pomiar porównawczy CNP i NT-proCNP w próbkach krwi ludzkiej: ocena metodologiczna

wprowadzenie

peptyd natriuretyczny typu C (CNP), zidentyfikowany w 1990 roku przez Sudoh i wsp., jest najstarszym członkiem rodziny peptydów natriuretycznych . CNP selektywnie stymuluje ludzki receptor peptydu natriuretycznego 2 (NPR2), który aktywuje kinazę zależną od cGMP (cGK) poprzez podniesienie wewnątrzkomórkowego stężenia cGMP . Ponadto CNP wiąże NPR3 i z kolei dezaktywuje kinazę białkową a poprzez zależne od białka gi hamowanie cyklazy adenylanowej . CNP ma właściwości przeciw proliferacyjne i przeciw migracji, a także został zidentyfikowany jako czynnik relaksujący pochodzący z śródbłonka . Ponadto CNP hamuje restenozę neointimalną, zmniejsza przebudowę zwężenia naczyń i uszkodzenie niedokrwienia serca-reperfuzyjne . CNP odgrywa ważną rolę w rozwoju kości, reprodukcji, rozwoju nerwów, ponownej endotelializacji, a także w funkcjonowaniu nerek, trzustki i serca . Ponadto niedawno uznano, że CNP bierze udział w rozwoju powstawania płytki miażdżycowej.

ze względu na mnóstwo funkcji CNP, peptyd ten osiągnął rosnące zainteresowanie badaniami sercowo-naczyniowymi w ciągu ostatnich lat. Jednakże badania dotyczące stężeń CNP w próbkach krwi są niespójne. Niektóre z tych badań zmierzały stężenia CNP lub jego amino-końcowego pro-peptydu (NT-proCNP) w próbkach surowicy, a inne wykorzystywały próbki osocza . Niestety, szczegóły dotyczące potencjalnych opóźnień podczas pobierania krwi i późniejszego przetwarzania próbki nie zostały jeszcze zgłoszone. W dotychczas dostępnej literaturze nie ma danych dotyczących różnicy stężeń CNP/NT-proCNP między próbkami surowicy i osocza. Również wpływ opóźnienia przetwarzania próbek krwi pozostaje niejasny. Ponadto stężenie CNP w próbkach surowicy i osocza znacznie się różniło(Tabela 1). Dlatego celem pracy była odpowiedź na następujące pytania metodologiczne: (1) Czy opóźnione przetwarzanie próbek krwi przechowywanych w temperaturze pokojowej powoduje odchylenie? (2) Czy istnieje jakaś różnica między stężeniami CNP lub NT-proCNP w surowicy i osoczu? (3) Czy te różnice są zależne od czasu?

metody

badaliśmy 12 ochotników płci męskiej (średni wiek 29 ± 2 lata, prawidłowa waga, brak terapii farmakologicznej, brak przebytych chorób układu krążenia lub innych, 3 palaczy). Ze wszystkich badanych osób uzyskano świadomą zgodę. Trojaczki próbek krwi na czczo pobrano od wszystkich ochotników o 8 rano. Próbki krwi pobrano za pomocą 7,5 ml s-Monovette® collection system (Sarstedt, Nümbrecht, Niemcy) zawierającego aktywator krzepnięcia (Kaolin) w próbkach surowicy, cytrynian sodu w próbkach osocza lub EDTA potasu w próbkach pełnej krwi. Wszystkie próbki do analizy wyjściowej natychmiast odwirowywano w temperaturze 2000 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a supernatant przechowywano w temperaturze -70°C do czasu analizy. W przypadku analiz śródokresowych (30 minut lub 2 godziny) próbki osocza odwirowywano w temperaturze 2000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Supernatant usunięto i przechowywano w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub 2 godziny. Po krzepnięciu krwi próbki surowicy były przetwarzane identycznie jak próbki osocza. Supernatant zapisywano i przechowywano w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub 2 godziny. Pełne próbki krwi przechowywano w temperaturze pokojowej bez odwirowywania. Po 30 minutach lub 2 godzinach pełne próbki krwi odwirowywano w temperaturze 2000 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Supernatant usunięto i przechowywano w temperaturze -70°C do czasu analizy. Stężenie CNP mierzono za pomocą zestawu CNP-22 EIA (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta. Stężenie NT-proCNP mierzono za pomocą zestawu NT-proCNP EIA Kit (Biomedica, Wiedeń, Austria) zgodnie z protokołem producenta. Jednokierunkowa ANOVA była używana do porównywania grup. Do porównań par zastosowano test T. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenie standardowe (SD) lub 95% przedział ufności (95%-CI). Przyjęto istotność statystyczną na poziomie p < 0,05. Dane zostały przeanalizowane przy użyciu MedCalc® dla systemu Windows w wersji 10.0.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgia).

