mechanizmy rearanżacji chromosomów w ludzkim genomie

patologiczne DSBs są arbitralnie definiowane jako DSBs, które nie służą fizjologicznemu celowi i mogą prowadzić do dysfunkcji komórek.

losowe przerwy DNA z powodu promieniowania jonizującego lub oksydacyjnych wolnych rodników

w wielu rearanżacjach chromosomowych, DSBs w jednym lub obu genach wydają się być zlokalizowane losowo w dużych regionach wielu kilobaz. Losowe pozycjonowanie i widoczny brak skłonności do sekwencji sugerują niespecyficzne mechanizmy sekwencji DSB, takie jak utleniające wolne rodniki, promieniowanie jonizujące lub rzadziej spontaniczna hydroliza szkieletu DNA.

około połowa naturalnego promieniowania jonizującego środowiska pochodzi z naturalnych metali ciężkich ziemi, takich jak uran, tor, a nawet potas. Druga połowa promieniowania jonizującego pochodzi od promieniowania kosmicznego, które nie jest całkowicie zablokowane przez atmosferę. W sumie około 3 x 108 cząstek promieniowania jonizującego przechodzi przez każdego z nas co godzinę, wytwarzając wolne rodniki hydroksylowe z wody w ich następstwie. Ten układ wolnych rodników hydroksylowych powoduje uszkodzenie klastra na DNA, tym samym łamiąc obie nici DNA.

około 0,1% tlenu, którym oddychamy, przekształca się w wolne rodniki . Generuje to 3 x1022 wolnych rodników na godzinę w każdym z nas, a te szkodliwe wolne rodniki są rozprowadzane w 1014 komórkach ludzkiego ciała. Wolne rodniki powodują głównie jednoniciowe uszkodzenia DNA, ale dwa pobliskie takie zdarzenia mogą spowodować DSB.

działanie RAG w tajemniczych witrynach RSS w lokalizacjach poza celem w sposób specyficzny dla sekwencji: przerwy typu V(D)J

Sekwencja konsensusu heptamera/nonamera RSS nie jest w żaden sposób unikalna dla loci Ig i TCR, a kompleks RAG może ciąć w miejscach, które różnią się znacznie od konsensusu 16 bp . Minimalnym motywem do nacinania szmat jest tylko CAC. Tak więc kompleks RAG może działać w lokalizacjach RSS-podobnych do receptorów antygenowych, określanych jako cryptic RSS (cRSS). Występuje to w wielu rearanżacjach obserwowanych w ostrym chłoniaku limfoblastycznym z ludzkich komórek T. W tych przypadkach, zamiast kompleksu RAG parowanie 12-RSS z 23-RSS, 12-RSS pary z 23-RSS lub 23-RSS pary z 12-RSS. Te przerwy nazywamy przerwami typu V(D)J, ponieważ występują one w tym samym mechanizmie, co normalna rekombinacja V (D) J, niezależnie od faktu, że jedno z miejsc znajduje się poza zwykłym loci receptora antygenowego (to znaczy jest poza celem).

działanie RAG w strukturach bąbelkowych DNA i innych regionach heterologii w sposób specyficzny dla struktury

oprócz specyficznego dla sekwencji sposobu cięcia, kompleks RAG może również nikować w sposób specyficzny dla struktury w miejscach przejścia z dsDNA do ssDNA, na przykład na krawędziach struktur bąbelkowego DNA lub nawet niedopasowania pojedynczej bazy . Taka aktywność kompleksu RAG mogła powstać, ponieważ kompleks RAG jest przyzwyczajony do tworzenia struktur spinki do włosów, co wiąże się z znacznym zniekształceniem DNA. Stąd Każdy region niedopasowania lub poślizgu jest potencjalnym celem nacinania przez kompleks RAG w komórkach limfatycznych.

