przemysłowy beztlen Clostridium acetobutylicum wykorzystuje poliketydy do regulacji różnicowania komórkowego

szczepy bakterii i media

C. acetobutylicum ATCC 824 hodowano w komorze beztlenowej (produkty laboratoryjne Coy) zawierającej atmosferę 97% azotu i 3% wodoru. 2xYTG medium67 zawiera 16 g / l tryptonu, 10 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl i 10 g / L glukozy (o ile nie zaznaczono inaczej)o pH dostosowanym do 5.2 dla mediów płynnych i 5,8 dla mediów stałych (również zawierających 15 g / l agaru). Pożywka do wzrostu Clostridial (CGM)68 zawierała 30 g/L glukozy (o ile nie zaznaczono inaczej), 6,25 g/l ekstraktu drożdżowego, 2,5 g/l siarczanu amonu, 1,25 G/L NaCl, 2,5 g/l asparaginy, 0,95 g/l jednozasadowego fosforanu potasu, 0,95 g/l dwuzasadowego fosforanu potasu, 0,5 g/l siedmiowodnego siarczanu magnezu, 13 mg/l siedmiowodnego siarczanu manganu i 13 mg/L siarczan żelaza siedmiowodny o pH dostosowanym do 6,4. P2 medium69 zawiera 80 g/l glukozy (o ile nie zaznaczono inaczej), 1 g/l ekstraktu drożdżowego, 2,2 g/l octanu amonu, 0.5 g/l jednozasadowego fosforanu potasu, 0,5 g/l dwuzasadowego siarczanu potasu, 0,2 g/l heptahydratu siarczanu magnezu, 1 mg/l kwasu paraaminobenzoesowego, 1 mg/l chlorowodorku tiaminy, 10 µg/l biotyny, 10 mg/l heptahydratu siarczanu manganu, 10 mg/l heptahydratu siarczanu żelaza i 10 mg/l NaCl o pH dostosowanym do 6,4. Pożywka podstawowa Clostridium (CBM) 70 zawierała 10 g/L glukozy, 0,5 g/ l jednozasadowego fosforanu potasu, 0,5 g/l dwuzasadowego fosforanu potasu, 4 g/l tryptonu, 0.2 g / l siedmiowodnego siarczanu magnezu, 10 mg/l siedmiowodnego siarczanu manganu, 10 mg/l siedmiowodnego siarczanu żelazawego, 1 mg/l kwasu para-aminobenzoesowego, 1 mg/l chlorowodorku tiaminy i 2 µg/l biotyny o pH dostosowanym do 6,9. Dla stałych płytek CGM dodano 15 g / l agaru. CBM – s (używany do testów ciekłej sporulacji) był identyczny z CBM z wyjątkiem 50 g/L glukozy, a 5 g/l CaCO3 dodano tuż przed inokulacją kultur. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) uprawiano w pożywce Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C. W przypadku odpowiednich szczepów Clostridium pożywki hodowlane uzupełniono erytromycyną (Ery; 40 µg/mL dla pożywek stałych, 80 µg/mL dla pożywek płynnych) i/lub tiamfenikolem (Th; 5 µg / mL dla pożywek stałych i płynnych). Kanamycynę (Kan; 60 µg/mL) lub chloramfenikol (Cm; 25 µg / mL) dodano do pożywek do hodowli E. coli zgodnie ze wskazaniami. Szczepy Clostridium i E. coli utrzymywano w postaci 20% v/v zapasów glicerolu przechowywanych w temperaturze -80 °C.

