materiały i metody
po otrzymaniu pisemnej świadomej zgody od pacjentek, zbadaliśmy farmakokinetykę klonidyny podawanej doustnie w osoczu 17 kobiet w ciąży otrzymujących klonidynę w połowie ciąży (22-26 tydzień ciąży) lub późnej ciąży (34-38 tydzień ciąży). Sześć z tych kobiet uczestniczyło w pobieraniu próbek osocza matczynego i pępowinowego (tętniczego i żylnego) w czasie porodu w celu pomiaru stężenia klonidyny. Wiek ciążowy opierał się na ostatniej miesiączce lub wczesnym badaniu USG.
Wybór Tematu. Badanie to zostało zatwierdzone przez University of Washington Investigational Review Board. Osoby, które były w ciąży, w wieku 18 lat, miały hematokryt ≥28% i otrzymywały klonidynę doustnie w leczeniu nadciśnienia tętniczego u matki.
Schemat Dawkowania. Doustne leczenie klonidyną nie zostało zmienione w celach badawczych. Dawki wahały się od 0,15 do 0,30 mg na dobę, podawane w dawkach podzielonych. Czas trwania badania farmakokinetycznego zależał od odstępu między dawkami pacjenta, który wynosił od 6 do 12 godzin. przez 3 dni przed badaniem dostarczano doustne tabletki klonidyny z tej samej partii produkcyjnej. Pacjenci zapisywali czas każdej dawki w kalendarzu badań. Pacjenci przyjmowali poranną dawkę klonidyny w ciągu 30 minut od 8:00 rano. Kolejne dawki przyjmowano w ciągu 30 minut od zaplanowanego czasu podania. Rano, w trakcie badania farmakokinetycznego, poproszono pacjentów o post, z wyjątkiem przezroczystych płynów, przez 5 godzin przed podaniem klonidyny do 1 godziny po podaniu.
Przykładowa Kolekcja. Seryjne próbki osocza pobierano w następujących okresach: 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, i 12 h po podaniu, lub obcięte, aby odpowiadały interwałowi dawkowania podmiotu. W celu określenia klirensu nerkowego klonidyny i klirensu kreatyniny pobrano mocz w ciągu jednej przerwy między dawkami. W czasie porodu pobrano próbki osocza matki i pępowiny (tętniczej i żylnej) w celu określenia ilościowego stężenia klonidyny. Wszystkie próbki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy próbki.
Stężenia Klonidyny. Stężenia klonidyny w osoczu oznaczano ilościowo przy użyciu zwalidowanej chromatografii cieczowej/spektrometrii masowej (LC / MS). Krótko mówiąc, 250 µl próbek osocza zmieszano z 500 pg wzorca wewnętrznego (klonidyna-d4) w 500 µl węglanu sodu (0,1 M) (pH = 9,3) i 3 ml heptanu/alkoholu izoamylowego (98,5:1,5). Normy zostały przygotowane przez dodanie ślepej plazmy z 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 250, 375, 500, i 750 pg klonidyny. Próbki wstrząsano na poziomym wytrząsarce przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu (1500 g przez 10 minut) próbki zamroziono na suchym lodzie, a warstwę organiczną zdekantowano do czystej probówki hodowlanej. Do warstwy organicznej dodano dwa mililitry kwasu siarkowego (0,05 M) i ponownie wstrząsano przez 15 minut. Po odwirowaniu (1500 g przez 10 minut) próbki zamrażano na suchym lodzie i odrzucano warstwę organiczną. 200 µl aliquot z 29.Do warstwy wodnej dodano 29% wodnego wodorotlenku amonu wraz z 3 ml heptanu / alkoholu izoamylowego (98,5: 1,5)i wstrząsano przez 15 minut. Po odwirowaniu (1500 g przez 10 minut) próbki zamroziono na suchym lodzie, a warstwę organiczną zdekantowano do czystej probówki hodowlanej. Warstwę organiczną odparowano pod strumieniem azotu w temperaturze 40°C. pozostałość odtworzono 75 µl kwasu mrówkowego (12 mM)/metanolu (60:40), z czego 10 µl wstrzyknięto do układu LC/MS.
