ototoksyczność cisplatyny obejmuje cytokiny i sieć sygnałową STAT6

odczynniki

cisplatyna i bromek 3-(4, 5-dimetylotiazol-2-ilo)-2, 5-difenylo-tetrazolium (MTT) zostały zakupione od Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, USA). Materiały do hodowli plastycznej zostały zakupione od Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA). Zmodyfikowane podłoże podstawowe Dulbecco (dmem), płodowa surowica bydlęca (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) i inne odczynniki do hodowli tkankowych uzyskano z Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Rekombinowane mysie białko IL-4 i IL-13, przeciwciała przeciwko IL-4, IL-13, TNF-α, IL-1β, IL-6 i zestawy testów immunoenzymatycznych (ELISA) (QuantikineR) dla cytokin zakupiono od R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Przeciwciała te stosowano do immunohistochemii w stężeniu 1: 200. Przeciwciała przeciwko p-STAT4, STAT4, P-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) i IkB zostały zakupione od Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, CA, USA).

kultura komórkowa i żywotność

ustanowienie i charakterystyka warunkowo uwiecznionych komórek słuchowych HEI-OC1 opisano w naszym poprzednim raporcie 1. Ekspresja markerów specyficznych dla OHC, takich jak Math1 i miozyna 7a sugeruje, że komórki HEI-OC1 reprezentują prekursory OHC. Komórki Hei-OC1 utrzymywały się w wysoko-glukozowym DMEM (Gibco BRL) zawierającym 10% FBS. Do eksperymentów opisanych poniżej komórki HEI-OC1 hodowano w następujących warunkach: 33 °C i 5% CO2 w DMEM uzupełnionym 10% FBS. Komórki (3 × 104 komórki/studzienkę płytki 24-studzienkowej) inkubowano z cisplatyną 20 µM przez 24 godziny. w celu określenia żywotności komórek dodano MTT (0,25 mg) do 1-ml zawiesiny komórkowej przez 4 godziny. po umyciu komórek i trzech płukaniach PBS (pH 7,4) nierozpuszczalny produkt formazanu rozpuszczono w DMSO. Gęstość optyczną (OD) każdej studzienki hodowlanej mierzono za pomocą czytnika mikropłytek (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) przy 590 nm. OD komórek kontrolnych pobrano w celu wskazania 100% żywotności. Aby zbadać działanie różnych cytokin, do hodowli dodano przeciwciała neutralizujące przeciwko cytokin przez 30 minut, po czym hodowano je cisplatyną 20 µM przez 24 godziny.

Zwierzęta

STAT4−/− (backcross generation N10), STAT6−/− (backcross generation N6) i myszy WT BALB/c zakupiono w laboratorium Jacksona (Bar Harbor, ME, USA). Homozygotyczne myszy STAT4 i STAT6 KO zidentyfikowano metodą PCR. Myszy KO nie wykazywały żadnych nieprawidłowości rozwojowych. Eksperymenty przeprowadzono na 6-tygodniowych myszach, a wszystkie myszy dopasowano do wieku w ciągu 3 dni. Myszy karmiono standardową komercyjną dietą, trzymając je w temperaturze otoczenia 20-22 °C i wilgotności względnej 50 ± 5% w cyklu 12:12 h światło-ciemność w określonym obiekcie wolnym od patogenów. Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki i użytkowania zwierząt w Wonkwang University School Of Medicine.

test reporterowy Lucyferazy

komórki transfekowano przejściowo plazmidem reporterowym lucyferazy NF-kB przy użyciu odczynnika do transfekcji, Lipofektaminy 2000. Po 36 godzinach inkubacji komórki leczono cisplatyną przez 12 godzin w obecności przeciwciał neutralizujących cytokiny. Następnie komórki przemywano dwukrotnie buforem PBS, a następnie lizowano w buforze do lizy reporterowej (Promega, Madison, WI, USA). Następnie 20-µl aliquot lizatu zmieszano ze 100 µl odczynnika do oznaczania lucyferazy, po czym zmierzono natężenie emitowanego światła za pomocą Luminometru AutoLumat LB953 (EG I G Berthold, Bad Wildbad, Niemcy). Wreszcie, aktywność lucyferazy mierzono w trzech egzemplarzach, uśredniono, a następnie znormalizowano względem aktywności β-galaktozydazy za pomocą systemu oznaczania galaktozydazy (Galacto-Light, Tropix Inc., MA, USA) zgodnie z instrukcją producenta.