Budowa plazmidu

oligonukleotydów dostarczano za pomocą zintegrowanych technologii DNA (tabela uzupełniająca 5). Do wszystkich reakcji PCR użyto polimerazy phuzyjnej (NEB). Do izolacji genomowego DNA z C. acetobutylicum ATCC 824 zastosowano metodę lizy alkalicznej71. C. acetobutylicum hodowano przez noc w 2xytg fazie odśrodkowej do stacjonarnej (OD600 > 2,0), w którym to momencie odwirowywano 10 mL Kultury w temperaturze 3500×g przez 15 minut (temperatura pokojowa). Supernatant odrzucono, a osad komórkowy ponownie zawieszono w 5 mL buforu (75 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Lizozym dodano do końcowego stężenia 2 mg / mL, a roztwór delikatnie wymieszano. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 60 minut, delikatnie mieszając co 15 minut. Po okresie inkubacji dodano 660 µL buforu lizy (1 m NaOH, 10% w/v SDS) i roztwór dokładnie wymieszano. Proteinazę K dodano do końcowego stężenia 0,5 mg / mL i roztwór inkubowano w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę. po tym okresie inkubacji dodano równą objętość fenolu: chloroformu (1: 1) i roztwór mieszano przez inwersję przez 5 minut. Następnie roztwór odwirowywano w temperaturze 3500×g przez 15 minut (temperatura pokojowa), a górną fazę wodną odrzucano przez pipetowanie. Do fazy organicznej Dodano 3 M octanu sodu (10% obj.w roztworze końcowym). W celu wytrącenia genomowego DNA Dodano 2 objętości etanolu i zmieszano roztwór. Wytrącone genomowe DNA zebrano za pomocą szklanego haka i przemyto 70% etanolem. Przemyte DNA suszy się następnie nad gazem azotowym przez 15 minut, ponownie zawiesza się w buforze o niskim TE (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) i rozpuszcza przez inkubację w temperaturze 50 °C.

do budowy plazmidu pko_mazf_mod (który później służył jako szablon dla pko_pks), startery pKON_Fo i pKON_Ro zostały użyte do wzmocnienia PCR regionu 5,0 kb z szablonu pko_mazf15. Ten krok był konieczny, aby usunąć region 677 bp ze szkieletu pKO_mazF, którego nie byliśmy w stanie wzmocnić za pomocą PCR. Produkt PCR 5,0 kb oczyszczono w żelu, strawiono na końcach 5′ I 3’przy użyciu PshAI, ligowano do postaci pKO_mazF_mod i przekształcono w E. coli TOP10. Transformant klony przesiewano oczyszczonym plazmid test trawienie, i Sanger sekwencjonowanie używać potwierdzać Sekwencja końcowy pko_mazf_mod klon. Do konstruowania plazmidu pko_pks (do delecji genu pks z C. acetobutylicum), region 3,8 kb zawierający colE1, repL, bgaR i mazF Amplifikowano PCR z pko_mazf_mod przy użyciu starterów pko_f i PKO_R. dodatkowo startery UHR_Fo i UHR_Ro oraz dhr_fo i DHR_Ro użyto do amplifikacji PCR regionów 1 kb reprezentujących regiony homologiczne Wyższego i niższego szczebla (UHR i DHR). flankowanie genu PKS (ca_c3355) z C. wzór genomowego DNA acetobutylicum ATCC 824. Gen oporności na chloramfenikol/tiamfenikol i promotor konstytutywny (P ptb z C. acetobutylicum) Amplifikowano PCR z pko_mazf_mod za pomocą starterów CMR_F i CMR_R (region 1,1 kb). Te cztery produkty PCR zostały ligowane przez Gibson assembly i przekształcone w E. coli TOP10. Transformantowe klony przesiewano oczyszczonym plazmidowym testem trawienia, i Sanger sekwencjonowanie używać potwierdzać sekwencję końcowy pko_pks klon. Do wytwarzania plazmidu pAN315 (niezbędnego do metylacji pKO_pks i pko_pks przed przekształceniem w C. acetobutylicum), region 6,4 kb z plazmidu pAN172 Amplifikowano za pomocą starterów pAN1_F i Pan1_r, a region 1,0 kb zawierający Gen oporności kanamycyny z wektora pCOLA_Duet Amplifikowano za pomocą starterów KAN_Fo i KAN_Ro. Wyekstrahowane w żelu produkty PCR ligowano za pomocą zespołu Gibsona i przekształcano do Top10 E. coli. Transformant klony przesiewano oczyszczonym plasmid test trawienie, i Sanger sekwencjonowanie używał potwierdzać sekwencję ostatni pan3 klon. Do konstruowania plazmidu pko_pks (do ekspresji genu pks pod konstytutywnym promotorem krotonazy z C. acetobutylicum), startery CPKS_Fo i CPKS_Ro zostały użyte do PCR amplifikacji genu C. acetobutylicum ATCC 824 pks (CA_C3355) z odpowiednimi nawisami do montażu Gibsona. Szkielet pwis_empty vector71 (zawierający konstytutywny promotor crt przed miejscem wielokrotnego klonowania) został amplifikowany PCR przy użyciu starterów pWIS_F i pWIS_R, dając produkt 5,0 kb. Dwa oczyszczone produkty PCR w żelu ligowano za pomocą zespołu Gibsona i przekształcano w Top10 E. coli. Transformant klony przesiewano oczyszczonym plazmid test trawienie, i Sanger sekwencjonowanie używać potwierdzać Sekwencja końcowy pCKO_pks klon.

