Rośliny i patogen
pospolita roślina lodowa (Mesembryanthemum crystallinum L.) została wyhodowana w zakładzie produkcyjnym.szklarnia opisana przez kuźniaka i wsp. . Po pojawieniu się trzeciej pary liści, jeden zestaw roślin nawadniano 0,4 M NaCl w celu wywołania metabolizmu kwasu Krassulaceanowego (rośliny CAM), podczas gdy inny był dalej nawadniany wodą z kranu (rośliny C3). Po 12 dniach indukcję CAM w roślinach leczonych NaCl potwierdzono mierząc dobowy jabłczan ∆ w soku komórkowym liści. Następnie liście 2. pary liści roślin C3 i CAM zaszczepiono Botrytis cinerea według Kuźniaka i in. .
obrazowanie fluorescencyjne chlorofilu A
Mini Wersja obrazowania Fluorometru chlorofilu Pam serii M (Walz, Effeltrich, Niemcy) wyposażonego w uchwyt na liść została wykorzystana do rejestrowania obrazowania fluorescencyjnego (obrazowanie Fluorometru chlorofilu Pam serii M) . Fluorometr jest modelem klipsa do liści do zastosowań w terenie. Uchwyt na liść zapewnia, że liść jest trzymany poziomo do źródła światła, aby uniknąć niejednorodnego oświetlenia na różnych obszarach próbki liścia. Pozycje pobierania próbek wybrano tak, aby były równo rozmieszczone wzdłuż środkowej krawędzi, jednak nieznacznie różniły się dla każdego liścia ze względu na jego wielkość i morfologię oraz technikę umieszczania liści w uchwycie. Aby zidentyfikować skutki stresu biotycznego i uniknąć wprowadzenia artefaktów w procedurze pomiaru fluorescencji chlorofilu, nie zastosowano żadnych znaków referencyjnych umożliwiających odniesienie do obrazów liści. Fluorescencję chlorofilu z liści pospolitych roślin lodowych uzyskano poprzez zdefiniowanie obszaru zainteresowań (narzędzie AOI) przy użyciu oprogramowania Imaging Win 2.41 A.
za pomocą Imaging-PAM, bieżąca wydajność fluorescencji (Ft) była stale monitorowana. Rośliny były ciemne przez 20 min. Po zastosowaniu impulsu nasycającego określono wydajność fluorescencji na ciemnym poziomie (Ft = F0) i maksymalną wydajność fluorescencji (Fm). Zobrazowano maksymalną wydajność kwantową PSII, Fv / Fm oraz wydajność kwantową regulowanego i nieregulowanego rozpraszania energii w PSII, Y(NPQ) i Y(NO). Fv / Fm obliczono według równania: FV / Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ) obliczono według Kramera i wsp. według wzoru: 1-Y (II) – 1/(NPQ + 1 + qL (Fm / F0 − 1)). Y (NO) obliczono według Kramera i wsp. według równania: Y (nie) = 1/. Proces obrazowania zapewnia pseudokolorowe (indeksowany tryb kolorów) obrazy materiału biologicznego o rozdzielczości 640 × 480 pikseli odpowiadającej polu widzenia o wymiarach fizycznych 32 × 24 mm.
zainfekowane liście roślin C3 i CAM zostały pobrane do analizy fluorescencji chl w punkcie czasowym zaszczepienia i 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 i 72 h po zaszczepieniu. CHL a fluorescencję mierzono dla dołączonych liści drugiej pary liści z trzech roślin C3 i CAM pochodzących z dwóch niezależnych powtórzeń uprawy roślin. Każdy liść pobrany do analizy był oddzielnie przesiewany we wszystkich punktach czasowych (rys. 1). Reprezentatywna seria dziewięciu obrazów(po jednym dla każdego punktu czasowego) Y(NO), Y (NPQ) i FV/Fm dla roślin C3 i cam ice została przetworzona w celu zmierzenia zmian tych parametrów w wybranym obszarze ostrza liściowego przesiewanego w czasie. Dla porównania uśredniono dane y(NO), Y(NPQ) i Fv/Fm z całych regionów liści przedstawionych na Fig. Uzyskano 2. Na obrazach Y(NO) zilustrowano wyniki wyrównania obrazu i pomiaru wzorowania przestrzennego propagacji naprężeń biotycznych w liściach proponowaną metodą.
