mikrodelecja chromosomu Y u ojca i jego czterech bezpłodnych synów

Streszczenie

Mikrodelecje YQ są związane z azoospermią i ciężką oligozoospermią. Ogólnie rzecz biorąc, mężczyźni z delecjami są niepłodni i dlatego delecje nie są przenoszone na synów, chyba że wykonuje się zapłodnienie in vitro (IVF) i intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Zgłaszamy niezwykłą rodzinę charakteryzującą się wieloma członkami z niepłodnością i mikrodelecją Yq. Pełna historia rozrodcza, analizy nasienia i próbki krwi zostały wywołane od odpowiednich członków rodziny. Przygotowanie DNA i oznaczanie ilościowe przeprowadzono przy użyciu komercyjnych zestawów. Do badania przesiewowego wykorzystano łącznie 27 par sekwencji oznaczonych miejsc opartych na zestawach starterowych specyficznych dla loci regionu mikrodelecji Y. Następnie analizowano plamy Południowe z wykorzystaniem cDNA delecji w azoospermii (DAZ) i rybosomalnego motywu wiązania (RBM) w celu potwierdzenia. Proband, jego trzej bracia i ojciec zostali usunięci za Daza, ale nie za Daza. W czasie analizy ojciec probanda był azoospermikiem, podczas gdy jego czterech synów było albo silnie oligozoospermikiem, albo azoospermikiem. W przeciwieństwie do ojca, czterech synów jest bezpłodnych i nie mają potomstwa, z wyjątkiem jednego z nich, który osiągnął córkę dopiero po leczeniu in vitro / ICSI niepłodności. Mikrodelecje Yq z udziałem genu DAZ są związane ze zmienną ekspresją fenotypową, która może obejmować ewidentnie normalną płodność.

wprowadzenie

niepłodność występuje u ~14% par (Mosher, 1985)i szacuje się, że nieprawidłowości u partnera płci męskiej występują nawet w połowie przypadków (Swerdloff et al., 1985). Próby oceny przyczyn azoospermii wykazały, że po wykluczeniu tradycyjnie rozpoznawalnych przyczyn (tj. nieprawidłowy kariotyp, niedrożność, żylaki powrózka nasiennego, defekt hormonalny itp.), większość przypadków (50-75%) są niewyjaśnione i są określane jako idiopatyczne (Pryor i wsp., 1997). Ostatnio doniesiono, że do 30% mężczyzn z „idiopatyczną” azoospermią ma mikrodelecje chromosomu Y(Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Dokładnie jak i czy te mikrodelecje powodują azoo / oligozoospermię jest przedmiotem zarówno intensywnych badań, jak i debaty.

istotnym argumentem, że mikrodelecje y powodują niepłodność, jest obserwacja, że płodni mężczyźni rzadko manifestują mikrodelecje Y. Odnotowano mikrodelecje u czterech na 200 płodnych mężczyzn badanych(Pryor i wsp ., 1997). Jednak delecje u tych mężczyzn były bardzo małe i najprawdopodobniej reprezentowały nieznaczny polimorfizm. U mężczyzn z prawidłową płodnością nie zgłaszano stosunkowo dużych delecji tego rodzaju związanych z niepłodnością męską. Chociaż ogólnie przyjmuje się, że te delecje powstają de novo i że nie można oczekiwać przeniesienia mikrodelecji y z ojca na syna, odnotowano kilka rzadkich przypadków przeniesienia mikrodelecji z chromosomu Y z ojca na jednego syna (Kobayashi i wsp., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Jednak pionowe przenoszenie mikrodelecji z udziałem usuniętego w azoospermia (DAZ) locus z ojca na jednego syna odnotowano tylko w trzech przypadkach (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Opisujemy teraz czteropokoleniową rodzinę, w której azoospermiczny ojciec i jego czterej bezpłodni synowie dzielą pozornie identyczną mikrodelecję, która obejmuje locus DAZ. Rodzina ta stanowi pierwszy i jedyny przypadek spontanicznego pionowego przeniesienia delecji DAZ na potomstwo wielodzietne. Dostarcza dowodów na to, że pojedyncza mikrodelecja Yq może prowadzić do zróżnicowanej ekspresji fenotypowej u różnych osób. Jest to klinicznie istotne, ponieważ obecność mikrodelecji nie jest absolutnym markerem niepłodności i może być związana z pozornie normalną płodnością.

