Przegląd Chemogenetyki

ze względu na znaczący rozwój technik neuronauki, naukowcy są teraz w stanie selektywnie wykorzystywać systemy neuronowe u świadomych zwierząt, poprzez pojawiające się metody zwane chemogenetyką i optogenetyką. Metody te pomagają w odkrywaniu obwodów neuronowych leżących u podstaw skomplikowanych zachowań w chorobach i zdrowiu.

Chemogenetyka i optogenetyka wykazują podobieństwa w podejściu do modyfikowania aktywności neuronów; na przykład, w obu technikach, kanały jonowe lub zaprojektowane receptory muszą być wprowadzone w określonych regionach mózgu, poprzez ekspresję plazmidu lub wirusowe systemy wektorów. W optogenetyce należy wyrazić wrażliwe na światło bakteryjne kanały jonowe, a następnie użyć światłowodów do hamowania lub aktywowania aktywności neuronalnej in vivo Lub in vitro (Boyden et al., 2005; Zhang et al., 2007).

chociaż ta metoda oferuje doskonałą kontrolę czasową aktywności neuronalnej in vivo, wiadomo, że jest z natury inwazyjna i wymaga implantacji mózgowej światłowodów. Chemogenetyka, z drugiej strony, nie potrzebuje chronicznego implantu, ale zachowuje potencjał do kontrolowania aktywności neuronów. Osiąga się to poprzez podawanie ligandów, selektywnych dla kanałów jonowych lub zaprojektowanych receptorów, które w przeciwnym razie są obojętne(Armbruster et al., 2007; Campbell & Marchant, 2018). Tabela 1 przedstawia główne cechy chemogenetyki i optogenetyki.

Tabela 1. Chemogenetyka vs optogenetyka

Historia i rozwój

RASSLs

Chemogenetyka odnosi się do wykorzystania kanałów jonowych lub genetycznie zmodyfikowanych receptorów i selektywnych ligandów aktywujących te receptory w celu ułatwienia manipulacji aktywnością neuronów. W tym kontekście receptory sprzężone z białkiem G (GPCRs) stały na czele rozwoju chemogenetyki, a oryginalny artykuł definiujący GPCRs, które reagują tylko z syntetycznymi ligandami, został opublikowany w 1998.

receptory te — znane jako receptory aktywowane wyłącznie przez syntetyczny Ligand (RASSLs) — były skutecznie stosowane in vivo, na przykład do zdalnej kontroli czynności serca. Pomimo tego, zastosowanie RASSLs w neuronauce zostało ograniczone przez endogenną aktywność receptorów przy braku ich szczególnego ligandu i aktywność farmakologiczną ligandów in vivo (Coward i in., 1998; Sternson & Roth, 2014).

DREADDs

w ostatnich latach nastąpił rozwój receptorów projektantów aktywowanych wyłącznie przez designerskie leki (DREADDS). Zmutowane ludzkie receptory muskarynowe stymulowane tylko przez obojętne ligandy były pierwszymi opracowanymi DREDDAMI (Armbruster et al., 2007). Poprzez kilka rund mutagenezy i badania przesiewowe przeciwko biologicznie obojętnemu N-tlenkowi ligandu klozapiny (CNO) zidentyfikowano receptory muskarynowe sprzężone z wewnątrzkomórkowym szlakiem sygnałowym Gaq.

receptory sprzężone z tym szlakiem są zdolne do aktywacji aktywności neuronalnej w odpowiedzi na CNO. Niskie stężenia CNO aktywują wszystkie trzy Gaq-DREADDs-hM1Dq, hM3Dq i hM5Dq (Roth, 2016). Co więcej, to samo badanie wykazało, że hM4Di i hM2Di mogą hamować aktywność neuronów poprzez ich sprzęganie z wewnątrzkomórkowymi szlakami sygnałowymi Gai. Te hamujące dready reagują również na CNO (Armbruster et al., 2007; Rys. 1).