przykładowe obrazy kwantowej wydajności nieregulowanego rozpraszania energii w zwykłych liściach roślin lodowych. Stosuje się do PSII Y(NO) parametrów fluorescencji C3 (a–d) i CAM (e–h). Fragment liścia zawiera miejsce zaszczepienia patogenu i objawy propagacji stresu
przykładowy obraz C3 wspólnego liścia rośliny lodowej z wybranymi regionami zainteresowania. Ręcznie wykonane selekcje w edytorze oprogramowania układowego obejmują zainfekowane (1), symptomless (2), a także obszary midrib (3)
wyrównanie obrazu
mechanizm zbierania danych obrazu PAM w sekwencji czasowej powoduje przesunięcie fragmentu liścia w polu widzenia między poszczególnymi punktami czasowymi (rys. 1). Ze względu na zmianę położenia liścia takie cechy jak śródpiersie i miejsca szczepienia mają zarówno inną lokalizację, jak i orientację. Ponadto można zaobserwować efekt przeskalowania. Aby prawidłowo ocenić propagację naprężeń, pola widzenia powinny być wzajemnie zsynchronizowane, zakładając, że jedno z nich jest obrazem odniesienia (stałym), a pozostałe obrazy mają być wyrównane ze stałym. Takie podejście jest znane w obrazowaniu medycznym jako Rejestracja obrazu. Podstawowym zadaniem rejestracji obrazów fluorescencyjnych jest znalezienie transformacji „podobieństwa” składającej się z odpowiedniego obrotu, translacji i skalowania. Zginanie powierzchni liści i ich składanie z naprężeń występuje tylko w lokalnych regionach pojedynczych obrazów i ma niewielkie znaczenie dla globalnego wyrównania obrazu. Mogą one być kompensowane na etapie postprocesingu rejestracji za pomocą nieliniowych przekształceń, takich jak np. cienkowarstwowe, powierzchniowe sploty i odwzorowania demonów .
obrazy fluorescencyjne są wykonywane jako seria zdjęć w określonych odstępach czasu w przybliżeniu w tym samym obszarze liści. Charakterystyczne elementy stosu obrazów reprezentują głównie żyły liściowe. Są one jednak słabo odróżnialne od treści obrazu ze względu na ograniczony kontrast, a także modę kolorystyczną obrazowania PAM. Obszary objawów stresu wizualnie dominujące w treści mogą zmieniać się między obrazami w jednej serii. W takiej sytuacji automatyczna rejestracja nie powiodłaby się.
najbardziej popularne, automatyczne najnowocześniejsze metody opierają się na porównaniu intensywności obrazu z niektórymi wskaźnikami korelacji (metody oparte na intensywności) lub na wyszukiwaniu w nieruchomych i ruchomych obrazach zgodności między wybranymi cechami obrazu, takimi jak punkty, linie i kontury (metody oparte na funkcjach) . Żadne z tych podejść nie pozwala na prawidłową rejestrację obrazów fluorescencji Pam pospolitej rośliny lodowcowej, co zostało zweryfikowane i pokazane w przykładach zawartych w materiałach uzupełniających (plik dodatkowy 1). Przedstawione tam wyniki potwierdzają, że przyczyną nieudanej automatycznej rejestracji jest silne zaciemnienie regionów obrazu z zachowanymi cechami przez dynamiczne zmiany treści obrazu spowodowane infekcją tkanki liściowej. Testy popularnych metod zostały przeprowadzone zarówno przez estymatora rejestracji w Matlabie, jak i w środowisku Fidżi .
algorytm rejestracji obrazu PAM został zaprojektowany w środowisku Matlab na podstawie zestawu punktów kontrolnych wybranych ręcznie przez eksperta. Aby ustawić odpowiednie punkty kontrolne w każdym obrazie, zastosowano funkcję Cpselect narzędzia wyboru punktu kontrolnego z programu Image Processing Toolbox. Obrazy były edytowane w parach, w tym obraz stały i jeden obraz ruchomy. Pierwszy obraz uzyskany tuż po zaszczepieniu patogenu przyjęto jako obraz stały (referencyjny). Poprzez interaktywne mapowanie punktów użytkownik może wskazać nie tylko widoczne zarysy nerwów, ale także inne charakterystyczne elementy, takie jak punkt wstrzyknięcia, miejsca wzdłuż propagacji patogenu, a także najbardziej widoczne komórki pęcherza naskórkowego (rys. 3).