do konstruowania plazmidu pET24b_pks, Gen C. acetobutylicum ATCC 824 pks (CA_C3355) Amplifikowano z genomowego DNA C. acetobutylicum przy użyciu starterów PKS_Fo i PKS_Ro. Podwójnie trawiony wektor pET24b (trawiony EcoRI/XhoI) ligowano podwójnie trawionym produktem PCR pks (trawiony EcoRI/XhoI), a produkt ligacji przekształcono w Top10 E. coli. Transformant klony przesiewano oczyszczonym plasmid test trawienie, i Sanger sekwencjonowanie używać potwierdzać Sekwencja końcowy pET24b_pks klon.

Electro-transformacja C. acetobutylicum

przed transformacją w C. acetobutylicum, wektor pKO_pks współwystępował z pAN3 w E. coli TOP10 poprzez elektroporację. Procedura ta pozwoliła na metylację pKO_pks niezbędną do przezwyciężenia natywnego systemu modyfikacji ograniczeń aktywnego w C. acetobutylicum 72. Plazmidowe oczyszczanie E. przeprowadzono hodowlę ciekłą pko_pks/pAN3 coli, a otrzymaną mieszaninę plazmidową wykorzystano do elektroporacji C. acetobutylicum przy użyciu wcześniej opublikowanej metody72, którą szczegółowo opisaliśmy tutaj. W celu wytworzenia komórek elektrokompetentnych pojedynczą kolonię C. acetobutylicum z płytki 2xytg (w wieku powyżej 1 tygodnia) ogrzewano w temperaturze 80 °C przez 10 minut i stosowano do inokulacji 10 mL CGM. Po inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C i osiągnięciu fazy wykładniczej (OD600 0,4-0,9), do zaszczepienia 54 mL świeżego 2xytg użyto 6 mL Kultury. Subkulturę tę inkubowano w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia OD600 1.2 (~5 h), w którym to momencie subkulturę odwirowywano w temperaturze 3500×g przez 20 minut (4 °C). Po usunięciu supernatantu osad komórkowy ponownie zawieszono w 20 mL zimnego buforu elektroporacyjnego (EPB; 270 mM sacharozy, 5 mM NaH2PO4, pH 7,4). Wymieszane komórki odwirowywano w temperaturze 3500×g przez 10 minut (4 °C), supernatant odrzucano, a osad komórkowy wymieszano w 20 mL zimnego EPB. Po ostatecznym granulowaniu przez odwirowanie w temperaturze 3500×g przez 10 minut (4 °C), supernatant odrzucono, a osad ponownie zawieszono w 2,3 mL lodowatej EPB. Ta ostateczna resuspensja została wykorzystana jako zapas ogniw elektrokompetentnych. Elektro transformacje przeprowadzono przez pierwsze zmieszanie (nad lodem) 500 µL właściwych komórek i ~20 µL roztworu plazmidowego DNA (łącznie 1-5 µg) do transformacji. Mieszaninę przeniesiono do kuwety elektroporacyjnej o grubości 0,4 cm i pozostawiono do inkubacji na lodzie przez 15 minut. Elektroporacje wykonano o następujących parametrach: napięcie, 2000 V; Pojemność, 25 µF; rezystancja, nieskończona Ω. Po elektroporacji próbki zawieszono w 1 mL 2xYTG i przeniesiono do probówki zawierającej 9 mL 2xYTG. Po wymieszaniu przez inwersję Kultury pozostawiono do odzyskania w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Kultury odzyskiwania odwirowywano w temperaturze 3500×g przez 15 minut (temperatura pokojowa), a supernatant odrzucano. Osad komórkowy zawieszono w 500 µL 2xYTG, a 100 µL pokryto stałymi płytkami 2xytg uzupełnionymi odpowiednim antybiotykiem. Płytkę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 2-3 dni, a kolonie transformantów poddano weryfikacji opartej na PCR.