materiały i metody

badanie przesiewowe pod kątem mikrodelecji Yq przeprowadzono rutynowo w przypadku niepłodności męskiej przy użyciu protokołu sprawdzonego i zatwierdzonego przez Institutional Review Board of College Of Physicians & Surgeons, Columbia University. Próbki pobierano od pacjentów po uzyskaniu świadomej zgody.

analiza nasienia

wyniki analizowano przy użyciu kryteriów WHO za pomocą mikroskopu kontrastowego Nikon.

stężenia hormonów w surowicy

hormonu folikulotropowego (FSH), hormonu luteinizującego (LH) i testosteronu mierzono za pomocą dwuskładnikowego chemiluminescencyjnego testu immunometrycznego w fazie stałej (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Normalne zakresy dla mężczyzn to FSH <10 mIU/ml; LH <10 mIU/ml; i testosteron 270-1070 ng/dl.

genomowy DNA

ekstrakcję genomowego DNA z pełnej krwi przeprowadzono przez lizę czerwonych krwinek, a następnie lizę białych krwinek i ich jąder. Białka komórkowe usunięto przez wytrącanie soli, a genomowy DNA wytrącono izopropanolem przy użyciu Puregenowego zestawu do ekstrakcji DNA (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; Nr katalogowy D-5004).

reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

startery zostały wyprodukowane jako wysuszone oligonukleotydy na zautomatyzowanym syntezatorze DNA (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Z mapy STS wybrano łącznie 27 miejsc oznaczonych sekwencją specyficzną dla chromosomu Y (STS) (Rysunek 1) (Vollrath et al., 1992). Obejmują one trzy proponowane spermatogenezy loci AZFa, AZFb i AZFc (zgodnie z Vogt et al., 1996) w odstępach Yq 5, 6 i 7. Jako protokół szybkiego przesiewania zastosowano system multipleksowy PCR złożony z dwóch do sześciu różnych par starterów w łącznie sześciu reakcjach multipleksowanych (Tabela I). Przy każdym uruchomieniu PCR uwzględniono kontrolę żeńską i normalną kontrolę męską. Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono w płytkach poliwęglanowych (Techne®) w maszynie MJ Research®. Warunki PCR były zasadniczo takie, jak wcześniej opisano (Henegariu et al., 1993). Krótko, w reakcji o całkowitej objętości 14 µl, jako szablon użyto 50 ng genomowego DNA, 1 µl standardowego roztworu startera (mieszanina i lub II Lub III lub IV lub V lub VI składająca się z 10 pmol na starter), 12 µl zimnej mieszanki PCR (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l każdego dNTP, 5% DMSO, 1× bufor reakcji polimerazy Taq bez Mg2+), 1,25 J.M. polimerazy DNA TAQ (Promega) i 1 kropla oleju. Kompletne mieszanki umieszczano bezpośrednio w termocyklerze podgrzanym do temperatury 94°C. warunki cykli dla 27 cykli były: 94°C, 30 s (topienie); 55°C, 45 s (wyżarzanie); i 72°C, 60 s (rozciąganie). Ostateczny czas przedłużenia wynosił 5 min. Produkty reakcji PCR oddzielono następnie na 3% żelach agarozowych (Bio-Rad, ultra-czysty gatunek) za pomocą elektroforezy w buforze TBE. Produkty PCR barwiono bromkiem etydyny i wizualizowano przez ekspozycję na światło ultrafioletowe. STS nie wykazujące amplifikacji w reakcjach multipleksowych potwierdzono za pomocą pojedynczej reakcji PCR z odpowiednimi dodatnimi i ujemnymi kontrolami. STS uznano za nieobecny po trzech nieudanych amplifikacjach.