wyniki

jak pokazano na fig.1a, początkowe stężenia CNP w surowicy, osoczu i próbkach krwi pełnej wynosiły odpowiednio 0, 997 ± 0, 379 ng/ml, 1, 933 ± 0, 699 ng/ml i 0, 991 ± 0, 489 ng/ml. Stężenia CNP w osoczu były znamiennie wyższe w porównaniu z próbkami surowicy i pełnej krwi we wszystkich punktach czasowych (ANOVA, P = 0, 001 na początku badania, p < 0, 001 po 30′ min. i p = 0,003 przy 120′ min.). Nie obserwowano istotnej różnicy pomiędzy próbkami surowicy i pełnej krwi w żadnym punkcie czasowym (ANOVA, p > 0, 05). Początkowe stężenia NT-proCNP w surowicy, osoczu i próbkach pełnej krwi wynosiły odpowiednio 58,5 ± 28,3 pg / ml, 60,3 ± 23,9 pg/ml i 50,7 ± 21,4 pg/ml (rycina 1B). Nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy grupami w żadnym punkcie czasowym (ANOVA, p > 0, 05). W pełnych próbkach krwi stężenie mleczanu znacznie wzrosło po 2 godzinach w porównaniu do wartości wyjściowej(3, 2 ± 0, 8 mM vs 2, 0 ± 0, 6 mM, p < 0, 001). Ponadto wartość pH spadła z 7,34 ± 0.03 na początku badania do 7, 29 ± 0, 03 Po 2 godzinach (p < 0, 001).

dyskusja

nasze badania wykazały, że CNP i NT-proCNP są stabilne w surowicy i w pełnych próbkach krwi przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej. W związku z tym na stabilność peptydu CNP najprawdopodobniej nie ma wpływu żadne opóźnienie w przetwarzaniu próbki o co najmniej dwie godziny. Stwierdzono już, że ProCNP (protokół producenta, nieznane warunki przechowywania próbek krwi) jest stabilny przez co najmniej 2,5 godziny. W związku z tym nasze eksperymenty potwierdziły stabilność NT-proCNP nawet w temperaturze pokojowej. Stężenie NT-proCNP we wszystkich typach próbek utrzymywało się na stałym poziomie przez okres do 2 godzin, co wskazuje na długotrwałą stabilność tego białka. Zgodnie z Tabelą 1, Średnie stężenie NT-proCNP (56,5 ± 24.3 pg/ml) mierzone w tym badaniu mieściły się w zgłaszanym zakresie (patrz Tabela 1) u zdrowych osób (3, 7-432 pg/ml).

w przeciwieństwie do NT-proCNP, stężenie CNP było znacząco wyższe w próbkach osocza w porównaniu z próbkami surowicy i pełnej krwi (ryc. 1). Jak dotąd, ani nasza grupa, ani służba techniczna producentów nie znaleźli żadnych dowodów dotyczących wpływu typu próbki na test ELISA zastosowany w tym badaniu. Jednak na początku badania supernatant w osoczu i próbkach pełnej krwi były identyczne, z wyjątkiem rodzaju stosowanego inhibitora krzepnięcia krwi. Inhibitorem tym był cytrynian sodu w grupie osocza i EDTA w grupie pełnej próbki krwi. Pełne próbki krwi wykazały porównywalne wyniki z próbkami surowicy (p = 0,98). Dlatego najprawdopodobniej cytrynian sodu może znacząco wpływać na zmierzone stężenie CNP w osoczu i w konsekwencji fałszować wyniki uzyskane za pomocą tej techniki.

nieoczekiwanie, początkowe stężenia CNP zarówno w osoczu, jak i w surowicy były około tysiąc razy wyższe niż w innych raportach (Tabela 1). We wszystkich tych badaniach stosowano Test radioimmunologiczny (Ria-Kit) do oznaczania stężeń CNP. Natomiast w dwóch innych badaniach zmierzone stężenia CNP w próbkach surowicy i osocza były porównywalne z naszymi Wynikami pod względem wielkości wymiaru . Co ciekawe, w tych ostatnich badaniach użyto tego samego zestawu ELISA, co w naszym dochodzeniu. Nawet po gruntownej ocenie różnych czynników wewnętrznych i zewnętrznych nie można było znaleźć zadowalającego wyjaśnienia tej rozbieżności. Pomiary kontrolne z użyciem egzogennego CNP w surowicy ludzkiej wykazały nieistotny błąd pomiaru + 7,8% (95% –KI: -). Peptyd CNP użyty do krzywej odniesienia został zsyntetyzowany przez samego producenta (Phoenix). Natomiast peptyd CNP stosowany jako „egzogenna” Kontrola został dostarczony przez Bachem. Jak zapewnili obaj producenci, sekwencje aminokwasów były identyczne i wiązania dwusiarczkowe zostały utworzone w obu peptydach.