transfekcja z konstrukcjami siRNA

predefiniowane sirna przeciwko myszom STAT4, STAT6 i sterowaniu siRNA zostały zakupione w Santa Cruz Biotechnology. Sensy siRNA wobec STAT4 i STAT6 są następujące. Konstrukt STAT4 siRNAs jest zbiorem trzech sekwencji siRNA w następujący sposób: Duplex 1 Sense Strand: 5′-IndexTermGUA GCU GUG GUA AUU UCA a-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA a-3’i Duplex 3 Sense Strand: 5′-IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA a-3 ’ (numer akcesyjny mRNA: nm_011487). Konstrukt STAT6 siRNAs jest zbiorem trzech sekwencji siRNA w następujący sposób: Duplex 1 Sense Strand: 5′-IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC a-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG a-3’i Duplex 3 Sense Strand: 5′-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG a-3 ’ (numer przystąpienia mRNA: nm_009284). Komórki transfekowano przejściowo 100 nM konstruktów siRNA w odczynniku do transfekcji x-tremeGENE siRNA (Roche Applied Science, Penzberg, Niemcy)zgodnie z protokołem producenta. Po inkubacji w temperaturze 33 °C i 5% CO2 przez 36 godzin, komórki dalej traktowano cisplatyną przez 24 godziny. próbki następnie przygotowywano i analizowano w celu uzyskania żywotności lub analizy Western blot. Interferencja ekspresji została potwierdzona analizą immunoblotową.

pomiar cytokin prozapalnych metodą ELISA

aby zmierzyć wydzielanie cytokin prozapalnych z komórek leczonych cisplatyną, w każdym punkcie czasowym zbierano supernatanty hodowlane, a następnie oznaczano poziomy wydzielanych cytokin prozapalnych metodą ELISA (Zestawy cytokin Kwantikinowych; R& D Systems Inc.) zgodnie z instrukcją producenta.

wytwarzanie ekstraktów cytozolowych i jądrowych

komórki przemyto zimnym lodem PBS, zeskrobano i odwirowano w temperaturze 1000× g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. osad komórkowy następnie ponownie zawieszono w 200 µl buforu lizy (10 mm HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM fluorku fenylometylosulfonylu i 0,5 mm ditiotreitolu), a następnie inkubowano na lodzie przez 15 min. Pod koniec inkubacji Dodano 10 µl 10% NP-40 i probówkę wirowano przez 10 s. Po odwirowaniu w temperaturze 13 000× g przez 1 min w temperaturze 4 °C supernatant (ekstrakt cytozolowy) zebrano i przechowywano w temperaturze -80 °C, podczas gdy pellet dalej przetwarzano w celu uzyskania ekstraktów jądrowych. Następnie osad ponownie zawieszono w buforze ekstrakcyjnym (5 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreitolu i 25% (obj.) glicerolu) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 4 °C. ekstrakty jądrowe izolowano przez odwirowanie w temperaturze 13 000× g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant następnie usunięto i przechowywano w temperaturze -80 °C do momentu wykorzystania do analizy Western blot. Ostatecznie stężenie białka oznaczono metodą Lowry ’ ego.