Rysunek 1. Mechanizm działania ligandów DREADD. Wiązanie ligandów DREADD z Gaq-DREADDs wywołuje wypalanie neuronów, podczas gdy wiązanie z Gai-DREADDs powoduje zahamowanie aktywności neuronów. Dichlorowodorek N-tlenku klozapiny i agonista DREADD 21 są nieselektywnymi muskarynowymi agonistami DREADD, dzięki czemu mogą aktywować lub hamować aktywność neuronów, w zależności od ekspresji specyficznego receptora. Salwinoryna B jest selektywna dla receptora KORD, który jest sprzężony z sygnałem GaI, w związku z czym Wiązanie powoduje zahamowanie aktywności neuronalnej. Kredyt wizerunkowy: Tocris Bioscience

wiązanie między Gaq-DREADDs i CNO powoduje stymulację fosfolipazy C (PLC), która katalizuje konwersję 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu (PIP2) do 1,2-diacyloglicerolu (DAG) i 1,4,5-trisfosforanu inozytolu (IP3). Zarówno dag, jak i IP3 posiadają funkcje drugiego przekaźnika: ten ostatni wiąże się z receptorami, wyzwalając uwalnianie Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, podczas gdy ten pierwszy stymuluje różne formy kinazy białkowej C (PKC).

wiązanie między Gai-DREADDs i CNO powoduje hamowanie cyklazy adenylowej (AC), co powoduje zmniejszenie wewnątrzkomórkowego poziomu cAMP. Ponieważ zarówno EPAC, jak i kinaza białkowa a (PKA) są aktywowane przez cAMP, działanie CNO w Gai-DREADDs hamuje sygnalizację EPAC i PKA w dół (patrz rysunek 1).

CNO jest metabolitem klozapiny, badania wskazują, że jest to dwukierunkowa konwersja i że CNO może ulegać odwrotnemu metabolizmowi do klozapiny. Gdy CNO jest podawane w stężeniach potrzebnych do aktywacji DREADDs, klozapina jest następnie w stanie aktywować endogenne receptory (Gomez i wsp ., 2017). Klozapina-atypowy lek przeciwpsychotyczny-działa na szereg celów i prowadzi do wielu różnych efektów behawioralnych.

szczury, myszy, ludzie, naczelne i świnki morskie wykazują odwracalny metabolizm CNO do klozapiny (Gomez et al., 2017; Manvich et al., 2018). W wyniku potencjalnego odwrotnego metabolizmu CNO, badania relacji struktura-aktywność ewoluowały w celu opracowania stabilnych, alternatywnych ligandów.

silny ligand DREADD-agonista DREADD 21-był początkowo analizowany pod kątem aktywności przeciwko hM3Dq. Zatwierdzony lek perlapina został zidentyfikowany jako silny agonista hM3Dq w tych samych badaniach. W Japonii lek ten został zatwierdzony jako środek uspokajający i nasenny (Chen et al., 2015). Wykazano następnie, że zarówno perlapina, jak i DREADD agonisty 21 są silnymi agonistami hm4di, hM3Dq i hM1Dq o niewielkiej lub zerowej aktywności poza celem. Co więcej, agonista DREADD 21 został przetestowany in vivo, w którym wykazano, że aktywuje neurony ekspresyjne hm3dq i hamuje aktywność neuronów ekspresyjnych HM4DI(Thompson et al., 2018).

po rozwoju Dreadd muskarynowych z receptora κ-opioidowego (KORD) powstał hamujący DREADD. Aktywację tego hamującego DREADD uzyskuje się poprzez wiązanie ligandu Salwinoryny B, co powoduje zahamowanie aktywności neuronalnej poprzez sygnalizację Gai. Aby umożliwić dwukierunkową kontrolę aktywności neuronalnej, KORD można wykorzystać obok, aktywując Dreaddy, takie jak hM3Dq (Vardy et al., 2015).

niektóre wspólne cechy we wszystkich DREADDs sprawiają, że nadają się do stosowania w eksperymentach neuronaukowych. Po pierwsze, DREADDs nie wykazują żadnej odpowiedzi na endogenne ligandy z powodu mutacji genetycznych w ich miejscach wiązania ligandów, które eliminują Wiązanie, co oznacza, że jakakolwiek aktywność DREADD będzie tylko z powodu zastosowań konkretnego ligandu DREADD. Po drugie, ekspresja in vitro lub in vivo DREADDs nie ma żadnego wpływu na początkowe zachowania, funkcje neuronalne lub aktywność komórkową przed dodaniem ligandu DREADD (Sternson & Roth, 2014).