delecja genu pks i uzupełnienie genetyczne

ukierunkowane KO genu pks (ca_c3355) w C. acetobutylicum ATCC 824 uzyskano stosując wcześniej opublikowaną metodę15. Szczegółowo, 5 µg metylowanej mieszaniny plazmidu pko_pks / pAN3 przekształcono do C. acetobutylicum metodą opisaną powyżej. Po odzysku w ciekłym ośrodku 2xYTG przez 4 godziny, granulki komórek zebrano przez odwirowanie (3500×g, 15 minut, temperatura pokojowa), zawieszono w 0,5 mL świeżej cieczy 2xytg i 100 µL wymieszanej hodowli komórkowej pokryto stałymi płytkami 2xytg + 5 µg/mL Th + 40 mM β-laktozy. W tych warunkach platerowania, tylko komórki, które przeszły pożądaną podwójną krzyżową rekombinację homologiczną, mogą przetrwać. Kontrwywiad szkieletu wektorowego zapewnia promotor indukowany laktozą (p bgaL), który napędza gen toksyny mazF na szkielecie wektorowym pKO_pks. W wyniku tej procedury galwanizacji zaobserwowano około 10 kolonii na płytkach β-laktozy 2xytg + 5 µg/mL TH + 40 mM. Z tych 10 Kolonii cztery były dwukrotnie restreakowane i poddawane weryfikacji PCR Kolonii. Jako podstawę weryfikacji PCR Kolonii wykorzystano cztery zestawy starterów, jak opisano na fig. 2.

do wytworzenia genetycznego szczepu dopełniającego PKS przeprowadzono elektroporację ∆pks C. acetobutylicum mieszaniną plazmidu pcko_pks/pAN3 , jak opisano powyżej. Po elektroporacji i odzysku Kultury platerowano na stałe 2xytg + 5 µg/mL TH + 40 µg/mL Ery media. Po dwukrotnym ponownym przetworzeniu na stałych nośnikach 2xytg + 5 µg/mL TH + 40 µg/mL, potencjalne kolonie zawierające pCKO_pks przesiewano za pomocą Kolonii PCR przy użyciu starterów pcko_f i pCKO_R.

analiza metabolomiczna LC-HRMS

dla nie ukierunkowanych porównań metabolomicznych dzikiego typu i ∆pks C. acetobutylicum, pojedyncze kolonie każdego szczepu były wstrząsane cieplnie w temperaturze 80 °C przez 10 minut i używane do zaszczepienia 10 mL ciekłego CGM (30 g/L glukozy). Po nocnej inkubacji (stagnacji) do osiągnięcia OD600 ~1,0, Kultury te stosowano do zaszczepienia 10 mL ciekłego CGM (80 g/L glukozy) 10% inokulum do subkulturingu. Po ~5 h (OD600 ~1.0) wzrostu stagnacyjnego, subkultury stosowano do inokulacji czterokrotnych fermentacji kolby (70 mL CGM, 80 g/L glukozy + 5 µL Antypieniącego 204, 3% inokulum) mieszanych za pomocą mieszadeł magnetycznych. Węglan wapnia (6 g/L) uzupełniono do pożywek fermentacyjnych w celu buforowania pH. Wszystkie hodowle przeprowadzono w temperaturze 37 °C. Około 5 µg/mL Th włączono do wszystkich hodowli ∆pks z wyjątkiem hodowli końcowej fermentacji, ponieważ wiadomo, że niektóre antybiotyki zaburzają fazy fermentacji ABE. Próbki bulionu fermentacyjnego (1 mL) z każdego replikatu pobrano we wczesnej fazie stacjonarnej i ekstrahowano 3 mL chloroformu metanolu w stosunku 2:1. Mieszaniny wirowano, oddzielano przez odwirowanie (2700×g, 10 min), a dolną warstwę bogatą w chloroform przeniesiono do szklanej fiolki. Te organiczne ekstrakty osuszono gazem azotowym, zawieszono w 100 µL metanolu i wstrzyknięto 10 µL do instrumentu Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass QTOF LC-MS wyposażonego w kolumnę Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Zastosowano liniowy gradient 2-98% CH3CN (obj./obj.) w ciągu 40 min w H2O z 0,1% kwasem mrówkowym (obj./obj.) przy natężeniu przepływu 0,5 mL/min. Metabolomic analysis platform XCMS16 (The Scripps Research Institute) używał porównywać metabolomes dzikiego typu i ∆PKS szczepy opierając się na quadruplicate LC-HRMS dane. Szczyty ms unikalne dla ∆pks (rys. 1a) zostały zidentyfikowane przy użyciu następujących parametrów: wartość p < 0, 01, zmiana fałdowa > 10, 0, intensywność szczytowa > 5000.