próbki moczu o objętości 250 µl zmieszano z 250 µl kwasu mrówkowego (12 mM) i 50 ng wzorca wewnętrznego (klonidyna-d4). Normy zostały przygotowane przez dodanie moczu ślepego z 0, 1.25, 2.5, 6.25, 12.5, 18.75, i odpowiednio 25 ng klonidyny.
system LC/MS był systemem Agilent 1100 MSD (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) składającym się z pompy binarnej, autosamplera, przedziału kolumnowego i spektrometru masowego. Kolumna do wysokosprawnej chromatografii cieczowej to Phenomenex Synergi Polar Rp80a, 250 mm × 2.0 mm, 4 µm (Phenomenex, Torrance, CA). Kolumnę utrzymywano w temperaturze 40°C. składnikami fazy ruchomej były 12 mM kwas mrówkowy (A) i metanol (B), przy początkowym natężeniu przepływu 0,25 ml/min. Początkowa faza ruchoma utrzymywała się przez 1 minutę i składała się z 40% B dla próbek osocza i 35% B dla próbek moczu. Procent B zwiększano liniowo przez następne 4 minuty do 90% dla osocza i 60% Dla moczu, a następnie utrzymywano go na stałym poziomie przez 1 minutę z liniowym wzrostem przepływu do 0,3 ml/min dla moczu i osocza. W przypadku gradientu powrotu procent B zmniejszył się liniowo w ciągu 1 minuty do 40% (osocze) lub 35% (mocz), które następnie utrzymywało się na stałym poziomie. Natężenie przepływu utrzymywało się na poziomie 0,3 ml / min przez 1 min, a następnie liniowo zmniejszało się w ciągu 1 min do 0,25 ml / min, a następnie utrzymywało się na stałym poziomie. Łączny czas biegu wynosił 12,5 min. Zarówno w testach plazmowych, jak i w moczu, spektrometr masowy działał w trybie elektroopryskiwania dodatniego i ustawiono do selektywnego monitorowania jonów m/z 230 (klonidyna) i m/z 236 (klonidyna-d4) z czasem przebywania 289 ms dla każdego jonu.
Parametry Farmakokinetyczne. Parametry farmakokinetyczne w stanie stacjonarnym oznaczano za pomocą standardowych technik niepodzielnych. Pole pod krzywą stężenia klonidyny w osoczu w czasie w ciągu jednego przedziału dawkowania (AUCt) obliczono przy użyciu liniowej reguły trapezoidalnej. Pozorny klirens po podaniu doustnym (CL/F) obliczono na podstawie Cl/F = dawka / AUCt. Klirens nerkowy klonidyny (CLrenal) obliczono na podstawie CLrenal = AE,τ/AUCt, gdzie AE,τ = ilość klonidyny wydalanej w postaci niezmienionej z moczem w ciągu jednego okresu dawkowania. Klirens kreatyniny obliczono według CrCl = (VolumeUrine × Creatineurine) / (Creatineserum× τ). Klirens nerkowy klonidyny skorygowany o szybkość przesączania kłębuszkowego (GFR) obliczono przez clrenal skorygowany o GFR = clrenal – fu × CrCl, gdzie przyjęto, że frakcja niezwiązana w osoczu (fu) wynosi 0,80 (Hulter i wsp., 1979). U wszystkich naszych pacjentów stosunkowo krótki odstęp między dawkami nie pozwalał na dokładne oszacowanie okresu półtrwania klonidyny, który wcześniej donoszono, że wynosi 11,1 ± 3,3 i 10,8 ± 2,2 h u zdrowych osób dorosłych bez ciąży (Cunningham et al., 1994; Fujimura et al., 1994).
statystyki. Nasze parametry farmakokinetyczne klonidyny w ciąży zostały porównane z wcześniej opublikowanymi parametrami u zdrowych, nieciążących ochotników(Cl / F, Porchet i in., 1992; Cunningham et al., 1994) (CLrenal, Fujimura et al., 1994). Regresję liniową wykorzystano do określenia korelacji między klirensem kreatyniny a klirensem nerkowym klonidyny. Test t nieparowanej studentki został użyty do porównania grup ciężarnych i nieciążających. Wartość p <0, 05 została uznana za znaczącą. Wszystkie wyniki są podawane jako średnia ± S. D.