PSAMs/PSEMs

podczas gdy DREADDs i RASSLs są oparte na GPCRs, zmodyfikowane kanały jonowe nazwane farmakologicznie selektywnymi modułami siłowników (Psams) były również używane do modulowania aktywności neuronów. PSAMs opierają się na badaniach wskazujących, że możliwe jest przeszczepienie zewnątrzkomórkowej domeny wiążącej ligand α7 nikotynowego receptora ACh (nachr) do domeny porów jonowych innych kanałów jonowych bramkowanych ligandem. Gdy domena wiążąca ligand α7 nachr jest spleciona z domeną porów jonowych receptora 5-HT3, powstaje kanał jonowy z farmakologią α7 nachr, ale z właściwościami przewodzenia kationów 5-HT3 (Eiselé i wsp., 1993).

podobnie, splatanie domeny wiążącej ligand α7 nachr z domeną porów jonowych selektywnego receptora glicyny chlorkowej (GlyR) tworzy kanał chlorkowy reagujący na ACh (Grutter i wsp., 2005). Wybiórcza mutacja domeny wiążącej ligand α7 nachr powoduje powstanie kanałów jonowych PSAM, które nie wykazują żadnego wiązania ACh, ale są nadal selektywnie wiązane przez związki zwane farmakologicznie selektywnymi cząsteczkami Efektorowymi (PSEMs).

PSAMs lub chimeryczne kanały jonowe umożliwiające regulację przewodnictwa anionowego lub kationowego zostały wytworzone przez połączenie zmutowanej domeny wiążącej ligand α7 nachr (zawierającej dwie lub jedną mutację) z domeną porów jonowych kilku zróżnicowanych kanałów jonowych bramkowanych ligandem. Takie Chimery PSAM są nazwane na podstawie ich mutacji — a także powiązanej domeny porów jonowych-PSAML141F, Y115F-GlyR, PSAML141F-GlyR,PSAML141F, Y115F-GABAC i PSAML141F,Y115F-5-HT3. Aktywacja aktywności neuronalnej jest możliwa dzięki chimerom zawierającym 5-HT3, podczas gdy Chimery zawierające GABAC i GlyR są hamujące (patrz rycina 2) (Magnus i wsp., 2011; Sternson & Roth, 2014).

Rysunek 2. Mechanizm działania psem. Aktywujące PSAM składają się z zmutowanej domeny wiążącej ligand α7 nAChR splecionej z domeną porów jonowych kanału selektywnego kationowo, takiego jak 5-HT3. Wiązanie PSEMs do aktywujących PSAM powoduje napływ kationów i aktywację aktywności neuronalnej. Hamujące PSAM składają się z zmutowanej domeny wiążącej ligand α7 nAChR połączonej z poredomainą jonową selektywnego kanału anionowego, takiego jak GlyR. Wiązanie PSEMs z hamującymi PSAM powoduje napływ anionów i hamowanie aktywności neuronalnej. Kredyt obrazu: Tocris Bioscience

recenzje naukowe do dalszego czytania

• Campbell & Marchant (2018) Zastosowanie chemogenetyki w neuronauce behawioralnej: warianty receptora, ukierunkowanie podejść i zastrzeżenia. Br J Pharmacol. 175, 994.
• Neuron. 89, 683.
• (2011) chemical and genetic engineering of selective ligand-Ion channel interactions. Nauka. 333, 1292.
• Sternson & Roth (2014) Chemogenetyczne narzędzia do badania funkcji mózgu. Annu Rev Neurol. 37, 387.