fermentacje bioreaktorów

w celu porównania profili fermentacji Abe typu dzikiego i ∆pks C. fermentacje acetobutylicum, bioreaktorów przeprowadzono w bioreaktorach DASGIP (zbiorniki 4 × GPI 100, System Dasgip Bioblock) o objętości roboczej 500 mL. Nocne Kultury (10 mL CGM, 30 g / L glukozy, stagnacja, 34 °C)zaszczepione szokującymi ciepłem indywidualnymi koloniami C. acetobutylicum hodowano do osiągnięcia OD600 ~1. Następnie użyto 10% inokulum do uruchomienia subkultury (30 mL pożywki P2, 80 g/L glukozy, stagnacja, 34 °C), a subkulturę inkubowano do osiągnięcia OD600 ~1. Subkultury o pojemności 30 mL były następnie aseptycznie przenoszone do poszczególnych bioreaktorów DASGIP wstępnie załadowanych 500 mL pożywki P2 (80 g / L glukozy, 100 µL środka przeciwpieniącego 204, 34 °C). Fermentacje pozwolono kontynuować przez 54 godziny z okresowym pobieraniem próbek do pomiarów gęstości optycznej, analizy produktu fermentacji i oznaczania ilościowego związków 1, 2 i 3. Przez całą fermentację utrzymywano temperaturę na poziomie 34 °c, mieszanie zapewniano przez mieszanie przy 200 obr. / min, a pH utrzymywano powyżej 5,0 poprzez automatyczne dodawanie 3 M NH4OH. Aby utrzymać warunki beztlenowe, wolny od tlenu Gaz azotowy spuszczano z szybkością 2 sL / h na czas trwania fermentacji. W celu oznaczenia ilościowego związków 1, 2 i 3, 1 mL bulionu fermentacyjnego zmieszano z 3 mL octanu etylu, wytrawiono, oddzielono przez odwirowanie (2700×g, 10 min, w temperaturze pokojowej) i wyizolowano górną warstwę organiczną. Warstwę organiczną osuszono przez odparowanie obrotowe, zawieszono w 200 µL metanolu i wstrzyknięto 20 µL do instrumentu Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (with DAD) wyposażonego w kolumnę Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Zastosowano liniowy gradient 2-98% CH3CN (obj./obj.) w ciągu 40 min w H2O z 0,1% kwasem mrówkowym (obj./obj.) przy natężeniu przepływu 0,5 mL/min. Związki 1, 2 i 3 zidentyfikowano za pomocą absorpcji UV (240 nm), jak pokazano na Fig. 1b i zostały określone ilościowo przez zintegrowany obszar piku (absorbancja przy 240 nm).

procedury analityczne fermentacji

spektrofotometr został użyty do określenia gęstości komórek poprzez pomiar gęstości optycznej przy 600 nm (OD600). Do analizy C użyto systemu SHIMADZU, wyposażonego w kolumnę Biorad Aminex HPX-87H (300 mm × 7,8 mm). bulion fermentacyjny acetobutylicum do koncentracji glukozy i produktów fermentacji (octan, maślan, mleczan, aceton, butanol i Etanol). Próbki bulionu fermentacyjnego (1 mL) najpierw granulowano przez odwirowanie w temperaturze 10 000×g przez 3 minuty, a następnie przesączono supernatant za pomocą 0,22 mikronowego filtra strzykawkowego PVDF. Próbki przefiltrowanego supernatantu (20 µL) wstrzyknięto do systemu UFLC z fazą ruchomą kwasu siarkowego 0,01 n przepływającą w temperaturze 0,7 mL/min, w kolumnie o temperaturze 35 °C i poddano chromatografii przez 35 minut. Anality wykrywano za pomocą detektora współczynnika załamania światła (używanego do ilościowego oznaczania stężeń glukozy, octanu, mleczanu, butanolu i etanolu) oraz detektora diodowego (używanego do ilościowego oznaczania stężeń maślanu (208 nm) i acetonu (265 nm)).