Południowa hybrydyzacja

Southern blotting przeprowadzono zgodnie z ustalonym protokołem (Sambrook et al., 1989). Krótko mówiąc, 5 µg genomowego DNA strawiono HindIII lub TaqI, przeprowadzono na 0,7% żelu agarozowym w standardowym buforze TBE, przeniesiono do membrany nylonowej i hybrydyzowano z sondami znakowanymi 32P. Sonda DAZ była oczyszczoną wkładką plazmidu (pDP1577) zawierającego cDNA pełnej długości (Reijo i wsp., 1995). Podobnie sonda RBM była wkładką plazmidową klonu cDNA RBM (MK5) (Ma i wsp., 1993).

ustalenie ojcostwa

ojcostwo wszystkich czterech synów zostało potwierdzone przez wykazanie oczekiwanej segregacji czterech wysoce polimorficznych markerów autosomalnych (Weber i maj 1989). Były to D21S156, d21s270, D13S132 i d13s159 o heterozygocie odpowiednio 0,83, 0,86, 0,84 i 0,90.

fluorescencyjną hybrydyzację in-situ (FISH)

ryby dla DAZ przeprowadzono z Cosmid 63C9 (Saxena i wsp., 1996), stosując ustalone metody (Yu et al., 1996).

wyniki

proband (osobnik III 8 na rysunku 2) i jego małżonek (III-9) przedstawili klinikę rozrodczo-Endokrynologiczno-niepłodności w Columbia-Presbyterian Medical Center ze skargą pierwotnej niepłodności przez 3 lata. Badania wykazały prawidłowy kariotyp i prawidłowy poziom hormonów w surowicy, podczas gdy analizy nasienia wykazały ciężką oligozoospermię (tabela II). Badanie przesiewowe mikrodelecji metodą PCR opartą na STS wykazało obecność mikrodelecji w podinterwale 6D-6F długiego ramienia chromosomu Y (Fig.1). Podczas dyskusji proband poinformował, że jego dwaj starsi bracia (III-4 i III-6) byli znani z azoospermizmu i bezpłodności. Późniejsze prace ujawniły, że wszyscy trzej bracia mieli pozornie identyczną mikrodelecję. Biopsja jądra przeprowadzona na jednym z nich (III-6) wykazała zespół „Sertoli cell only”.

odkrycie mikrodelecji u trzech niepłodnych braci sugerowało, że ich ojciec prawdopodobnie miał taką samą delecję. Szczegółowe badania przeprowadzono na pozostałej części rodziny, która mieszkała w małym miasteczku na Dominikanie. Pełna historia reprodukcji została wywołana od dorosłych członków rodziny. 2) potwierdzono poprzez wykazanie oczekiwanej segregacji kilku autosomalnych markerów polimorficznych (nie pokazano danych) dla odpowiednich członków rodziny (I-1, I-2, II-1, II-8 i II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Nie było dowodów na brak ojcostwa. Dokładne badania cytogenetyczne na odpowiednich członkach rodziny (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 I IV-1) wykazały prawidłowe kariotypy. Badanie nasienia przeprowadzono u siedmiu z 16 samców i pobrano próbki krwi od większości członków rodziny.

w Tabeli II podsumowano wyniki analizy nasienia i badania endokrynologicznego odpowiednich członków rodziny. Proband (III-8), jego ojciec (II-1) i dwóch z jego trzech braci (III-4, III-6) uznano za azoospermicznych lub silnie oligozoospermicznych. Najstarszy brat probanda (III-1) odmówił badania nasienia. Ponadto wuj probanda (II-8) miał azoospermię i podwyższony FSH z niskim testosteronem. Jak pokazano na fig. 1, proband, jego ojciec i trzej bracia wykazali mikrodelecję Yq metodą STS PCR. 3) i RBM (dane nie pokazane) potwierdziły, że delecja obejmowała locus DAZ, ale nie locus motywu wiązania RNA (RBM). Analiza ryb za pomocą Daz Cosmid 63c9 (Saxena et al., 1996) leukocytów ojca probanda (II-1) wykazywały jednolity brak locus DAZ (ryc. 4).