Analiza Western blot

Analiza Western blot została przeprowadzona w następujący sposób. Krótko, komórki zebrano i przemyto dwukrotnie lodowatym PBS. Frakcjonowane lizaty całkowite i jądrowe/cytosolowe poddano następnie elektroforezie na 12% żelach poliakryloamidowych SDS przez 3 godziny przy 20 mA, po czym przeniesiono je do nitrocelulozy. Błonę następnie inkubowano w 5% (w/obj.) wysuszonym białku mleka w PBS zawierającym 0,05% (obj.) Tween-20 (PBS-T) przez 1 godzinę, po czym przemyto je w PBS-t, a następnie poddano reakcji z pierwotnym przeciwciałem (1:1 000) przez 1 godzinę.następnie błonę intensywnie przemyto PBS-t, a następnie inkubowano z przeciwciałem IgG anty-króliczym sprzężonym z HRP (1:3 000) przez 1 godzinę. po rozległych przemytach, pasma białkowe na membrany wizualizowano za pomocą odczynników chemiluminescencyjnych zgodnie z zaleceniami producenta (substrat supersignal; Pierce, Rockford, IL, USA).

in vivo eksperyment ototoksyczności cisplatyny

wszystkie myszy losowo podzielono na dwie grupy po sześć myszy każda. Zwierzęta z grupy 1, które uznano za grupę kontrolną, otrzymały wstrzyknięcie dootrzewnowe PBS. Zwierzętom z grupy 2 podawano cisplatynę (4 mg / kg masy ciała) we wstrzyknięciu dootrzewnowym przez 4 kolejne dni. Zwierzęta zabito w znieczuleniu gazem CO2 następnego dnia po ostatnim wstrzyknięciu cisplatyny, po czym usunięto kość skroniową prawego ucha.

pomiar ABR

w celu dalszej analizy progu słuchowego, ABR mierzono przed i 24 godziny po zakończeniu leczenia cisplatyną. Następnie porównano zmiany progowe ABR pomiędzy leczeniem przed i po leczeniu. Myszy znieczulono za pomocą koktajlu ketaminy (40 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) i trzymano w cieple za pomocą poduszki grzewczej podczas nagrywania ABR. Podskórna (aktywna) elektroda igłowa została wprowadzona na wierzchołek, podczas gdy uziemiona i odniesienia elektrody zostały umieszczone subdermalnie w luźnej skórze pod szczypcami przeciwległych uszu. Bodźce testowe polegały na naprzemiennych fazowych impulsach tonalnych o częstotliwościach 4, 8, 16 i 32 kHz. Sygnały były generowane przy użyciu Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) SigGen software. Każdy impuls tonowy (czas trwania 1 ms) był zamykany przez okno Blackmanna i miał czas narastania-opadania 0,5 ms bez plateau. Bodźce zostały skalibrowane przed każdą sesją testową, rejestrując wyjście głośnika za pomocą mikrofonu umieszczonego na poziomie głowy zwierząt. Przebiegi ABR były uśredniane w odpowiedzi na 300 impulsów tonu na każdej badanej częstotliwości. Przy każdej częstotliwości amplituda sygnału była automatycznie tłumiona w krokach 10 dB od 90 dB SPL do momentu, gdy fale ABR zniknęły w śladach rejestrowanych z ustawieniami filtrów 100-3 000 Hz. Ocena progu dokonana została w trybie off-line przez dwóch niezależnych, eksperymentalnie ślepych obserwatorów na podstawie zapisów ABR.

przygotowanie powierzchni narządu Corti explants

wszystkie myszy zabito w dniu po ostatnim wstrzyknięciu cisplatyny. Kość skroniową wycięto i utrwalono w 4% paraformaldehydu przez 16 godzin w temperaturze 4 °C, a następnie przepłukano 0,1 M PBS. Kość skroniowa była następnie dekalcyfikowana 10% EDTA w PBS przez 3 dni. Ślimak został dokładnie wypreparowany. Następnie rozcięto prążek naczyniowy i więzadło spiralne, pozostawiając narząd Cortiego. Środkowy obrót ślimaka zanurzano w oznaczonej TRITC falloidinie (Sigma P1951, 1: 100) w PBS na 20 min. Po trzech płukaniach PBS próbkę zbadano pod mikroskopem fluorescencyjnym z użyciem odpowiednich filtrów dla TRITC (wzbudzenie: 510-550 nm, emisja: 590 nm).