izolacja RNA i analiza RNA-Seq

próbki (10 mL) bulionu fermentacyjnego pobrano w trzech egzemplarzach biologicznych z fermentacji bioreaktorów dzikiego typu i ∆pks C. acetobutylicum 26 h po zaszczepieniu. Próbki odwirowano (4000×g, 10 min, 4 °C), a granulki ponownie zawieszono i przechowywano w odczynniku komórkowym Rnaprotect (Qiagen). Całkowity RNA ekstrahowano za pomocą zestawu Rneasy Mini Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Kolumnowe leczenie Dnazą przeprowadzono przy użyciu DNazy i (bez RNazy) (NEB). Kontrola jakości RNA, Budowa biblioteki i sekwencjonowanie biblioteki były wykonywane przez University of California-Berkeley Qb3 Functional Genomics Laboratory i Vincent J. Coates Genomic Sequencing Laboratory. Jakość i stężenie RNA oceniano za pomocą nanochipu na Bioanalizatorze Agilent 2100. Bakteryjne 16S i 23s rRNA usunięto za pomocą zestawu Rybozero (Illumina). Otrzymany messenger RNA (mRNA) konwertowano do biblioteki RNA-Seq przy użyciu zestawu do budowy biblioteki mRNA-Seq (Illumina). Sekwencjonowanie biblioteki RNA przeprowadzono na Illuminie HiSeq4000 z odczytem pojedynczego końca 50 bp. Odczyty sekwencjonowania (50 bp) były przetwarzane i mapowane do genomu C. acetobutylicum ATCC 824 (NCBI accession NC_003030.1 i NC_001988.2 ) przy użyciu CLC Genomics Workbench 9.0 z domyślnymi parametrami. Odczyty, które nie zgadzały się jednoznacznie z genomem, zostały odrzucone. Różnice w ekspresji genów pomiędzy dzikim typem a ∆pks C. acetobutylicum obliczono za pomocą tego samego oprogramowania. Geny uznano za ulegające ekspresji różnicowej z wartością p < 0, 003 (w oparciu o niesparowany test t, n = 3) i |znormalizowaną zmianą fałdową |> 2, 0. W programie CLC Genomics Workbench 9.0 obliczono fałszywe korekty szybkości wykrywania wartości p przy użyciu opublikowanej metody73. Wyniki analizy RNA-Seq przedstawiono w danych uzupełniających 1. Przeprowadzono analizę STRUN30 w celu określenia domniemanych interakcji białko-białko między genami o różnej ekspresji ujawnionymi za pomocą analizy RNA-Seq.

testy porównawcze fenotypu

testy płynnej sporulacji przeprowadzono z niewielkimi modyfikacjami74. Po 5 dniach inkubacji pobrano próbki z biologicznych hodowli ciekłych w trzech egzemplarzach (30 mL CBM-S, 37 °C). Próbki 20 µL poddano działaniu ciepła (80 °C, 10 min), rozcieńczenia (101-106) zauważono na płytkach 2xYTG, a kolonie wyliczono po 30 godzinach inkubacji (37 °C) w celu obliczenia liczby odpornych na ciepło jednostek tworzących kolonie (cfu/mL). Do chemicznego uzupełniania ∆pks W teście płynnej sporulacji oczyszczoną klostrienozę (stężenie końcowe 3,5 µM) uzupełniano w kulturach cbm-s ∆pks C. acetobutylicum w czasie szczepienia. Ponieważ związek 3 dodano jako stężony roztwór w metanolu, równoważną objętość metanolu (60 µL) dodano do wszystkich innych ciekłych kultur testowych sporulacji (typu dzikiego i niespełnionego ∆pks) w celu kontroli tego efektu.