punkty kontrolne wybrane przez eksperta. Przykład Y (NO) obrazy fragmentu liścia rośliny Lodowej: obraz stały (referencyjny), B obraz ruchomy, który ma być wyrównany ze stałym
kilka par punktów kontrolnych rozmieszczonych jak najszerzej na powierzchni obrazu liścia wystarcza do prawidłowego wyrównania obrazów tego samego liścia z grubsza uznawanego za sztywne ciało. Szerszy rozkład punktów kontrolnych poprawia czułość dopasowania obrazu, ale jest ograniczony przez pole widzenia obrazu przycięte po transformacji wyrównania oraz przez możliwość precyzyjnego umiejscowienia wybranego punktu na łopatce skrzydła. Przy takim wyrównaniu obrazu transformacja afiniczna została wykonana za pomocą funkcji fitgeotrans zawartej w programie Image Processing Toolbox. Transformacja ta została ograniczona do wersji „podobieństwa” (składającej się tylko z translacji, obrotu i podobieństwa), ponieważ scena w Pampelunie pojawiła się jako nie przechylona. Ruchome obrazy zostały dopasowane do nieruchomego obrazu za pomocą funkcji imwarp. Graficzna ilustracja algorytmu rejestracji znajduje się na Rys. 4.
SCHEMAT BLOKOWY afinicznej i opcjonalnej rejestracji B-spline zastosowanej do obrazów fluorescencyjnych PAM. \(\left\) – wektor punktów kontrolnych w nieruchomym obrazie, \(\left^{\left (k \right)}\) – wektor punktów kontrolnych w k-tym ruchomym obrazie, \(\left^{{\left ({k^{\prime }} \ right)}}\) – wektor punktów kontrolnych w K-tym ruchomym obrazie po rejestracji B-spline
liście w różnych stadiach zakażenia mogą mieć powierzchnię miejscowo pofałdowaną lub pomarszczoną, jak w regionie zaznaczonym na analizowanych obrazach Pam-fluorometru (Fig. 5a, b), których kształt może potencjalnie wpłynąć na prawidłową analizę zjawiska propagacji patogenu. Oznacza to, że metoda rejestracji afinicznej oparta na transformacji geometrycznej może nie być wystarczająca do dopasowania fluorescencyjnych obrazów PAM w niektórych przypadkach liści z widocznie widoczną nieliniową deformacją. Dlatego autorzy proponują dwuetapową metodę rejestracji, w której afiniczna Rejestracja sztywna następuje po rejestracji B-spline zmniejszającej nieliniowe odkształcenia.
przykład rejestracji afinicznych i B-spline dla obrazu C3 common Ice plant leaf. a obraz Y (NO) po uzyskaniu PAM, B obraz po sztywnej transformacji afinicznej za pomocą strzałek reprezentujących interaktywnie ustawione wektory przemieszczenia używane w drugim etapie rejestracji i C forma końcowa po rejestracji B-spline opartej na punkcie kontrolnym
wybór niesztywnego typu rejestracyjnego wykorzystuje fakt, że pospolite liście roślin lodowych stanowią mało elastyczny materiał, a małe siły zginające utrzymują płynne zmiany w profilu powierzchni liści. Specyfika tej modyfikacji rejestracji polega na tym, że wektory pola deformacji obrazu muszą być nakładane interaktywnie. W tym celu do algorytmu dołączono dedykowany edytor pól wektorowych. Aby zarejestrować lokalne i gładkie deformacje powierzchni liścia, należy określić tylko kilka wektorów przemieszczenia w ruchomym obrazie, jak na Fig. 5B.
algorytm Rueckerta B-spline został wybrany do drugiego etapu rejestracji. Jego implementacja jest dostępna w Matlab Central File Exchange jako narzędzie do rejestracji Spline Dirk-Jan Kroon .
procedura rejestracji B-spline składa się z dwóch podstawowych kroków:
-
Inicjalizacja siatki G punktów obrazu równomiernie rozłożonej na powierzchni obrazu ze wszystkimi wektorami pola deformacji ustawionymi na zero, a następnie obliczenie gęstego pola wektorowego t deformacji w siatce G przez sześcienną interpolację B-splajnu ręcznie ustawionych wektorów przemieszczenia punktu kontrolnego \(\left^{\left (k \right)}\). Zarówno siatka, jak i powiązane pole transformacji T są następnie udoskonalane iteracyjnie w 4 krokach, aby zmniejszyć odstępy między węzłami siatki. Transformata T jest przygotowana przez funkcję point_registration z przybornika rejestracji splajnu.
