pojedyncza mutacja w wysoce zachowywanym regionie chloramfenikolu acetylotransferazy umożliwia produkcję octanu izobutylu bezpośrednio z celulozy przez Clostridium thermocellum w podwyższonych temperaturach

szczepy bakterii i plazmidy

szczepy bakterii i plazmidy stosowane w tej badania są wymienione w tabeli 2. Szczep Clostridium thermocellum dsm1313 ∆hpt (m1354) został użyty jako żywiciel do produkcji estrów w podwyższonych temperaturach. Należy zauważyć, że delecja genu fosforybozylotransferazy hipoksantynowej (HPT, Clo1313_2927) w dzikim typie DSM1313 umożliwia inżynierię genetyczną za pomocą przeciw-selekcji 8-azahypoksantyny (8-AZH); delecja ta nie ma żadnego znanego negatywnego wpływu na wzrost i metabolizm komórek . Plazmid pNW33N, zawierający CATSa, jest termostabilny i był używany do ekspresji różnych kotów w C. thermocellum. Plazmidy pET były używane do klonowania molekularnego i ekspresji enzymów w E. coli.

Chemikalia i odczynniki

wszystkie chemikalia zostały zakupione od Sigma-Aldrich (MO, USA) i/lub Thermo Fisher Scientific (MA, USA), o ile nie określono gdzie indziej. Do klonowania molekularnego enzymy restrykcyjne i ligazę T4 uzyskano z New England Biolabs (MA, USA). Phusion Hot Start II DNA polymerase używał dla polymerase łańcuchowa reakcja (PCR).

Media i uprawa

w celu klonowania molekularnego i ekspresji białek szczepy E. coli hodowano w bulionie lysogeny (LB) zawierającym odpowiednie antybiotyki, o ile nie zaznaczono inaczej. Do charakterystyki in vivo CATSa w E. coli zastosowano podłoże hybrydowe M9 z glukozą 20 g/L. W hodowli C. thermocellum zastosowano średnicę MTC lub średnicę ctfud-NY, jak określono w doświadczeniach. Gęstość optyczną (OD) mierzono spektrofotometrem przy długości fali 600 nm (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

Analiza wyrównania wielu sekwencji

Analiza wyrównania wielu sekwencji (MSA) została przeprowadzona przy użyciu MEGA7 . Sekwencje białkowe wyrównano za pomocą ClustalW i wizualizowano za pomocą ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr). Kluczowe cechy w strukturach białkowych 3U9F, 4CLA i 2XAT ekstrahowano odpowiednio z CAT_SALTI, CAT3_ECOLIX i CAT4_PSEAE.

Modelowanie molekularne i symulacje dokowania

trójwymiarowe (3D) struktury

struktura 3D catsa i alkoholi będących przedmiotem zainteresowania została po raz pierwszy wygenerowana przy użyciu odpowiednio Swiss-Model i narzędzi „Builder” Moe (Molecular Operating Environment software, Wersja 2019.01). Trójwymiarową strukturę podwójnego kompleksu CATSa ograniczonego substratem (tj. acetylo-CoA–izobutanol–CATSa) otrzymano przez ekstrakcję izobutanolu z kompleksu izobutanol–CATSa, a następnie dodanie go do kompleksu acetylo-CoA–CATSa. Wszystkie konstrukcje zostały przygotowane przez narzędzie 'QuickPrep’ MOE z domyślnymi parametrami i zoptymalizowane przez minimalizację energii za pomocą pola siłowego Amber10:EHT.

Symulacja dokowania

aby przeprowadzić symulację dokowania, potencjalna kieszeń wiązania została przeszukana za pomocą narzędzia „site Finder” Moe. Do dalszych badań wybrano najlepiej punktowane miejsce, zgodne ze zgłoszonymi miejscami katalitycznymi. Symulacje dokowania były wykonywane zgodnie z opisem . Krótko mówiąc, acetylo-CoA i każdy alkohol zostały zadokowane przy użyciu indukowanego protokołu dopasowania z metodą trójkątnego matchera i londyńską funkcją punktacji ΔG. Po symulacjach dokowania wybrano najlepiej punktowaną pozę wiązania, pokazującą kluczową interakcję między pozostałością a substratem w punkcie root-mean-square-deviation (RMSD) < 2 Å. Jako przykład, dla dokowania acetylo-CoA wybrano Wiązanie wykazujące wiązanie wodorowe między hydroksylem Ser-148 a N71 CoA . Do dokowania alkoholu wybrano pozę wiązania pokazującą wiązanie wodorowe między N3 His-189 a hydroksylową alkoholem .