w przypadku testów na obecność stałych zarodków zastosowano wcześniej opisaną metodę75 z pewnymi modyfikacjami. Szczegółowo, wstrząśnięte Cieplnie (80 °C, 10 min) poszczególne kolonie hodowano w płynnych mediach (10 mL CGM, 37 °C) przez 24 godziny. Kultury rozcieńczono współczynnikiem 106 i pokryto stałym CBM. Pobieranie próbek przeprowadzono 1, 2, 3, 4 i 6 dni po początkowym poszyciu. W celu pobrania próbek trzy pojedyncze kolonie połączono i dokładnie wymieszano w 60 µL ciekłego CGM. 20 µL wymieszanej mieszaniny Kolonii następnie wstrząsano Cieplnie (80 °C, 10 min), rozcieńczenia (101-106) zauważono na płytkach 2xYTG, a kolonie wyliczono po 30 godzinach inkubacji (37 °C) w celu obliczenia liczby odpornych na ciepło jednostek tworzących kolonię (cfu/Kolonia). Wszystkie próbki wykonano jako biologiczne trójplikaty.

próby akumulacji Granulozy przeprowadzono metodą barwienia jodem53. Fazy Mid-log (OD600 ~0,6) Kultury ciekłe (P2, 37 °C) posmarowano na stałym podłożu 2xYTG z podwyższonym poziomem glukozy (50 g / L), aby umożliwić produkcję granulozy. Płytki inkubowano w temperaturze 30 °C przez 4 dni, po czym barwiono je przez wystawienie na działanie złoża kryształów jodu przez 10 minut. Następnie płytki pozostawiono na 10 minut przed obrazowaniem. Do chemicznego uzupełniania ∆pks W teście akumulacji granulozy oczyszczoną klostrienozę (końcowe stężenie płytki 4,0 µM) osadzono w stałych płytkach 2xytg przed poszyciem hodowli ∆pks. Ponieważ klostrienozę dodano do płytek 2xytg w postaci stężonego roztworu w metanolu (zmieszanego ze stopionym podłożem przed zestaleniem), równoważną objętość metanolu (6 µL) dodano do wszystkich innych płytek 2xytg stosowanych w testach akumulacji granulozy w celu kontroli tego efektu.

poszczególne kolonie C. acetobutylicum hodowane na płytkach CBM przez 48 godzin (37 °C) były oglądane i obrazowane przy użyciu mikroskopu rozbiorowego Leica Mz16 f wyposażonego w kamerę Leica Dfc300 FX.

przeprowadzono testy rozsiewania Oleju76,77,78. Szczegółowo, szklaną zlewkę o pojemności 400 mL (wewnętrzna średnica 7,5 cm) napełniono 300 mL wody i dodano 10 µL kropli oleju z lampy parafinowej i pozostawiono do rozprzestrzenienia się na cienką warstwę na powierzchni wody w ciągu 5 minut (~25 mm średnicy). Roztwory surfaktyny, oczyszczonej klostrienozy i kontrolnego buforu fosforanu potasu wytworzono przy wskazanym pH i stężeniu (przygotowano w buforze fosforanu potasu o grubości 10 mM). Około 10 µL próbki ostrożnie dodano do środka filmu olejowego i zaobserwowano wpływ na film olejowy. Oczekuje się, że próbki o aktywności środka powierzchniowo czynnego utworzą stabilne okrągłe strefy oczyszczania w filmie olejowym, z silniejszą aktywnością środka powierzchniowo czynnego odpowiadającą większym strefom oczyszczania (lub całkowitemu rozproszeniu filmu olejowego dla bardzo wysokiej aktywności środka powierzchniowo czynnego). Testy upadku Drop wykonano 77, 79, 80. Okrągłe mikrofale (wewnętrzna średnica 8 mm) w polistyrenowej pokrywie 96-mikrofalowej płytki (12,7 × 8,5 cm) zostały pokryte cienką warstwą oleju z lampy parafinowej przez dodanie 2,0 µL oleju z lampy parafinowej do każdej studzienki i umożliwienie kropli równomiernego rozłożenia się na mikrofale w ciągu 1 godziny. Próbki surfaktyny, oczyszczonej clostrienozy i kontroli fosforanu potasu przygotowano tak, jak do testów rozprowadzania oleju. Do środka mikrofal ostrożnie dodano około 5 µL próbki. Po 5 minutach zaobserwowano kształt i stopień rozprzestrzeniania się kropli. Podczas gdy oczekuje się, że kontrola bufora utworzy stabilne kulki na powierzchni mikrofal, próbki zawierające środek powierzchniowo czynny powinny się zapadać i rozprzestrzeniać na powierzchni mikrofal, z silniejszą aktywnością środka powierzchniowo czynnego odpowiadającą większemu stopniowi rozprzestrzeniania się kropel.