odkrycie, że osobnik II-8 w rodowodzie był azoospermiczny, ale nie miał mikrodelecji było zaskoczeniem. Locus DAZ u tego osobnika był dalej testowany przez Analizę Południową przy użyciu DAZ cDNA i innego enzymu restrykcyjnego (TaqI). Nie wykazał żadnych nieprawidłowości w locus DAZ. Ponadto ryby z Daz Cosmid 63c9 wykazywały normalną intensywność (dane nie zostały pokazane).

proband (III-8) i jego starszy brat (III-6) szukali leczenia niepłodności. Po intensywnej konsultacji zdecydowali się na zapłodnienie in vitro (IVF) i intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Proband (III-8) i jego żona (III-9) przeszli dwa cykle IVF-ICSI, które nie przyniosły ciąży wtórnej do słabej odpowiedzi jajników. Brat probanda (III-6) i jego żona (III-7) przeszli jeden cykl kontrolowanej hiperstymulacji jajników i pobrano dziewięć oocytów. Jedenaście dojrzałych plemników znaleziono w trzech ejakulatach w dniu pozyskania i użyto do ICSI. Zapłodniono trzy oocyty, które następnie rozszczepiono i przeniesiono. Urodziła zdrową samicę (IV-2).

dyskusja

donosimy o wyjątkowej rodzinie, w której azoospermiczny ojciec i jego czterej bezpłodni synowie dzielą pozornie identyczną mikrodelecję Yq obejmującą locus DAZ. De-novo mutacja, która doprowadziła do mikrodelecji DAZ wydaje się pochodzić od ojca probanda (II-1). Ta delecja ma spowodować azoo / oligozoospermię i niepłodność męską, a mimo to spontanicznie począł pięcioro dzieci i nie był świadomy żadnego problemu z płodnością. Co ciekawe, wszyscy czterej synowie są bezpłodni i są albo azoospermiczni, albo poważnie oligozoospermiczni.

ta rodzina podnosi kilka problemów w odniesieniu do związku między mikrodelecją Yq a niepłodnością. Po pierwsze, potwierdza, że pionowe przenoszenie mikrodelecji Yq jest możliwe i może prowadzić do późniejszej niepłodności u męskiego potomstwa. Po drugie, jest oczywiste, że ta sama delecja może skutkować różnymi fenotypami u różnych osób. Chociaż ojciec (II-1) z czterech chłopców w tej rodzinie był azoospermiczny w momencie analizy, spłodził swoje pierwsze dziecko w wieku 25 lat, a ostatnie w wieku 38 lat. W ten sposób posiadał pewien stopień płodności przez długi okres lat. Podobnie mikrodelecja chromosomu Y, w szczególności DAZ, niekoniecznie implikuje trwającą całe życie azoospermię ani nie wyklucza utworzenia dużej rodziny. Z kolei jego czterej synowie są bezpłodni i albo azoospermiczni, albo poważnie oligozoospermiczni.

Gen DAZ został zaproponowany jako czynnik azoospermii na chromosomie Y. Rodzina ta wyraźnie pokazuje, że DAZ może odgrywać kluczową rolę w spermatogenezie, ale nie jest niezbędny do płodności. Ponadto całkowita utrata klastra genowego DAZ może być związana z histologicznym obrazem „tylko komórki Sertoliego”, a także zatrzymaniem dojrzewania plemników (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Kilku autorów stwierdziło słabą korelację między lokalizacją mikrodelecji Y (w tym delecji DAZ) z klinicznym i histologicznym fenotypem pacjentów (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). Ustalenia w tej rodzinie zgadzają się, że taka korelacja może okazać się dość problematyczna. Biopsja jądra brata probanda (III-6) wykazała obraz „tylko komórki Sertoliego”, podczas gdy w przypadku probanda (III-8 z liczbą plemników 0,5×106/ml) można oczekiwać pewnego stopnia dojrzewania plemników podczas biopsji. Ponadto biopsja jądra może nie być reprezentatywna dla całego jądra, ponieważ może istnieć geograficzna niejednorodność dla spermatogenezy, jak u poszczególnych III-6, których ejakulaty zawierały Dojrzałe plemniki.