analiza mutagenezy In silico

Analiza mutagenezy in silico kompleksu acetylo-CoA–izobutanol–CATSa została przeprowadzona zgodnie z wcześniej opisanym opisem . W szczególności narzędzia „alanine scan” i „residue scan” Moe zostały użyte do identyfikacji potencjalnych kandydatów na pozostałości do mutagenezy.

klonowanie molekularne

Budowa plazmidów

plazmidy zostały skonstruowane standardową techniką klonowania molekularnego metodą zależną od ligazy i/lub montażem Gibsona przy użyciu starterów wymienionych w dodatkowym pliku 1: Tabela S1. Skonstruowane plazmidy wprowadzono do E. coli TOP10 przez transformację szoku cieplnego. Kolonie wyizolowane na płytce selektywnej przesiewano metodą PCR i oczyszczano plazmid. Oczyszczone plazmidy sprawdzano za pomocą sekwencjonowania Sangera przed przekształceniem w E. coli BL21 (DE3). Mutageneza ukierunkowana na miejsce została przeprowadzona przy użyciu protokołu mutagenezy ukierunkowanej na miejsce QuickChange™ ze zmniejszoną długością nakładania się lub metodą montażu Gibsona . Dla inżynierii C. thermocellum najpierw skonstruowano plazmid pHS005, a następnie zmodyfikowano do pHS0024. pHS0024 nie ma hpt w dolnej części Operonu, podczas gdy inne sekwencje plazmidu są identyczne z pHS005.

transformacja

do transformacji E. coli i C. thermocellum zastosowano konwencjonalne metody transformacji chemicznej i elektroporacji. Dla C. thermocellum, metoda została jednak nieco zmodyfikowana, jak opisano tutaj. Najpierw hodowano C. thermocellum m1354 (Tabela 2) w 50 mL pożywce CTFuD-NY w temperaturze 50 °C w komorze beztlenowej (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., OR, USA). Hodowlę komórkową z OD w zakresie 0,8 – 1,0 ochładzano w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Poza tym punktem wszystkie kroki wykonywano poza komorą. Schłodzone ogniwa zbierano w temperaturze 6500×g i 4 °C przez 20 minut. Granulki komórek przemyto dwukrotnie schłodzoną lodem wodą Milli-Q i zawieszono w 200 µL buforu transformacji składającego się z 250 mM sacharozy i 10% (v/v) glicerolu. Kilka 30 µL porcji komórek elektrokompetentnych przechowywano natychmiast w temperaturze-80 °C w celu dalszego użycia. W celu elektroforezy komórki elektrokompetentne rozmrażano na lodzie i inkubowano z 500-1000 ng metylowanych plazmidów przez 10 minut. Następnie komórki przeniesiono do chłodzonej lodem kuwety elektroporacyjnej ze szczeliną 1 mm (BTX Harvard Apparatus, MA, USA), a następnie dwa kolejne wykładnicze impulsy rozpadu z 1.8 kV, 350 Ω i 25 µF. Impulsy Zwykle powodowały stałą czasową 7,0-8,0 ms. Komórki natychmiast ponownie zawieszono w wstępnie rozgrzanym świeżym CTFuD-NY i odzyskano w temperaturze 50 °C w warunkach beztlenowych (90% N2, 5% H2 i 5% CO2) wewnątrz gumowej rurki Balch. Po 0-12 h odzysku komórki miesza się ze stopionym podłożem agarowym CTFuD-NY uzupełnionym 15 µg/mL tiamfenikolu. Ostatecznie mieszaninę średniokomórkową wylano na szalkę Petriego i zestalono wewnątrz komory beztlenowej. Płytkę inkubowano w temperaturze 50 °C do 1 tygodnia, aż do pojawienia się kolonii. Wydajność transformacji wynosiła 2-100 jednostek tworzących kolonie na µg plazmidu (CFU / µg plazmidu).