transpozycja za pośrednictwem RAG jako mechanizm rearanżacji chromosomów

w latach 1998-2007 kilka laboratoriów zaproponowało, aby kompleks RAG mógł wstawić tępe końce zawierające RSS z rekombinacji V(D)J, zwane końcami sygnału, do nowych lokalizacji w genomie. Nazywa się to transpozycją RAG i występuje na niskim poziomie przy użyciu ściętej formy białek RAG zwanej rdzeniowymi szmatami (recenzja w ). Jednak próby znalezienia przypadków transpozycji RAG in vivo wykazały, że były one znacznie mniej powszechne niż przypadkowa integracja DNA . Wreszcie, nie ma przykładów ludzkich nowotworów limfatycznych (lub jakiegokolwiek innego rodzaju nowotworu), w których genom został zmieniony przez TRANSPOZYCYJNE wstawienie końców sygnału RAG (lub jakikolwiek inny widoczny wariant takiej transpozycji).

akcja pomocy w lokalizacjach poza celem

jak wspomniano w powyższej dyskusji na temat rekombinacji przełączników klas, pomoc może konwertować C na U lub metyl C lub T w dowolnym regionie ssDNA. Wydaje się, że występuje to nie tylko w sekwencjach przełączników i domenach zmiennych loci Ig, ale także w niektórych lokalizacjach patologicznych, takich jak niektóre onkogeny, takie jak c-myc . Regiony te, jeśli są ukierunkowane na pomoc, mogą doświadczać mutacji punktowych lub DSBs . Działania pomocowe w regionie przełączania IgH podczas CSR i niezależne działania pomocowe w genie C-myc w celu utworzenia DSB są uważane za podstawę dwóch inicjujących Dsb zarówno w mysich, jak i ludzkich translokacjach c-myc . Można uznać przerwy tego typu za przerwy typu CSR (jak wspomniano powyżej w dyskusji o rekombinacji przełączników klas) lub przerwy typu SHM, gdzie SHM odnosi się do zdarzeń inicjowanych przez pomoc podobnych do tego, co zwykle występuje w hipermutacji somatycznej.

przypuszczalne połączone działanie pomocy i szmat w miejscach CpG: przerwy typu CpG

niedawno informowaliśmy, że DSBs w niektórych loci w translokacjach pro-B/pre-B – T(14;18), bcl-1 z T(11;14) i E2A z T(1;19)-mają silną skłonność do występowania w sekwencji dinukleotydowej CPG.

translokacja bcl-2 jest najczęstszą translokacją w raku, występującą w > 90% chłoniaków pęcherzykowych i jednej trzeciej rozproszonych chłoniaków wielkokomórkowych. Pięćdziesiąt procent przerw w genie bcl-2 występuje w głównym regionie punktu przerwania (MBR), który jest 175 bp hotspot w najbardziej eksonie 3′ w regionie kodującym 3 ’ UTR. Dwa rzadziej używane hotspoty znajdują się 18 i 29 kb dalej do genu bcl-2, odpowiednio 105 bp Bcl-2 intermediate cluster region (icr) i 561 bp Bcl-2 minor cluster region (mcr). Każde z miejsc CpG w obrębie jednej z tych trzech stref translokacji bcl-2 może być celem dla DSB . Trzynaście procent przerw translokacji bcl-2 znajduje się w icr, a 5% w mcr.

zastosowanie CpGs dotyczy również głównego klastra translokacji bcl-1, który jest lokalizacją zaangażowaną w translokację t(11;14). Translokacja bcl-1 występuje w prawie wszystkich chłoniakach z komórek płaszcza, z 30% przerwami występującymi w głównym klastrze translokacji 150 bp BCL-1 (MTC).

przerwy typu CpG występują również w trzecim nowotworze limfatycznym, T (1;19) w niewielkim odsetku Allów pre-B, translokacja, która zachodzi między genem Pbx1 a genem E2A. Przerwy w genie E2A występują w strefie tylko 23 bp, a te Dsb są również znacząco zgrupowane wokół miejsc CpG . Wszystkie trzy translokacje obejmujące bcl-2, bcl-1 i E2A występują na etapie Pro-B/pre-B rozwoju komórek B.

