przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 jest markerem aktywności Dronkowej podobnej do kaspazy-9 W Drosophila

znakowanie przez przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 utrzymuje się w podwójnych mutantach DCP-1 dryce

w celu oceny swoistości rozszczepionej kaspazy-3 przeciwciało kaspazy-3, analizowaliśmy dyski imaginalne oka z larw trzeciego stopnia. W dyskach obrazkowych oka typu dzikiego przeciwciało wykrywa kilka obumierających komórek rozrzuconych po dysku (Fig. 1a). Co zaskakujące, w dyskach oka podwójnie zmutowany dla alleli zerowych dcp-1Prev i drICEΔ1 (ref.14, 15), przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 nadal znakuje komórki (Fig. Etykietowanie w podwójnych mutantach DCP-1Prev drICEΔ1 występuje w klastrach (Fig. 1B), podobnie jak to było obserwowane wcześniej, gdy śmierć komórki była blokowana przez ekspresję inhibitora kaspazy-3 P35.3 obserwacje te sugerują, że rozszczepione przeciwciało kaspazy-3 nadal wykrywa epitop w przypadku braku białek podobnych do kaspazy-3 DCP-1 i DRICE. Niemniej jednak, ponieważ apoptoza na tym etapie nie występuje w określonym wzorze, byliśmy niepewni co do specyficzności tych sygnałów etykietujących.

w związku z tym użyliśmy transgenów GMR-hid, dobrze scharakteryzowanego modelu apoptotycznego, 5 do dalszego zbadania specyficzności przeciwciała rozszczepionego-kaspazy-3. Poprzez stymulowaną przez GMR ekspresję proapoptotycznego genu hid specyficznie w tylnej połowie rozwijającego się oka,transgeny GMR-hid indukują apoptozę w dwóch różnych falach, jak pokazano na rysunku 1C, d). Aby ocenić swoistość przeciwciała rozszczepionego-kaspazy-3, zbadaliśmy dyski oka GMR-hid, które były podwójnie zmutowane dla dcp-1Prev i drICEΔ1. Zgodnie z oczekiwaniami, utrata dcp-1Prev i drICEΔ1 całkowicie znosi apoptozę tunelowo-dodatnią w dyskach GMR-hid (rysunek 1F). Zaskakująco jednak, podwójne zmutowane dyski oka GMR-hid DCP-1Prev drICEΔ1 nadal wykazywały silną immunoreaktywność z przeciwciałem rozszczepionej kaspazy-3 (Fig. Tak więc przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 nie wykrywa lub nie wykrywa tylko DRICE i / lub DCP-1. Zauważamy jednak, że wygląd znakowania przeciwciała rozszczepionego-kaspazy-3 zmienia się pod nieobecność DCP-1 i DRYCE (porównaj rysunek 1C i e). Sygnał etykietujący nie jest już ograniczony do dwóch różnych fal (Fig. 1c), ale wypełnia cały tylny przedział dysku oka i jest ograniczony do komórek międzymózgowych (Fig. 1e). Podobna zmiana schematu znakowania została zgłoszona w przypadku znakowania przeciwciał CM1 po ekspresji inhibitora kaspazy P35.3 Ta zmiana wzoru znakowania jest prawdopodobnie spowodowana faktem, że komórki w podwójnym zmutowanym krążku ocznym GMR-hid DCP-1Prev drICEΔ1 nie umierają (Fig. Jednak ważne jest, aby zauważyć, że ta analiza wykazuje wykrywanie epitopu przy braku białek DCP-1 podobnych do kaspazy-3 i DRYCE przez przeciwciało rozszczepione-Kaspaza-3.

immunoreaktywność przeciwciała rozszczepionej kaspazy-3 zależy od składników apoptosomu DRONC i ARK