możemy jedynie spekulować na temat podstawy różnic fenotypowych między członkami rodziny o tej samej delecji. Powszechnie wiadomo, że identyczne delecje w autosomach mogą powodować różne fenotypy (Schinzel, 1994). Można postulować, że takie różnice są konsekwencjami ekspozycji każdego człowieka na jego otoczenie lub ekspresji różnych genów modyfikujących. Płodny ojciec został opisany z mikrodelecją, która rozszerzyła się, gdy została przekazana jego bezpłodnemu synowi (Stuppia et al., 1996). Chociaż rozszerzenia zmiennych na granicach delecji mogą istnieć między różnymi członkami naszej rodziny, tych rozszerzeń molekularnych nie można odróżnić przez mapowanie interwałów. Analiza PCR wykazała, że ten sam STSs nie uległ amplifikacji u naszych pięciu osobników, a Południowa hybrydyzacja z sondą DAZ potwierdziła całkowitą delecję tego klastra genów. Chociaż możliwe jest, że obserwowane delecje nie są w rzeczywistości identyczne, a sąsiednie obszary mogą zawierać ważne geny, które modulują stopień ekspresji fenotypowej, wyniki te nadal wskazują na duże nakładanie się usuniętego y DNA (w tym utratę klastra genów DAZ) u każdego osobnika z tej unikalnej rodziny.

byliśmy zafascynowani faktem, że Stryj probanda (II-8) ma niepłodność i azoospermię, ale nie ma wyraźnej mikrodelecji przez test STS. Ponieważ analiza southern blot przy użyciu sond RBM i Daz, jak również analizy ryb przy użyciu DAZ cosmid były całkowicie normalne, jesteśmy zmuszeni stwierdzić, że ma inną etiologię leżącą u podstaw jego niepłodności. Co prawda, możliwe jest, że może on mieć mniejszą lub punktową mutację/perturbację lub proksymalne/dystalne przegrupowanie, które nie jest wykrywalne obecnymi metodami. Nie podał historii narażenia na gonadotoksyny lub inne czynniki mogące wpływać na spermatogenezę.

do niedawna mikrodelecja Y miała niewielkie znaczenie kliniczne, ponieważ człowiek z delecją na ogół nie rozmnaża się. Jednak wykorzystując ICSI i aspirację plemników jąder (TESA), w połączeniu z IVF, możliwe jest teraz dla mężczyzn oligo/azoospermicznych z mikrodelecją y osiągnięcie ciąż (Mulhall et al., 1997; Silber et al., 1998, a indywidualnie III-6). Spowodowało to obawy, że takie ciąże mogą produkować męskie potomstwo z podobnymi mikrodelecjami i późniejszą niepłodnością (Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). Rzeczywiście, mikrodelecja Yq może być przekazywana męskiemu potomstwu za pośrednictwem ICSI(Kent-First et al., 1996). Rodzina, którą zgłaszamy, sugeruje, że mężczyźni z mikrodelecjami Yq (takimi jak indywidualni II-1), którzy osiągają ciążę, przenoszą ten sam mikrodelecję i ryzyko niepłodności na swoich synów (osoby III-1, III-4, III-6, III-8). W związku z tym pacjenci powinni być poddani badaniu przesiewowemu mikrodelecji Y przed ICSI i powinni być poinformowani o pewności przeniesienia mikrodelecji Yq i ewentualnej niepłodności na swoich synów. Ponieważ więcej badań koncentruje się na genetycznej etiologii męskiej niepłodności, identyfikacja genów zaangażowanych w spermatogenezę powinna zapewnić wgląd w patofizjologię męskiej niepłodności i bardziej racjonalne podstawy do rozpoczęcia terapii.

dziękujemy rodzinom za współpracę w badaniu; dr David C. Page za dostarczenie sondy DAZ cDNA i jego nieocenioną pomoc przy tym manuskrypcie; Dr Kun Ma za dostarczenie sondy MK5 (RBM1) cDNA; Dr Peter Vogt za DNA mikrodeletowanych osób YQ wykorzystywanych do walidacji naszej metodologii STS PCR; oraz C. C. Yu i Patricia Lanzano za nieocenioną pomoc techniczną.

to badanie zostało częściowo sfinansowane przez Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials House Staff Awards.