charakterystyka in vivo CATSa i jej wariantów w E. coli

w celu charakterystyki in vivo CATSa i jej wariantów w E. coli, przeprowadzono hodowle o wysokiej gęstości komórek, jak opisano wcześniej, z dodatkiem 2 G/L różnych alkoholi. Do ekstrakcji in situ estrów, każdą rurkę nakładano 25% (v/v) heksadekanem. Aby potwierdzić ekspresję białka CATSa i jego wariantów, 1% (v/v) komórek macierzystych hodowano przez noc w temperaturze 37 °C i 200 obr. / min w probówkach o pojemności 15 mL zawierających 5 mL pożywki LB i antybiotyk. Następnie 4% (v/v) kultur nocnych przeniesiono do 1 mL pożywki lb zawierającej antybiotyk w 24-studzienkowej mikropłytce. Kultury hodowano w temperaturze 37 °C i 350 obr. / min przy użyciu inkubującego wytrząsarki mikropłytkowej (Fisher Scientific, PA, USA), aż OD osiągnęło wartość 0,4–0,6, a następnie indukowano przez 0.1 mM izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (iptg) przez 4 godziny z łatwą w oddychaniu membraną uszczelniającą zapobiegającą parowaniu i zanieczyszczeniu krzyżowemu (Nr kat. 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). Próbki białek uzyskano przy użyciu odczynnika B-PER complete (Nr kat. 89822, Thermo Scientific, MA, USA), zgodnie z instrukcją producenta i przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE.

charakterystyka enzymu

oczyszczanie his-tag

w celu ekspresji enzymu, nocną kulturę zaszczepiono 1:Stosunek 50 w świeżej pożywce LB zawierającej 1 mM IPTG i antybiotyk, a następnie 18 °C przez noc (do 20 h) W Inkubatorze wytrząsającym przy 200 obr. / min. Indukowane komórki zebrano przez odwirowanie w temperaturze 4 °C i 4700×g przez 10 minut. Osad komórkowy przemyto następnie raz wodą z Millipore i zawieszono w odczynniku B-PER complete. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej mieszaninę odwirowywano w temperaturze 17 000×g przez 2 minuty. Supernatant zebrano i oznaczono jako ekstrakt surowy. Do oczyszczania his-tag surowy ekstrakt inkubowano z agarozą hispur Ni–NTA superflow w partii, zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie żywicę przemyto co najmniej trzema objętościami buforu płuczącego, składającego się z 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu i 0,1 mM EDTA. Białka związane z żywicą eluowano przez 300 µL buforu elucyjnego zawierającego 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 300 mm imidazol i 0,1 mM EDTA. Eluowaną próbkę odsalono i zatężono przez kolumnę filtracyjną Amicon z odcięciem masy cząsteczkowej 10 kDa. Ostatecznie próbkę białka zawieszono w 200 µL 20 mM buforu Tris–HCl (pH 8,0). Stężenie białka mierzono metodą Bradforda z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) jako białkiem referencyjnym.

Thermal shift assay

do pomiaru temperatury topnienia białka (TM) zastosowano test thermofluoru z SYPRO Orange . Około 10-250 µg oczyszczonego białka his-tag zmieszano z 5× SYPRO pomarańczą w 50 µL końcowej objętości w 96-studzienkowej płytce qPCR. Przed rozpoczęciem testu płytkę uszczelniono kapslami PCR. Do przeprowadzenia testu wykorzystano maszynę StepOne real-time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) z następującymi parametrami: ROX reporter, przyrost 1 °c na cykl, 1-minutowe zatrzymanie w każdym cyklu i zakres temperatur od 20 do 98 °C. dane zostały zebrane, wyeksportowane i przetworzone w celu obliczenia Tm.

test 5,5′-ditiobis-(kwasu 2-nitrobenzoesowego) (dtnb)

szybkość reakcji dla każdego kota oznaczono za pomocą testu DTNB w płytce 384-studzienkowej. Całkowita objętość reakcji wynosiła 50 µL z buforem reakcyjnym zawierającym 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Stężenia acetylo-CoA (Coala Biosciences, TX, USA) i alkoholi były zróżnicowane, jak określono w każdym eksperymencie. Końcowe stężenia enzymu wynoszące 0,05 µg/mL i 10 µg/mL wykorzystano do reakcji na chloramfenikol i alkohole, odpowiednio. Kinetykę reakcji zebrano mierząc absorbancję przy 412 nm co minutę przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C w czytniku mikropłytek (Synergy HTX microplate reader, BioTek). Szybkość reakcji obliczono przy użyciu współczynnika ekstynkcji ze standardowej krzywej wolnego koenzymu A (MP Biomedicals, OH, USA) w tych samych warunkach. Należy zauważyć, że ponieważ maksymalna temperatura robocza zalecana dla czytnika płyt wynosi 50 °C, wysokoprzepustowy test enzymatyczny dla CAT w podwyższonych temperaturach został przeprowadzony tylko w celu określenia parametrów kinetyki enzymów.