1. Armbruster et al. (2007) ewoluowanie blokady, aby dopasować klucz do stworzenia rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G silnie aktywowanych przez obojętny ligand. Proc Natl Acad sci USA. 104, 5163.
2. (2012) Deconstruction of a neural circuit for hunger. Natura. 488, 172.
3. Boyden i in. (2005) Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263.
4. Bradley & Tobin (2016) Design of next-generation g protein-coupled receptor drugs: connecting novel pharmacology and in vivo animal models. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 56, 535.
5. (2018) Zastosowanie podejść chemogenetycznych do badania fizjologicznych ról muskarynowych receptorów acetylocholiny w ośrodkowym układzie nerwowym. Neurofarmakologia. 136, 421.
6. (2015) pierwsze badania relacji struktura-aktywność dla designerskich receptorów aktywowanych wyłącznie przez designerskie leki. ACS Chem Neuroscience. 6, 476.
7. (1998) Controlling signaling with a specifically designed gi-coupled receptor. Proc Natl Acad sci USA. 95, 352.
8. (1993)chimaeryczny receptor nikotynowo-serotoninergiczny łączy Wiązanie ligandów i specyfikę kanału. Natura. 366, 479.
9. (2017) Projekcje Glutaminergiczne z kory entorhinal do grzbietowego zakrętu zębatego pośredniczy w wywołanym kontekstem przywróceniu poszukiwania heroiny. Neuropsychofarmakologia. 42, 1860.
10. (2017) Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Nauka. 357, 503.
11. Grutter i in. (2005) Molecular tuning of fast gating in pentameric ligand-gated Ion channels. Proc Natl Acad sci USA. 102, 18207.
12. (2018) neurony cholinergiczne w przegrodzie przyśrodkowej utrzymują zachowania podobne do lęku wywołane przewlekłym bólem zapalnym. Neurosci Lett. 671, 7.
13. (2018) N-tlenek DREADD agonisty klozapiny (CNO) jest odwracalnie metabolizowany do klozapiny i wytwarza podobne do klozapiny działanie stymulujące u szczurów i myszy. / Align = „Center” / 8,3840
14. (2017) Modulacja histaminy obwodów zwojów podstawnych w rozwoju patologicznego uwodzenia. Proc Natl Acad sci USA. 114, 6599.
15. Sasaki i in. (2011) Farmakogenetyczna modulacja neuronów oreksyny zmienia Stany snu/czuwania u myszy. PLoS 1. 6, e20360.
16. (2017) Cortico-półleżące Regulacja podejścia-unikanie zachowania jest modyfikowana przez doświadczenie i przewlekły ból. Cela Nr 19, 1522.
17. (2018) dreadd agonist 21 (C21) jest skutecznym agonistą dla Dreaddów opartych na muskarynach in vitro i In vivo. ACS Pharmacol Transl Sci. Epub przed drukowaniem.
18. (2016) Nowy DREADD ułatwia multipleks chemogenetyczne przesłuchanie zachowania. Neuron. 86, 936.
19. (2016) śledzenie zależnej od czasu roli hipokampa w przypominaniu pamięci za pomocą DREADDs. PLoS 1. 11, e0154374
20. (2007) Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Natura. 446, 633.

o Tocris Bioscience

Tocris Bioscience jest zaufanym dostawcą wysokowydajnych odczynników life science, w tym agonistów receptorów & antagonistów, inhibitorów enzymów, modulatorów kanałów jonowych, sond fluorescencyjnych & barwników i bibliotek związków. Nasz katalog składa się z ponad 4500 narzędzi badawczych, obejmujących ponad 400 celów białkowych, umożliwiających badanie i modulację aktywności licznych szlaków sygnałowych i procesów fizjologicznych.

współpracujemy z naukowcami od ponad 30 lat, aby zapewnić społeczności life science standardy badań, a także nowatorskie i innowacyjne narzędzia badawcze. Rozumiemy potrzebę, aby naukowcy zaufali swoim odczynnikom badawczym, dlatego dokładamy wszelkich starań, aby dostarczać naszym klientom produkty najwyższej jakości, dzięki czemu możesz publikować z ufnością.

Tocris jest częścią działu Nauk o białkach bio-Techne, który obejmuje również najlepsze w swojej klasie marki R&D Systems, Novus Biologicals, ProteinSimple i Advanced Cell Diagnostics. Bio-Techne połączyło te marki, aby zapewnić naukowcom pełne portfolio odczynników badawczych, testów i platform białkowych. Aby uzyskać więcej informacji na temat Bio-Techne i jego marek, odwiedź bio-techne.com.

News-Medical.net publikuje artykuły i powiązane treści, które mogą pochodzić ze źródeł, w których mamy istniejące relacje handlowe, pod warunkiem, że takie treści dodają wartości do podstawowego etosu redakcyjnego News-Medical.Net który ma edukować i informować odwiedzających witrynę zainteresowanych badaniami medycznymi, nauką, urządzeniami medycznymi i zabiegami.

cytowania