istnieją dwie możliwości, dlaczego przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 oznacza DCP-1 dryce podwójnie zmutowane komórki, chociaż nie są one apoptotyczne. Po pierwsze, przeciwciało nie może wykryć epitopu apoptotycznego; lub po drugie, przeciwciało może wykryć epitop apoptotyczny wytworzony przed lub równolegle do DCP-1 i DRICE. Aby rozróżnić te możliwości, zbadaliśmy zmutowane dyski oka GMR-hid dla składników apoptosomu DRONC i ARK, które działają przed DRYCE i DCP-1. W krążkach dronc i ark mutant GMR-hid eye,zarówno znakowanie tunelowe,jak i tasowane-Kaspaza-3 przeciwciała są blokowane (Fig.1 g, H; Fig. 3A, b). Dane te potwierdzają, że przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 rzeczywiście wykrywa epitop apoptotyczny u Drosophila. Ponadto, ponieważ nie wykrywa epitopu apoptotycznego w mutantach dronc i ark, ale nie w podwójnych mutantach DCP-1 dryce, dokładniejsze jest rozważenie przeciwciała rozszczepionego-kaspazy-3 jako markera aktywności Dronc, a nie aktywności efektorowej kaspazy, w umierających komórkach Drosophila.

tripeptyd ETD jest epitopem apoptotycznym wykrywanym przez przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3

epitop wykrywany przez przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 zależy od aktywności DRONC. Możliwe, że przeciwciało bezpośrednio rozpoznaje aktywowany DRONC. Alternatywnie, możliwe jest również, że przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 wykrywa epitop generowany przez rozszczepianie nieznanego substratu przez aktywny DRONC, niezależnie od DRICE i DCP-1.

aby rozróżnić te dwie możliwości, wyrównaliśmy pozostałości katalitycznej cysteiny (Cys163) do miejsca rozszczepiania w Asp175 ludzkiej kaspazy-3 (peptydu kaspazy-3) z odpowiednimi regionami kaspaz Drosophila (Fig. 3). Większość C-końcowych reszt peptydu kaspazy-3, ETD, jest konserwowana w DRICE i DCP-1 (Fig.2A). Podobnie jak Kaspaza-3, jest to miejsce rozszczepiania dla aktywacji co najmniej DRICE, 29 i prawdopodobnie DCP-1. Interesujące jest, aby zauważyć, że N-końcowy, dwie trzecie peptydu kaspazy-3, wykazuje najwyższe podobieństwo do dronc; sześć z dziewięciu reszt jest konserwowanych (Fig. 2A). Ta część peptydu kaspazy-3 jest mniej dobrze zachowana w DRICE, DCP-1 i pozostałych kaspazach Drosophila. Chociaż rozszczepienie między dużymi i małymi podjednostkami Dronc nie jest konieczne do jego aktywności,30, 31 i może nie wystąpić in vivo, rozważaliśmy możliwość, że przeciwciała skierowane przeciwko N-końcowej części peptydu kaspazy-3 mogą bezpośrednio wykrywać aktywny dronc w umierających komórkach.

użyliśmy peptydów blokujących do oceny, które epitopy peptydu kaspazy-3 są wykrywane przez przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 w umierających komórkach Drosophila. Sekwencje peptydów blokujących pokazano na fig. 2b i podkreślono na fig.2A. Blokujący peptyd a (TETD) pochodzi z DRICE i DCP-1,A blokujący peptyd B (CRGDEYDLG) odpowiada regionowi największego podobieństwa w DRONC (Fig.2A, b). Peptyd C jest peptydem kontrolnym odpowiadającym pozostałościom bezpośrednio sąsiadującym z peptydem B w DRONC(Fig. 2A, b). Peptyd D jest innym peptydem kontrolnym, który jest bardzo podobny do peptydu a i pochodzi z prodomeny dronc w pozycji 113. Jeśli prodomaina DRONC zostanie rozszczepiona w tym miejscu, ujawni ESD na swoim C-końcu, który jest bardzo podobny do C-końca peptydu kaspazy-3 (ETD, peptyd a) i może być wykryty przez przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3.

peptydy blokujące zmieszano z przeciwciałem rozszczepionej kaspazy-3 60 minut przed inkubacją z dyskami wyobrażeniowymi oka. Wyniki eksperymentów blokujących są podsumowane na fig. 2B, A dla peptydów a i B pokazane na fig. 2C-f. Peptyd A jest wystarczający do zablokowania całej immunoreaktywności przeciwciała rozszczepionego-kaspazy – 3 w dyskach oka GMR-hid i DCP-1 drICE double mutant GMR-hid (Fig.2C,d). Natomiast peptyd B nie znosi immunoreaktywności przeciwciała w tych dyskach (Fig. 2e, f). Peptydy kontrolne C I D również nie blokują immunoreaktywności rozszczepionej kaspazy-3 (Fig.