-
B-przekształcenie splajnu wszystkich pozycji pikseli i dwu-sześciennych interpolacji składników koloru w ruchomym (zarejestrowanym afinicznie) obrazie \(I_{M}\) zgodnie z polem deformacji wygładzonej splajnu.
dokładność rejestracji obrazu
dokładność proponowanego wyrównania obrazu została wykonana przez średni kwadrat (RMS) dla odchyłek N = 15 punktów kontrolnych pokazanych na Fig. 3. Przesunięcie każdego punktu kontrolnego obrazu \(p_{i}\) ocenianego w ruchomym obrazie dla przypadku z wyrównaniem i bez wyrównania zilustrowano na Fig. 6 jako odpowiednio wektory \(R_{i} P_{i} =\Delta R_{i}\) i \(Q_{i} P_{i} =\Delta q_{i}\). Błędy przesunięcia RMS wszystkich punktów kontrolnych na jednym obrazie dla obu przypadków są wyrażone w korektorze. (1) jako \(\Delta R_{\text{rms}}\) i \(\Delta q_{\text{RMS}}\).
Ilustracja oceny błędów w rejestracji obrazów Pam. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,n\)—punkt kontrolny na stałym obrazie \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—mapowanie punktu kontrolnego \(p_{i}\) w ruchomym obrazie \(I_{m}\), \(R_{i}\)—mapowanie punktu kontrolnego \(p_{\text{i}}\) po rejestracji, \(r_{i} P_{i} =\Delta R_{i}\)—błąd przemieszczenia punktu kontrolnego \(p_{\Text{i}}\) po rejestracji
procent rezydualnego przemieszczenia \(\delta_{RMS}\) po rejestracji typu afinicznego, może być obliczony na jeden obraz zgodnie z korektą. (2).
ocenione afiniczne błędy rejestracyjne są wymienione w tabeli 1. Oryginalne przemieszczenia \(\Delta q_{\text{rms}}\) wahające się od 3,01 do 7,09 mm są zmniejszone po rejestracji „podobieństwa” do zakresu od 0,45 do 1,71 mm \(\Delta R_{\text{rms}}\) dla testowanej instalacji C3. Te same parametry dla Cam plant to \(1.90 \ div 5.69\; {\text {mm}}\) dla \(\Delta q_ {\text {rms}}\) i \(0.41 \ div 1.53\;{\text{mm}}\) dla \(\Delta R_{\text{rms}}\). Gdy\ (\delta_{RMS}\) jest uśredniona zarówno dla serii C3, jak i CAM, wynosi ona odpowiednio około 21% i 23%. Wartości parametrów fluorescencji Y (NO), FV/Fm i NPQ uzyskane z obrazów liści roślin lodowych bez rejestracji są pobierane z niekompatybilnych części liścia i nie mogą być brane pod uwagę (patrz dodatkowy plik 2).
Dla dodatkowej rejestracji B-spline mapowanie błędu transformacji jest definiowane przez dwa komponenty. Pierwszym z nich jest przesunięcie po rejestracji \(\Delta R_{i} = R_{i} P_{i}\) pokazane na Rys. 7a, z \(r_{i}\) obliczonym w Eq. (3) jako centroid \(\bar{p}\) regionu \(a_{i}\).
gdzie \(I_{R} \ left (p \right) \in\ left\) oznacza intensywność zarejestrowanego obrazu punktu kontrolnego w pikselu p, \(\left / {a_{i}} \right/\)—obszar rozmycia. Drugi składnik błędu jest zdefiniowany przez Standardowy promień odchylenia \(\rho_{i}\) natężenia rozłożonego wokół każdego punktu kontrolnego \(R_{i}\), jak opisano w korektorze. (4).