immunohistochemiczne barwienie i test tunelowy

usuniętą kość skroniową utrwalano w 4% paraformaldehydu przez 16 godzin, a następnie dekalcyfikowano 10% EDTA w PBS przez 2 tygodnie, po czym odwodniono ją i osadzono w wosku parafinowym. Sekcje 5 µm deparaffinizowano w ksylenie i ponownie nawodniono przez stopniowane stężenia etanolu. Do badania immunohistochemicznego zastosowano zestaw immunohistochemiczny (DAKO Lsab Universal K680, Carpinteria, CA, USA) i procedury przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie endogenną peroksydazę blokowano 3% nadtlenkiem wodoru przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Po przepłukaniu sekcji PBS, niespecyficzne Wiązanie blokowano 1% albuminą surowicy bydlęcej przez 1 godzinę. następnie do szkiełek dodawano pierwotne przeciwciała (rozcieńczone w stosunku 1: 200), po czym inkubacja trwała przez 1 godzinę. po wielokrotnym przemywaniu PBS, sekcje inkubowano z biotynylowanym przeciwciałem wtórnym przez 30 minut, a następnie przez 30 minut przykrywano przeciwciałem wtórnym zawierającym peroksydazę chrzanową. Na koniec sekcje barwiono w świeżo przygotowanym roztworze substratu (3 mg 3-amino-9-etylokarbazolu w 10 ml buforu octanu sodu (pH 4,9), 500 µl dimetyloformamidu, 0,03% nadtlenku wodoru) przez 5 minut. Jądra komórek barwionych immunologicznie zostały następnie przeciwstawione hematoksyliną Mayera (Sigma-Aldrich Co.). Komórki apoptotyczne wykryto in situ przy użyciu testu TUNELA (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Niemcy). Na krótko odcinek został zdaraffinizowany i nawodniony. Po inkubacji z 20 µg/ml proteinazy K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy), endogenną peroksydazę blokowano przez inkubację próbek w 2% H2O2 w metanolu przez 30 minut w RT. następnie sekcje tkankowe przemywano w PBS i inkubowano roztworem etykietującym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. jądra następnie przeciwstawiano jodkiem propidium (0,5 µg/ml, sondy molekularne) przez 10 minut w RT. po przemywaniu PBS próbka była badana pod wpływem mikroskop fluorescencyjny.

amplifikacja odwrotnej transkryptazy-PCR

w przypadku PCR ślimakowego kość skroniowa lewego ucha została szybko zebrana i zanurzona w RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) aż do użycia w temperaturze -20 °C. Następnie całe cochleae rozcięto i wykorzystano do ekstrakcji całkowitego RNA za pomocą Trizolu (Invitrogenu) zgodnie z protokołami producenta. Po ekstrakcji całkowitego RNA za pomocą Trizolu (Invitrogenu), jednoniciowy cDNA zsyntetyzowano z całkowitego RNA. Następnie PCR z polimerazą DNA TAQ (Takara, Takara Shuzo, Japonia) przeprowadzono poddając próbki 30 cyklom 95 °C przez 40 s, 58 °C przez 40 s I 72 °C przez 50 s. dziesięć mikrolitrów produktów PCR oddzielono na 1,2% żelu agarozowym i wizualizowano w świetle UV. Sekwencje starterów używanych do amplifikacji PCR były następujące: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, reverse, 5 ’- IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3′).

analiza statystyczna

każde doświadczenie przeprowadzono co najmniej trzy razy, a wszystkie zgłoszone wartości reprezentują średnią ± SD analiz potrójnych. Statystyczna analiza wielowymiarowa została przeprowadzona przez analizę wariancji i testy Duncana, przy użyciu oprogramowania statystycznego SPSS 11 (Chicago, IL, USA). Dwukierunkowa ANOVA i / lub jednokierunkowa ANOVA zostały wykorzystane do określenia znaczenia wyników. Wyniki statystyczne zostały zweryfikowane przez biostatystę na poziomie magisterskim. Wartości P < 0.05 uznano za istotne statystycznie.