dane te wykazują, że przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 specyficznie wykrywa epitop ETD w komórkach apoptotycznych. Wśród kaspaz Drosophila epitop ten występuje tylko w DRICE i DCP-1, co sprawia, że jest bardzo prawdopodobne, że przeciwciało rzeczywiście wykrywa te kaspazy efektorowe. W przeciwieństwie do tego, fakt, że peptydy B, C I d pochodne DRONKU nie blokują immunoreaktywności sugeruje, że jest mało prawdopodobne, aby przeciwciało bezpośrednio wykrywało aktywny dronk. Dlatego też, ponieważ przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 nie traci immunoreaktywności w podwójnych mutantach DCP-1 drICE (Fig.1e), wykrywa co najmniej jedno inne białko, które naraża epitop ETD w sposób zależny od DRONC.

Aktywacja DCP-1 niezależnie od ARK przywraca immunoreaktywność rozszczepionej kaspazy-3

analiza przedstawiona na fig.2 sugeruje, ale nie dowodzi, że przeciwciało rozszczepionej kaspazy-3 rzeczywiście wykrywa rozszczepione DCP-1 i DRYCE. Aby bezpośrednio przetestować tę możliwość, wyznaczyliśmy transgen GMR-ΔN-DCP-1 w tle mutantów ark. ΔN-dcp-1 nie zawiera n-końcowej prodomeny DCP-1. Uważa się, że zubożony prodomainą ΔN-DCP-1 łatwo promuje autoprocessing, a spójna ekspresja pod kontrolą GMR indukuje fenotyp ablacji oka.Ten fenotyp ablacji oka jest spowodowany indukcją apoptozy (Fig. 3C, d). Jak wspomniano powyżej, zmutowane klony ark w tle GMR-hid nie indukują apoptozy TUNELOWO-dodatniej (Fig.3b), a przeciwciało tasowanej kaspazy-3 nie wykazuje żadnej immunoreaktywności w Klonach ark (Fig. 3A), co sugeruje, że ani DCP-1, ani DRICE, ani nieznane substraty DRONC nie są rozszczepiane w zmutowanych klonach ark. Dlatego przetestowaliśmy, czy ekspresja ΔN-Dcp-1 przy braku aktywności apoptosomu, to znaczy w Klonach ark, może przywrócić etykietowanie przeciwciała rozszczepionego-kaspazy-3. W porównaniu z tkankami typu dzikiego (oznaczonymi GFP na fig.3c,c’), Liczba komórek z dodatnim wynikiem rozszczepionej kaspazy-3 jest silnie zmniejszona w zmutowanych klonach ark (Fig. 3C,c’), co sugeruje, że aktywacja ΔN-DCP-1 jest co najmniej częściowo zależna od apoptosomu. Jednak około 50% zmutowanych klonów ark (N=32) w tle GMR-ΔN-DCP-1 zawiera komórki immunoreaktywne z rozszczepioną Kaspazą-3 (strzałki na fig.3c, c’). Jest mało prawdopodobne, aby był to artefakt etykietujący, ponieważ komórki te są również tunelowo-dodatnie (Rysunek 3d, d’). Dlatego też, ponieważ DRONC jest nieaktywny na tle mutacji ark, co sugeruje, że sygnał znakujący rozszczepioną Kaspazę-3 nie jest spowodowany przez nieznany substrat DRONC, analiza ta pokazuje, że przeciwciało rozszczepioną Kaspazę-3 rzeczywiście wykrywa rozszczepiony DCP-1. Możliwe jest również, że przeciwciało cleaved-Caspase-3 wykrywa rozszczepiony DRICE w tym eksperymencie, ponieważ DCP-1 może proteolitycznie przetwarzać DRICE, przynajmniej in vitro.29, 32 podobnej analizy z użyciem DRICE nie można było przeprowadzić, ponieważ GMR-drICE i GMR-ΔN-drICE nie powodują fenotypu ablacji oka.32 niemniej jednak, niezależnie od tego, czy DCP-1 rozszczepia DRICE in vivo, czy nie, biorąc pod uwagę podobieństwo sekwencji DCP-1 i DRICE na końcu C dużej podjednostki i dane blokujące peptydy przedstawione na fig.