jednak wyniki pomiarów kontroli wewnętrznej można podsumować w następujący sposób: Po pierwsze, pomiary kontrolne przeprowadzone w naszym badaniu wykazały, że zestawy ELISA były używane prawidłowo, zgodnie z instrukcjami producenta. Po drugie, pomiary z użyciem próbek kontrolnych potwierdziły przydatność zastosowanej krzywej standardowej. Po trzecie, próbki kontrolne surowicy zawierające egzogenny CNP wykazały akceptowalną dokładność, a wyniki mieściły się w oczekiwanym rzędzie wielkości. Po czwarte, wyższe stężenie CNP w próbkach osocza jest najprawdopodobniej artefaktem spowodowanym przez cytrynian sodu.

jak donoszą Clerico i współpracownicy, znane są również porównywalnie duże różnice w wynikach między różnymi metodami RIA i EIA, np. ANP i BNP . Clerico i współpracownicy doszli do wniosku, że duże różnice w tych wynikach są najprawdopodobniej spowodowane specyficznością stosowanych przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych, projektowaniem systemu testów immunologicznych (test konkurencyjny vs niekonkurencyjny), matrycą analityczną (surowica vs EDTA vs heparynizowane osocze) oraz mnóstwem krążących form peptydów natriuretycznych, jak wcześniej zgłaszano dla testów immunologicznych ANP i BNP . Te metodyczne źródła odchylenia mogą być również możliwe do wyobrażenia dla testów CNP i NT-proCNP i tym samym wyjaśniają ogromną różnicę w wynikach cytowanych badań (Tabela 1).

Ograniczenia badania

przyznajemy, że wielkość próby 12 jest zbyt mała, aby stwierdzić, że nie ma żadnej różnicy. Jednak ze statystycznego punktu widzenia ważne byłoby określenie, jak duża musi być różnica, aby mieć znaczenie medyczne. Według naszej wiedzy ta ostatnia nie jest jeszcze jasno określona. Dlatego na rysunku podano środki I 95% przedziały ufności wszystkich środków, aby każdy czytelnik mógł również czerpać własną interpretację z danych.

w odniesieniu do stężeń w surowicy i osoczu należy wspomnieć, że wartości podane w tabeli 1 były mierzone różnymi metodami (RIA, ELISA) u pacjentów z różnymi chorobami. Bardzo pomocne byłoby porównanie CNP-RIA z testami CNP-ELISA bezpośrednio przy użyciu tych samych próbek, ponieważ tysiąckrotna różnica rzędu wielkości pozostaje zauważalna. Niestety, pomiary Ria assays nie były dostępne w naszym laboratorium. W odniesieniu do stężenia NT-proCNP to ostatnie porównanie zostało zbadane przez Olneya i współpracowników, wykazując, że komercyjny test ELISA (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Wiedeń, Austria) dał wartości, które stanowiły średnio 21% (zakres 11-52%) wartości RIA. Krzyżowa Walidacja wzorca referencyjnego zestawu ELISA przy użyciu testu RIA wykazała różnicę zdań wynoszącą 15%.

podsumowanie

pomiary CNP i NT-proCNP najprawdopodobniej nie miały wpływu na opóźnienie pobierania próbek lub Rodzaj próbki krwi (z wyjątkiem CNP w próbkach osocza). W przypadku próbek osocza do testu ELISA CNP stosowanego w tym badaniu nadawały się jedynie antykoagulowane przez EDTA próbki krwi. W związku z tym stężenie CNP i NT-proCNP może być stosowane w zastosowaniach klinicznych w celu określenia efektów CNP. Należy również wziąć pod uwagę, że stężenie NT-proCNP, będące jedynie produktem ubocznym aktywnego peptydu, może ukrywać prawdziwą naturę CNP. Jednakże rozbieżność w mierzonych stężeniach CNP oznaczonych za pomocą testów RIA lub testów ELISA nadal pozostaje niewyjaśniona, ale najprawdopodobniej wynika to z problemów metodologicznych. Dlatego, zgodnie z zaleceniami dla ANP i BNP, testy immunologiczne dla CNP muszą być również standaryzowane lub zharmonizowane w przyszłości.