obliczanie parametrów kinetycznych szybkości reakcji

parametry prawa szybkości Michaelisa-Mentena (Eq. 1) obliczono dla każdego enzymu w następujący sposób. Po pierwsze, regresję liniową przeprowadzono na danych zebranych z czytnika mikropłytek w celu identyfikacji początkowych szybkości reakcji, \(y_{i}\), przy różnych początkowych stężeniach substratu, \(s_{i}\), gdzie i = {1,2,…, n} jest liczbą zebranych punktów danych. Następnie te początkowe szybkości reakcji i związane z nimi początkowe stężenia substratów dla wszystkich replikatów były jednocześnie zgodne z Modelem Michaelisa-Mentena (Eq. 1) przy użyciu solidnej regresji nieliniowej (równoważnik. 2) z estymatorem strat soft-L1 (Eq. 3) zaimplementowany w Bibliotece obliczeń numerycznych SciPy v1. 2. 0 :

problem najmniejszych kwadratów określa parametry \(K_ {\text {m}}\) i \(v_ {\text {max}}\) poprzez zminimalizowanie różnicy między przewidywanymi szybkościami reakcji modelu \(v_{i}\) a zmierzonymi szybkościami reakcji \(y_{i}\) (Eq. 2). Funkcja wygładzania \(\rho \left (z \right)\) jest używana, aby najmniej kwadratowy problem był odporny na wartości odstające (Eq. 3). Ze względu na bezstronną odporność na wartości odstające i unikanie błędów wynikających z konwencjonalnych metod linearyzacji, solidna regresja nieliniowa zapewnia najbardziej precyzyjne oszacowanie parametrów dla modelu Michaelisa-Mentena .

produkcja octanu izobutylu w szczepach C. thermocellum

fermentacja Celobiozy

produkcja octanu izobutylu z celobiozy w szczepach C. thermocellum została przeprowadzona w dwuetapowej konfiguracji biokonwersji. Komórki hodowano najpierw w środowisku minimalnym MTC zawierającym 5 g / l celobiozy w gumowej rurce Balchowej, aż OD osiągnie wartość 0,8-1.0. Komórki schładzano w temperaturze pokojowej przez 20 minut i odwirowywano w temperaturze 4700×g i 4 °C przez 20 minut. Po usunięciu supernatantu, komórki zawieszono w tej samej objętości świeżego podłoża MTC zawierającego 2 G / L izobutanolu w komorze beztlenowej. Zawiesinę komórek podzielono następnie na 800 µL w rurce mikrokrążkowej z zakrętką o pojemności 2,0 mL z nakładką heksadekanową o pojemności 200 µL. Komórki inkubowano w temperaturze 55 °C przez 24 godziny, a następnie przeprowadzono analizę chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrem masowym (GC/MS) w celu określenia ilości wytworzonego octanu izobutylu.

fermentacja celulozy

do fermentacji celulozy użyto zmodyfikowanego medium MTC (medium C-MTC). Jako jedyne źródło węgla zamiast celobiozy użyto 20 g / l Avicel PH-101, a w celu zwiększenia pojemności buforowej Dodano 10 g / l mopów. Początkowe pH zostało dostosowane do 7,5 na 5 m KOH I autoklawowane. W komorze beztlenowej 0,8 mL nocnej hodowli komórkowej zaszczepiono w 15,2 mL pożywki C-MTC (stosunek inokulacji 1: 20) z 4 mL nałożonego heksadekanu. Każda rurka zawierała małe mieszadło magnetyczne do homogenizacji celulozy. Gumową rurkę Balch inkubowano w łaźni wodnej połączonej z regulatorem temperatury ustawionym na 55 °C i systemem mieszania magnetycznego. Po dostosowaniu pH za pomocą 70 µL iniekcji 5 M KOH, co 12 godzin pobrano 800 µL kultury komórkowej i 200 µL warstwy heksadekanu. podczas fermentacji pH Kultury utrzymywano w zakresie 6,4–7,8.

wzrost komórek monitorowano mierząc białko granulek. Granulat komórkowo-celulozowy z 800 µL objętości pobranych próbek przemyto dwukrotnie wodą w Mili-Q i zawieszono w buforze do lizy o pojemności 200 µL (0.2 M NaOH, 1% SDS), po czym następuje godzinna inkubacja w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór zneutralizowano 50 µL 0,8 m HCl i rozcieńczono 550 µL wody. Mieszaninę odwirowywano w temperaturze 17 000×g przez 3 minuty. Stężenie białka z supernatantu analizowano metodą Bradforda zgodną z detergentem (Thermo Scientific, WA, USA). Pozostałą pellet gotowano w piecu o temperaturze 98 °C przez godzinę przed oznaczeniem ilościowym pozostałej celulozy.

