusznych pochodzących z łożyska wskazuje, że wydzielany proteinChrd jest wymagany do aktywności sygnału indukcyjnego uwalnianego przez endodermę gardła.

Pax9 jest czynnikiem transkrypcyjnym wymaganym do rozwoju endodermy gardła i jej pochodnych u myszy (Peters and Balling,1999; Peters et al., 1998). Na E9.5, ekspresja Pax9 w endodermie gardła zarodków chrd – / – była słabsza niż w ich dzikich typach (pe, Fig .7D, D”). Ekspresja Pax9 ujawniła, że rozmiar i kształt gardła został zmieniony w mutantach Chrd, z płucami gardła zredukowanymi do pojedynczego obrzęku w obszarze przednim (Fig. 7E,E”). Hipoplazja gardła została potwierdzona przez histologiczne odcinki E14. 5embrios, w których przedni endoderm pojawił się jako cienka rurka przedstawiająca znacznie zmniejszone światło (ph, Fig.5F, F’). Zmniejszenie endodermy gardła zaobserwowano również u Xenopus Chrd (Oelgeschläger et al.,2003). Regiony inne niż gardłowe, w których mRNA Pax9 jest normalnie wyrażane, takie jak somityczne sklerotomy (sc) i mezenchyma twarzy(fm), nie wykazały różnic w dystrybucji lub obfitości transkryptów (Fig.7F, F”).

z tych badań wnioskujemy, że zmiany w ekspresji Pax3, Sox10 i pax9 są ograniczone do bardzo ograniczonego obszaru domen widerekspresji, co sugeruje, że brak wydzielanego białka Chrd specyficznie zakłóca lokalne szlaki regulacyjne działające w regionie peryferyjnym otaczającym endoderm wyrażający Chrd.

ekspresja Tbx1 i Fgf8 wymaga chordin

do badania interakcji Chrd z genami, o których wiadomo, że powodują fenotypy podobne do DiGeorge lub DiGeorge u myszy, przeanalizowaliśmy ekspresję BX1 i Fgf8 w zmutowanych zarodkach Chrd. Tbx1 jest członkiem rodziny czynników transkrypcyjnych T-box(Papaioannou i Silver, 1998). Mapuje w ramach mikrodelecji DGS / VCFS 22q11 u ludzi, a ostatnio wykazano, że powoduje fenotyp podobny do DiGeorge ’ a na inaktywacji u myszy (Jerome and Papaioannou,2001; Lindsay et al., 2001; Merscher et al., 2001; Vitelli et al., 2002a). Ekspresja Tbx1 została zmieniona inChrd – / – embrionów. U zwierząt dzikich typu E7. 5 Tbx1 wyraża się w mezodermie przedplecza (przyszły endoderm gardła) i mezodermie głowy(Fig. 8a). Na tym etapie zmutowane litermiany wykazały wyraźne zmniejszenie poziomu ekspresji Tbx1 w tych samych obszarach (Fig.8A”). Zmniejszenie mRNA tbx1 było równie wyraźne w okolicy gardła homozygotycznych zarodków Chrd w E8.0, E8.5 i E9.0 (Fig.8B’,C’,D’). Poprzeczne sekcje histologiczne wykazały, że na poziomie komórkowym obfitość transkryptów Tbx1 była drastycznie zmniejszona w endodermie, zarówno w gardle, jak i przednim aż do poziomu uchyłka wątroby (Fig.8F-H’) zmniejszenie stężenia mrnaw Tbx1 widoczne jest również w mezodermie, w tym w głowicy, splanchnic (groty strzał) i mezodermie somatycznej (strzałki) w okolicy obwodowej gardła(Fig.8F’,G’,H’). Ponadto ekspresja Tbx1 w E9 w jądrze mezodermalnym pierwszego łuku gardłowego była uciążliwa, rozciągając się na większość łuku, a transkrypty tbx1 były pozbawione pęcherzyka otic (Fig.8D-D”).

Fgf8 jest wydzielanym czynnikiem wzrostu wyrażonym w różnych odmianach, w tym endodermie gardła i sąsiedniej mezodermie(Crossley and Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).Podczas wczesnego rozwoju Fgf8 jest wymagany do gastrulacji (Sun et al., 1999) oraz utworzenie lewej/prawej osi symetrii(Meyers i Martin, 1999). Atlater etapy Fgf8 jest wymagane dla kończyny(Lewandoski et al., 2000; Moon and Capecchi, 2000) andcraniofacial (Trumpp et al., 1999) rozwój. Ostatnie eksperymenty wykazały, że myszy ze zmniejszoną aktywnością Fgf8 przedstawiają spektrum wad sercowo-naczyniowych i gardłowych, które ściśle naśladują zespół DiGeorge ’ a(Abu-Issa et al., 2002; Frank et al., 2002). Ponadto ekspresja Fgf8 jest zniesiona w endodermie gardła mutantów BX1-/- i oba geny oddziałują genetycznie podczas różnicowania tętnic łuku gardłowego (Vitelli et al., 2002b). Ekspresja AtE9, Fgf8 w mutantach Chrd jest normalna w przesmyku temidowo-tylnym, przednim i ogonowym. Jednak w pharyngealendoderm, poziomy transkrypcji Fgf8 są drastycznie zmniejszone (Fig. 8E”). Redukcja ekspresji Tbx1 i Fgf8 w embrionach Chrd – / – sugeruje, że oba geny działają poniżej Chrd w tym samym szlaku regulacyjnym. Doświadczenia te nie określają, czy Chrdis jest wymagany do utrzymania lub indukcji Tbx1 ifgf8 w gardle i sąsiednich tkankach.

aby sprawdzić,czy Chrd może indukować Tbx1 i Fgf8, wstrzyknęliśmy mRNA Chrd (50 pg) do obszaru brzusznego zarodków Xenopus na etapie czterokomórkowym. Eksplanty brzusznej strefy brzeżnej (VMZ)rozcinano we wczesnej gastruli, hodowano aż do wczesnego stadium neuruli rodzeństwa i analizowano za pomocą RTPCR. MRNA Tbx1 i fgf8 ulegały ekspresji na wysokim poziomie w całych zarodkach i w eksplantach strefy grzbietowo-mózgowej (DMZ) na tym etapie oraz na niskim poziomie w eksplantach VMZ(Fig. 8i, pasy 1-3). Uponmicroinjection, Chrd mRNA zwiększył poziomy Tbx1 ifgf8 w VMZ (Fig. 8i, lane 4). Hybrydyzacja in situ mikroinjekcyjnego zarodka Xenopus potwierdziła, że transkrypty tbx1 indukowane Mrnawerem Chrd znajdują się w endodermie gardła (dane nie pokazane). Wnioskujemy, żechrd, antagonista Bmp, może wywoływać ekspresję Tbx1 i Fgf8 w zarodkach Xenopus i jest wymagany do pełnej ekspresji tych genów w okolicy gardła zarodka myszy.