dyskusja
dorosłe robaki C. sinensis, które zostały inkubowane w pożywce bulionowej, wytworzyły na początku ponad 4000 jaj/robaka/dzień. Następnie liczba jaj zmniejszyła się do nieco powyżej 1000 W dniu 7 i do 300-400 w dniu 14. W 28 dniu w mediach rosołowych liczba ta stała się niższa niż 100. Liczenia były podobne do siebie wśród 3 mediów rosołowych. W przeciwieństwie do tego, Liczba Locke ’ s soultion wynosiła odpowiednio 220±44 i 1023±64 w dniu 1 i 3. Na początku liczba ta była niższa niż w pożywkach rosołowych, ale robaki wyprodukowały więcej jaj w dniu 21 i Później. Robaki w pożywce rosołowej wytwarzały swoje jaja bardziej energicznie we wczesnej fazie inkubacji, podczas gdy te w roztworze Locke ’ a wytwarzały mniej jaj dziennie, ale przez dłuższy okres. Dzienna liczba 4000 jaj przez jednego dorosłego robaka była zgodna z szacowaną średnią liczbą 3770 jaj od zarażonego człowieka .
w oparciu o liczbę jaj, całkowite jaja wytworzone przez inkubowanego dorosłego robaka, odzyskane od królików po 8 tygodniach infekcji, oszacowano średnio na 37,274±2,988. Całkowita liczba jaj była podobna niezależnie od roztworu hodowlanego lub pożywki. Dzienna liczba jaj gwałtownie spadła, a macica stała się pusta podczas uprawy. W związku z tym obecna dobowa liczba jajek stanowiła, że hodowane in vitro robaki wytwarzały tylko wewnątrzmaciczne jaja, które były preformowane w macicy podczas życia u królików przed uprawą. Na podstawie tych danych szacuje się, że jeden gatunek C. sinensis zawiera około 37 000 jaj w swojej macicy i produkuje około 4 000 jaj dziennie. W związku z tym jaja mogą pozostać w macicy około 10 dni do dojrzewania wewnątrzmacicznego. Większość jaj w macicy okazała się dojrzała i miracidium już się rozwinęło, ale niektóre z nich były niedojrzałe głównie w proksymalnej macicy. Te niedojrzałe jaja nie rozwijały się dalej w trakcie uprawy. Wyniki te sugerują, że uprawiane robaki nie są w stanie sformułować nowych żywych jaj, a dojrzewanie wstępnie uformowanych niedojrzałych jaj jest również niemożliwe dzięki uprawie in vitro.
jaja C. sinensis mają rozmiar 28-31×13-16 µm, mają operculum na stożkowatym końcu i małą gałązkę. W niniejszym badaniu wydalone jaja wykazały nieprawidłowy kontur, ponieważ robak przetrwał dłużej. Średnia długość jaja zmniejszała się stopniowo i znacząco w roztworze Locke 'a (27,49±0,48 µm) i we wszystkich pożywkach. Zmniejszenie długości spowodowało zmniejszenie wartości FMI. FMI zaproponowano jako parametr do analizy biometrycznej w celu przybliżenia objętości jaj dla przywry heterofiidowe i opisthorchiidowe . W niniejszym badaniu wartości FMI zmniejszyły się w dniu 60 w roztworze Locke ’ a i w dniu 90 w pożywce rosołowej. Zmniejszone wartości FMI sugerują zmniejszenie objętości jaj poprzez skurcz długości i degenerację zawartości. Większość jaj wyprodukowanych po 60 dniach uprawy in vitro uległa deformacji, a ich stosunek długości do szerokości był mniejszy niż 1,7, a wartość FMI mniejsza niż 7000. Większość z tych jaj uznano za niezdolne do życia po zabarwieniu trypan blue. Uprawa przez 60 dni może być maksymalnym okresem żywotności jaj.