pozostałości celulozy oznaczono ilościowo metodą kwasu fenolowo-siarkowego z pewnymi modyfikacjami. Przegotowaną próbkę przemyto dwukrotnie wodą w Mili-Q i zawieszono w 800 µL wody, aby uzyskać objętość równoważną oryginałowi. Próbkę homogenizowano przez pipetowanie i wir przez 10 s, a 20 µL homogenizowanej próbki przeniesiono do nowej 2,0 mL rurki z mikroprzepływem lub 96-studzienkowej płytki i wysuszono przez noc w piecu o temperaturze 55 °C. Wysuszony osad zawieszono w 200 µL 95% kwasu siarkowego i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po całkowitym rozpuszczeniu osadu dodano 20 µL 5% fenolu i zmieszano z roztworem kwasu siarkowego. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej 100 µL próbki przeniesiono do nowej płytki 96-studzienkowej i zmierzono absorbancję przy 490 nm. Absorbancję przekształcono do stężenia celulozy za pomocą standardowej krzywej Avicel PH-101 poddanej tej samej procedurze.

metody analityczne

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

metabolity pozakomórkowe oznaczono ilościowo przy użyciu systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (Shimadzu Inc., MD, USA). 800 µL próbek hodowli odwirowywano przy 17 000×g przez 3 minuty, a następnie supernatanty filtrowano przez filtry 0,2 µm i przepuszczano z fazą ruchomą 10 mN H2SO4 przy 0,6 mL / min Na Aminex HPX – 87h (Biorad Inc., CA, USA) w temperaturze 50 °C. Detektor refrakcji (RID) i detektor ultrafioletowy (UVD) przy 220 nm były używane do monitorowania stężenia cukrów, kwasów organicznych i alkoholi.

Chromatografię Gazową połączoną ze spektroskopią mas (GC/MS)

estry mierzono za pomocą Gc (HP 6890, Agilent, CA, USA) wyposażonego w MS (HP 5973, Agilent, CA, USA). W systemie Gc do oddzielania analitów zastosowano kolumnę kapilarną Zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, USA) (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm), a jako nośnik użyto helu o natężeniu przepływu 0,5 mL/min. Program temperatury piekarnika ustawiono następująco: Temperatura początkowa 50 °C, temperatura początkowa 1 ° C/min do 58 °C, temperatura początkowa 25 °C/min do 235 °C, temperatura robocza 50 °C/min do 300 °C i 2-min piec w temperaturze 300 °C. 1 µL próbkowanej warstwy heksadekanu wtryskiwano do kolumny w trybie rozdzielającym z temperaturą wtryskiwacza 280 ° C. W systemie MS zastosowano wybrany tryb jonowy (SIM) do wykrywania i oznaczania ilościowego estrów o następujących parametrach: (i) octan etylu, m/z 45,00 i 61,00 od 4,2 do 4,6 min czasu retencji (RT), (ii) octan izopropylu, m/z 45 i 102 od 4,7 do 5,0 min RT, (iii) octan propylu, m/z 59 i 73 od 5,2 do 5,8 min RT, (iv) izomaślan etylu, m/z 45 i 102 od 4,7 do 5,0 min RT, 73 i 116 od 6,1 do 6,6 min RT, (v) octan izobutylu, m/z 61 i 101 od 6,6 do 7,6 min RT, (vi) octan butylu, m/z 61 i 116 od 7,7 do 9,2 min RT, (VII) izobutyloizomaślan, m/z 89 i 129 od 10,1 do 12.5 min RT, (viii) octan benzylu, m/z 108 i 150 od 13,1 do 13,8 min RT i (ix) octan 2-fenetylu, m/z 104 i 121 od 13,8 do 15,5 min RT. jako wewnętrzne wzorcowe anality użyto alkoholu Izoamylowego i octanu izoamylu. Estry zidentyfikowano za pomocą RT i określono ilościowo za pomocą obszarów piku i krzywych standardowych. Standardowe krzywe oznaczono za pomocą czystych estrów rozcieńczonych do heksadekanu w stężeniach 0,01 g/L, 0,05 g/L, 0,1 g/L, 0,5 g/L i 1 g/L.