Bcl-2 MBR jest reaktywny za pomocą sondy chemicznej do jednorodności zwanej bisiarfitem . Podobnie jak Bcl-2 MBR, ten BCL-1 MTC jest stosunkowo mały (150 bp) i ma podobną reaktywność do wodorosiarczynu . Te wysoce wodorosiarczynowe strefy reaktywne są bogate w przebieg Cs. Opierając się na dichroizmie kołowym, krystalografii rentgenowskiej, NMR i sondowaniu chemicznym, takie przebiegi Cs mają tendencję do przyjmowania struktury DNA pośredniej między B-form DNA a a-form DNA, określanej jako B/A-intermediate . Struktura B / A-intermediate ma szybszą kinetykę otwarcia, być może biorąc pod uwagę część obserwowanego wzrostu reaktywności bisiarczynów. Takie niezwykłe regiony DNA mogą być bardziej podatne na poślizgi, być może wywołane przez replikację lub transkrypcję DNA. Może to następnie tłumaczyć ich podatność w testach rekombinacji minichromosomalnej .

Cs CPG wewnątrz lub bezpośrednio przylegających do tych b/a-strefy pośrednie są narażone na zwiększone ryzyko deaminacji . Ta deaminacja Nie dotyczy wszystkich Cs w regionie, ale tylko Cs, które znajdują się w witrynach CpG. Jedyną charakterystyczną cechą takich Cs w CpGs jest to, że mogą być metylowane przez metylotransferazę DNA. Kiedy zwykłe Cs deaminate, stają się U, powodując u: g niedopasowanie. Ale kiedy metyl Deaminate Cs, stają się T, powodując niedopasowanie T: G. Naprawa niedopasowania U: G jest bardzo wydajna, ale naprawa niedopasowania T:G nie jest wydajna. Naprawa niedopasowania T: G jest tak nieefektywna, że odpowiada za około połowę mutacji punktowych w genie p53 w szerokim zakresie ludzkich nowotworów. Te strony niedopasowania T: G są zawsze na stronach CpG.

co powoduje przerwę w tych stronach T: G niedopasowania? Co ciekawe, ta deaminacja w tych limfatycznych punktach translokacji wydaje się występować na etapie pre-B różnicowania. Jest to etap rozwoju komórek B, kiedy rekombinacja D do J zachodzi najbardziej energicznie. Ponieważ translokacje bcl-2 i BCL-1 występują na tym etapie, wydaje się, że jest to etap translokacji. Wykazaliśmy, że kompleks RAG może powodować DSB w miejscach małych struktur bąbelkowych, a nawet niedopasowania pojedynczej pary zasad. (Jak wspomniano powyżej, to działanie kompleksu RAG odzwierciedla jego specyficzną dla struktury aktywność nukleazy, być może cechę, która odzwierciedla specyficzne dla struktury działania kompleksu RAG podczas etapu tworzenia spinki do włosów rekombinacji V (D)J.) W związku z tym zaproponowaliśmy, aby kompleks RAG tworzył DSBs w miejscach niedopasowania T:G.

jeśli kompleks RAG powoduje dsbs w miejscach CpG, to dlaczego takie przerwy typu CpG nie występują w komórkach pre-T, które również wyrażają kompleks enzymatyczny RAG? Linia limfocytów B wykazuje ekspresję deaminazy cytydynowej do rekombinacji przełącznika klasy i hipermutacji somatycznej. Jak wspomniano powyżej, enzym ten nazywa się deaminazą indukowaną aktywacją (AID). Pomoc wyraża się w komórkach B, ale nie w innych komórkach somatycznych. Pomoc jest najbardziej silnie wyrażona w komórkach B, gdy znajdują się w centrach germinalnych. Jednak niski poziom ekspresji pomocy został opisany w komórkach pre-B. Co więcej, uważa się, że komórki B po prostu opuszczające szpik kostny, zwane przejściowymi komórkami B, również wyrażają pomoc . Dlatego istnieje okres czasu, kiedy komórki B kończą rekombinację V (D)J i zaczynają wyrażać pomoc, gdy zarówno pomoc, jak i Kompleks RAG są obecne w komórkach B. Wykazano, że AID jest zdolny do deaminacji metylu C do T. Dlatego proponujemy, że AID jest prawdopodobnie odpowiedzialny za mutację meC do T w miejscach CpG we wczesnych komórkach B. Powstałe niedopasowanie T: G jest następnie cięte przez kompleks SZMACIANY, w wyniku czego powstaje DSB. Model ten wyjaśnia trzy piki translokacji zlokalizowane w obrębie MBR bcl – 2, z których wszystkie są wyśrodkowane w miejscach CpG .