gdzie \(\left\ / \ cdot \ right\/\) oznacza normę euklidesową wektora pomiędzy punktami p i \(\bar{p}\) na płaszczyźnie obrazu. Rozmycie wyrównanego punktu kontrolnego \(r_{i}\) pojawia się z powodu faktu, że rejestracja nieliniowa wykorzystuje interpolację dwucubiczną w skończonej siatce rozdzielczości G. efekt ten został zmierzony eksperymentalnie przez wykonanie danej transformacji B-spline na obrazie zbudowanym z białych punktów kontrolnych na czarnym tle. Tabela 2 zawiera wielkości \(\Delta q_{i}\) N = 9 przykładowych wektorów pola przemieszczenia pokazanych na Fig. 5b. Magnitudes \(\Delta r_{i}\) błędów mapowania wektorowego po rejestracji splajnu są mierzone między pożądanymi stałymi punktami kontrolnymi \(p_{i}\) a centroidami zarejestrowanych punktów \(R_{i}\) ocenianymi w regionie \(a_{i}\). Wszystkie testowane wartości \(\Delta r_{i}\) są poniżej rozdzielczości piksela równej \(50\; \ upmu{\text{m}}\) i mogą być pominięte-zaokrąglone do 0. Oznacza to precyzyjne pozycjonowanie punktów kontrolnych za pomocą przekształcenia splajnu. Odchylenie standardowe \(\rho_{i}\) obszaru rozmycia pokazanego w tabeli 2 po podwojeniu może być miarą rozmycia punktu kontrolnego. Następnie zmienia się w przybliżeniu od \(24\; {\text {to}}\; 63\; \ upmu{\text{m}}\), co jest odpowiednikiem rozmycia o jeden piksel. W ten sposób transformacja ta pozwala lokalnie przywrócić właściwy kształt zmian Y (NO) w obrazie fluorescencyjnym.
Wyjaśnienie błędu w rejestracji obrazu B-spline obrazów PAM. a niedopasowanie mapowania położenia punktu kontrolnego podczas rejestracji, B rozkład intensywności obrazu zarejestrowanego punktu kontrolnego splajnu, \(p_{i} ,\;i = 1, \ldots ,n\)—punkt kontrolny na stałym obrazie \(I_{F}\), \(Q_{I}\)—odpowiednik punktu kontrolnego \(p_{i}\) w ruchomym obrazie \(I_{m}\), \(R_{i}\)—mapowanie punktu kontrolnego \(p_{i}\) po rejestracji, \(r_{i} P_{i} =\Delta R_{i}\)—miara błędu przemieszczenia odwzorowania punktu kontrolnego \(I_{i}\) P_{i}\),\(a_{i}\)—rozmyty obszar wokół\ (R_{i}\) odpowiadający punktowi kontrolnemu\ (P_{i}\), \(\rho_{i}\)—promień odchylenia standardowego\ (R_ {i}\) rozmycia
pomiar propagacji naprężeń
analiza danych wykorzystuje specjalne narzędzie edytora do manipulowania stosem obrazów PAM po ich rejestracji. Funkcja edytora głównego umożliwia narysowanie dwóch odcinków linii akwizycji danych \(L_{1} \;{\text{i}}\;L_{2}\) jednakowej długości (rys. 8), które mogą być obserwowane i dostępne na dowolnym obrazie ze stosu. W rozważanym eksperymencie pierwsza linia \(l_{1}\) rozpoczyna się w miejscu zaszczepienia \(s_{1}\), gdzie współczynnik naprężenia jest przykładany do tkanki liści w czasie t i powinien być w przybliżeniu ustawiony w kierunku rozszerzania się naprężeń. Druga linia \(l_{2}\) jest umieszczona wzdłuż środkowej krawędzi, gdzie obserwowany wpływ stresu w czasie był zawsze ograniczony, a parametry fluorescencji wykazują minimalne zmiany. Linie powinny całkowicie pasować do kontekstu obrazu.
obszary pomiarowe w obrazach Y (NO) pospolitych liści roślin lodowych po ustawieniu komputera. Punkty pomiarowe wskazują: (1) mezofilię w miejscu zaszczepienia, (2) mezofilię bez uszkodzeń, (3) śródręcze w pobliżu miejsca zaszczepienia. Linia pomiarowa (L1) jest zorientowana w kierunku propagacji naprężeń w obrębie mezofilu, a linia (L2) znajduje się wzdłuż środka. Linie rozpoczynające się odpowiednio w punktach (S1) i (S2)
dodatkowa opcja pomiaru punktowego jest możliwa, gdy trzy małe, różne okrągłe obszary o promieniu 10 pikseli są umieszczone interaktywnie w polu widzenia (rys. 8). Powinny należeć do regionów liści o różnych parametrach fluorescencji, które z czasem ulegają zmianie. Wszystkie zarejestrowane wartości pikseli są uśredniane w tych regionach.