lekkie obserwacje mikroskopowe wykazały nagromadzenie wakuoli i ciemnych mas wewnątrz skorupki jaja, ponieważ uprawa trwała dłużej niż 60 dni. Wakuole i ciemne masy zdawały się być zdeformowanymi komórkami witelliny, jak pokazano u O. viverrini . Te materiały w jajach sugerowały, że komórki witelliny lub inne materiały tworzące jaj ulegały degeneracji, a jaja były poronne. Dojrzałe jaja, które tworzą miracidium, mogą przetrwać długo, ale przerwane nie. Degeneracja materiałów wewnętrznych mogła spowodować deformację i zmniejszenie objętości jaj. W badaniu stwierdzono zdeformowane jaja u dojrzałych osobników Echinostoma caproni, przechowywanych w roztworze Locke ’ a do 4 miesięcy w temperaturze 4°C. Jednym z możliwych wyjaśnień powyższych zmian może być niewłaściwe garbowanie chinonów, które jest związane z procesem powstawania skorupki jaja. Długotrwała uprawa in vitro mogła wpływać na ten proces enzymatyczny, w którym pośredniczy fenol-oksydaza, powodując zdeformowanie skorupki jaja . W ten sposób przedłużona uprawa in vitro C. sinensis może deformować jaja, a także ich żywotność.
dojrzałe jaja C. sinensis zawierają bardzo niepozorny pokrętło. „O. viverrini”, blisko spokrewniony z „o. viverrini”, wykazuje również bardzo małe lub lekko rozwinięte Gałki jajowe . W omawianym badaniu gałka oczna skorupki jaja stała się bardziej widoczna u większości jaj po 60 dniach inkubacji. Pojawienie się tak wybitnego pokrętła abopercular było oczywiste w większości zdegenerowanych jaj. Krejci i Fried wykazali, że gałka oczna może być płytko lub głęboko osadzona w skorupce jaja odpowiednio u Echinostoma caproni i E. trivolvis. W niniejszym badaniu nie zaobserwowano powstawania Gałki operkularnej otaczającej skorupę. Wydatne pokrętło abopercular może być przedłużeniem istniejącego normalnie niepozornego pokrętła w odpowiedzi na zmieniającą się fizjologię umierających robaków. Razem, to jest trudne dla przywry do produkcji normalnych zdolnych do życia jaj w hodowli in vitro.
struktura powierzchni jaj, obserwowana przez SEM, wydawała się być odpowiednią cechą morfologiczną do zrozumienia statusu skorupki jaja. Wśród opisthorchiidae powierzchnia jaja C. sinensis jest niezwykle wyrzeźbiona, aby tworzyć splecione zmarszczki o różnej wysokości, co pomaga w zdolności do gromadzenia naturalnych włókien wodnych i zwiększa możliwość kontaktu z mięczakami . W niniejszym badaniu zmniejszona zmarszczka powierzchniowa została zaobserwowana przez SEM przerwanych jaj. To zmniejszone zmarszczki z widocznym pokrętłem abopercular może być wynikiem procesu degeneracji skorupki jaja.
niniejsze badanie miało kilka ograniczeń. Brak bezpośrednich danych dotyczących żywotności jaj w porównaniu ze zmianami morfologicznymi. Wylęganie jaj in vitro może dać dokładne informacje o żywotności jaja, ale jaja C. sinensis nadal nie są w stanie. Ograniczono również dane dotyczące morfologii i fizjologii inkubowanych robaków.
podsumowując, uprawiane C. robaki sinensis w pożywce bulionowej przechodzą żywotne jaja przez 60 dni, które są preformowane w macicy podczas przeżycia u królików. Wstępnie uformowane niedojrzałe jaja nie są w stanie rozwinąć miracidium w wyniku uprawy in vitro. Jeden dorosły C. sinensis zawiera około 37 000 jaj w macicy i produkuje około 4000 jaj dziennie. Zdeformowane jaja o wartości FMI mniejszej niż 7000 i stosunku długości do szerokości mniejszym niż 1,7 są niezdolne do życia.