Oczyszczanie i analiza in vitro białka PKS

w celu oczyszczenia białka PKS oznaczonego His6 do analizy in vitro, pET24b_pks przekształcono w E. coli BAP1. Pojedynczą kolonię zaszczepiono do 10 mL LB + 50 µg/mL kanamycyny (Kan) w celu nocnego wzrostu w temperaturze 37 °C. Około 7 mL nocnej hodowli użyto do zaszczepienia 700 mL LB + 50 µg/mL Kan, a hodowlę wstrząsano przy 240 obr. / min i 37 °C do osiągnięcia OD600 0,5. Po oblodzeniu hodowli przez 10 minut, tio-β-D-galaktozyd izopropylu (iptg) dodano do końcowego stężenia 0.1 mM w celu wywołania ekspresji białka, a hodowlę inkubowano w temperaturze 16 °C przez 16 godzin. komórki zebrano przez odwirowanie (5500×g, 4 ° C, 20 min), zawieszono w 25 mL buforu lizy (25 mM HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazol) i lizowano przez homogenizację nad lodem. Resztki komórek usunięto przez odwirowanie (17,700×g, 4 °C, 60 min) i dodano żywicę agarozową Ni-NTA do supernatantu (hodowla 2 mL/L). Mieszaninę nakręcano w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, załadowano na kolumnę przepływu grawitacyjnego, a białko PKS eluowano ze zwiększającym się stężeniem imidazolu w buforze a (20 mM HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). Oczyszczone białko PKS zatężono i bufor zamieniono na bufor a + 10% glicerolu za pomocą koncentratora odśrodkowego Vivaspin. Wydzielono porcje oczyszczonego białka PKS i zamrożono w ciekłym azocie. Przybliżona wydajność białka wynosiła 5 mg / L (203 kDa).

test obciążenia PKS z substratem znakowanym 14C zawierał, w całkowitej objętości 15 µL, 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.5 mM Coa, kwas 2-14C-malonowy (0,1 µCi), 10 µM MatB, 17 µM PKS i 50 mM HEPES, pH 8,0. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 25 °c próbki hartowano przez dodanie równej objętości 1× buforu próbki SDS. Po analizie SDS-PAGE z użyciem 4-15% żelu TGX (kryterium) żel suszy się przez 2 godziny w temperaturze 50 °C i wystawia na ekran fosforowy (20 × 25 cm; dynamika molekularna) przez 5 dni. Znakowane radioizotopem białko zostało zobrazowane na phosphorimager Typhoon 9400 (Tryb przechowywania fosforu, rozdzielczość 50 µm; Amersham Biosciences).

w przypadku testów in vitro (50 µL) białka PKS, 8 µM PKS inkubowano z malonylo-CoA (2 mM) w buforze fosforanowym (100 mM, pH 7,0) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w celu wytworzenia związku 4, zidentyfikowanego przez porównanie ze standardem chemicznym. NADPH (2 mM) dodano do testu w celu wytworzenia związków 5 i 6, które zostały zidentyfikowane przez porównanie ze standardami chemicznymi. Po inkubacji mieszaniny testowe ekstrahowano dwukrotnie 100 µL 99% octanu etylu/1% kwasu octowego (v / v). Ekstrakty organiczne wysuszono i zawieszono w 100 µL metanolu, a 10 µL wstrzyknięto do instrumentu Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (with DAD) wyposażonego w kolumnę Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). Zastosowano liniowy gradient 2-98% CH3CN (obj./obj.) w ciągu 40 min w H2O z 0,1% kwasem mrówkowym (obj./obj.) przy natężeniu przepływu 0,5 mL/min. Analizę LC-HRMS ekstraktów testowych przeprowadzono na przyrządzie Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass QTOF LC-MS wyposażonym w kolumnę Agilent Eclipse Plus C18 (4.6 × 100 mm) przy użyciu tego samego gradientu rozpuszczalnika i natężenia przepływu opisanego powyżej.

dostępność danych

dane RNA-seq wygenerowane w tym badaniu zostały zdeponowane w ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) pod numerem akcesyjnym E-MTAB-6019. Wszystkie inne istotne dane są dostępne od autorów na żądanie.