inne przyczyny patologicznych DSBs o nieznanym mechanizmie

niektóre translokacje są silnie związane z leczeniem inhibitorem topoiziomerazy typu II . Po takiej terapii u niektórych pacjentów rozwijają się wtórne nowotwory złośliwe z tymi charakterystycznymi translokacjami. Topoizomerazy na ogół dokonują przerw jedno – lub dwuniciowych w celu zwinięcia lub rozwinięcia DNA, w związku z czym mają aktywność nukleazy jako część ich funkcji. Po nawinięciu lub rozwinięciu DNA Zwykle zamykają pęknięcia. Zaproponowano, że przerwanie lub zapobieganie ponownemu zamykaniu może skutkować stabilnymi przerwami obserwowanymi w rearanżacjach chromosomalnych .

niektóre Dsb powstają w miejscach w pobliżu bezpośrednich lub odwróconych powtórzeń DNA. Takie powtórzenia mogą prowadzić do poślizgu struktur DNA zawierających regiony jednoniciowego DNA, które mogą być celem rozszczepiania. Najlepszym tego przykładem jest translokacja konstytucyjna t(11;22)(q23;q11), która zawiera bogaty w AT palindrom kilkuset baz, z możliwością formowania krzyżowców.

połączenie wielu mechanizmów DSB w ramach rearanżacji

biorąc pod uwagę, że dwa Dsb są wymagane do wygenerowania translokacji, te dwa przerwy często nie są ze sobą powiązane. Na przykład w translokacjach bcl-2 i bcl-1 przerwa w locus IgH jest przerwą typu V(D)J, generowaną przez specyficzne dla sekwencji działanie kompleksu RAG podczas rekombinacji V(D)J. (Można to uznać za niepowodzenie w zakończeniu normalnego procesu rekombinacji V (D)J.) DSB w locus bcl-2 lub BCL-1 jest przerwą typu CpG, która została zaproponowana ze względu na sekwencyjne działanie pomocy i specyficzną dla struktury aktywność niszczenia kompleksu RAG .

nawet w obrębie danego locus może istnieć szeroki zakres mechanizmów DSB. Loci SCL i LMO2 utrzymują głównie Dsb typu V(D)J, ale jedna trzecia lub więcej DSB są niezgodne z wymaganiami sekwencji dla DSB typu V(D)J i mogą być one spowodowane uszkodzeniem wolnych rodników, promieniowaniem jonizującym lub uszkodzeniem topoizomerazy. Różne loci w obrębie pojedynczej komórki są zatem podatne na różne typy mechanizmów DSB.

dsbs indukowane replikacją

podczas replikacji DNA, delecje mogą powstać z powodu poślizgu nici syntetyzującej na nici szablonu. Rearanżacje chromosomalne, które występują w określonych punktach gorących, czy to w raku w komórkach somatycznych, czy podczas gametogenezy / początkowych podziałów rozwojowych jako translokacje konstytucyjne, nazywane są translokacjami nawracającymi, które można zaobserwować u wielu pacjentów. Nieciągłe translokacje to te, które występują w różnych miejscach od jednego pacjenta do drugiego, ale zmieniają lub inaktywują gen, który powoduje chorobę. W przeciwieństwie do powtarzających się translokacji, które omówiliśmy w raku powyżej, mechanizmy, które powodują wymianę nici w translokacjach nieuregulowanych, wydają się obejmować przełączanie szablonów podczas replikacyjnej syntezy DNA. Te przełączniki szablonowe mogą występować w małych regionach homologii sekwencji DNA, takich jak 5 bp. To przełączanie szablonów zostało nazwane microhomology-mediated breakage-induced replication (MMBIR) lub Fork Staaling and Template Switching (FoSTeS). W przypadku nieuregulowanych połączeń translokacyjnych, które obejmują kilka długich odcinków sekwencji z regionów genomu, które są normalnie oddzielone od siebie, jako mechanizm zaproponowano wiele zdarzeń przełączania szablonów .