Krążące DNA guza

rozważania przedanalityczneedit

gdy krew jest pobierana do rurek EDTA i przechowywana, białe krwinki zaczynają lizować i uwalniać genomowy DNA typu dzikiego do próbki w ilościach typowo wielokrotnie większych niż ctdna jest obecny. Utrudnia to wykrywanie mutacji lub innych biomarkerów ctDNA. Zastosowanie dostępnych w handlu probówek do stabilizacji komórek może zapobiec lub opóźnić lizę białych krwinek, zmniejszając tym samym efekt rozcieńczania ctDNA. Sherwood et al wykazały lepsze wykrywanie mutacji KRAS w dopasowanych próbkach zebranych w obu EDTA K3 i Streck BCT tubes. Zalety rurek stabilizujących komórki można wykorzystać w sytuacji, gdy krew nie może zostać natychmiast przetworzona do osocza.

inne procedury mogą również zmniejszyć ilość” zanieczyszczającego ” dzikiego typu DNA i uczynić wykrywanie ctDNA bardziej wykonalnym:

• nigdy nie zamrozić próbki krwi przed ekstrakcją osocza do analizy ctDNA
• przetworzyć próbkę do osocza w ciągu 2-4 godzin (jeśli została zebrana w probówce EDTA)
• nigdy nie używać probówek heparynizowanych, heparyna hamuje PCR, naśladując strukturę spiralną DNA
• wykonać podwójny etap wirowania (odwirować krew w celu usunięcia osocza, a następnie powtórz na plazmie, aby usunąć zanieczyszczenia z dna probówki), aby usunąć więcej zanieczyszczeń komórkowych przed ekstrakcją DNA.
• osocze jest lepsze niż surowica do odzyskiwania ctDNA

ekstrakcja ctDNAEdit

główną atrakcją analizy ctdna jest to, że jest ona ekstrahowana w sposób nieinwazyjny poprzez pobranie krwi. Nabycie cfDNA lub ctDNA zazwyczaj wymaga pobrania około 3 ml krwi do rurek powlekanych EDTA. Stosowanie EDTA jest ważne w celu zmniejszenia krzepnięcia krwi. Frakcje krwi w osoczu i surowicy mogą być oddzielone poprzez etap wirowania. ctDNA lub cfDNA można następnie wyodrębnić z tych frakcji. Chociaż stężenie cfDNA w surowicy zwykle jest wyższe, przypisuje się to przede wszystkim DNA z limfocytów. Wysoki poziom zanieczyszczającego cfDNA jest nieoptymalny, ponieważ może to zmniejszyć czułość wykrywania ctDNA. Dlatego w większości badań stosuje się osocze do izolacji ctDNA. Osocze jest następnie ponownie przetwarzane przez odwirowanie w celu usunięcia pozostałości nienaruszonych komórek krwi. Supernatant jest używany do ekstrakcji DNA, którą można przeprowadzić przy użyciu dostępnych na rynku zestawów.

Analiza ctDNAEdit

analiza ctdna po ekstrakcji wymaga zastosowania różnych metod amplifikacji i sekwencjonowania. Metody te można podzielić na dwie główne grupy w zależności od tego, czy celem jest przesłuchiwanie wszystkich genów w podejściu nie targetowanym, czy też celem jest monitorowanie określonych genów i mutacji w podejściu ukierunkowanym.

podejście bez Ukierunkowaniaedytuj

sekwencjonowanie całego genomu lub całego egzomu może być konieczne do odkrycia nowych mutacji w DNA guza podczas monitorowania obciążenia chorobą lub śledzenia oporności na leki. Podejście Untargeted są również przydatne w badaniach obserwować heterogeniczność nowotworu lub odkryć nowe cele leków. Jednakże, podczas gdy w niektórych aplikacjach może być konieczne stosowanie metod niestandardowych, jest ona droższa i ma niższą rozdzielczość. Utrudnia to wykrywanie rzadkich mutacji lub w sytuacjach, w których występuje niski poziom ctDNA (np. minimalna choroba resztkowa). Ponadto, tam mogą być problemy odróżniający DNA od nowotworowych komórek i DNA od normalnych komórek używać cały genom podejście.

sekwencjonowanie całego genomu lub egzomu zazwyczaj wykorzystuje technologie sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości. Ograniczenie sekwencjonowania tylko do całego egzomu zamiast tego może zmniejszyć koszty i zwiększyć szybkość, ale kosztem utraty informacji o mutacjach w niekodujących regionach regulacyjnych DNA. Chociaż po prostu patrząc na polimorfizmy DNA poprzez sekwencjonowanie nie odróżnia DNA od guza lub normalnych komórek, problem ten może być rozwiązany przez porównanie z próbką kontrolną normalnego DNA (na przykład, DNA uzyskane przez wymaz z policzka.) Co ważne, sekwencjonowanie całego genomu i całego egzomu jest przydatne do początkowego odkrycia mutacji. Dostarcza To informacji w celu wykorzystania bardziej wrażliwych ukierunkowanych technik, które mogą być następnie wykorzystywane do celów monitorowania chorób.

sekwencjonowanie całego genomu umożliwia odzyskanie właściwości strukturalnych cfDNA, wielkości fragmentów i ich wzorców fragmentacji. Te unikalne wzory mogą być ważnym źródłem informacji w celu poprawy wykrywania ctDNA lub lokalizacji tkanki pochodzenia tych fragmentów. Rozmiar-selekcja krótkich fragmentów (<150bp) metodami in vitro lub in silico może poprawić odzyskiwanie mutacji i aberracji liczby kopii.

Cyfrowe Kariotypowanieedit

metoda ta została pierwotnie opracowana przez laboratorium Berta Vogelsteina, Luisa Diaza i Victora Velculescu na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa. W przeciwieństwie do normalnego kariotypowania, gdzie barwnik jest używany do barwienia pasm chromosomowych w celu wizualizacji chromosomów, kariotypowanie cyfrowe wykorzystuje sekwencje DNA loci w całym genomie w celu obliczenia zmienności liczby kopii. Zmiany liczby kopii są powszechne w nowotworach i opisują sytuacje, w których utrata heterozygotyczności genu może prowadzić do zmniejszenia funkcji z powodu niższej ekspresji lub duplikacji genu, co prowadzi do nadekspresji.

Personalized analysis of rearranged ends (PARE)Edit

po zsekwencjonowaniu całego genomu przy użyciu metody sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takiej jak Illumina HiSeq, PARE jest stosowany do danych w celu analizy rearanżacji chromosomów i translokacji. Technika ta została pierwotnie zaprojektowana do analizy DNA guza litego, ale została zmodyfikowana do zastosowań ctDNA.

metylacja i Hydroksymetylacjaedytuj

prawidłowe oznaczenie epigenetyczne jest niezbędne dla prawidłowej ekspresji genów i funkcji komórek, a nieprawidłowe zmiany wzorców epigenetycznych są cechą charakterystyczną raka. Normalny stan epigenetyczny jest utrzymywany w komórce przynajmniej częściowo poprzez metylację DNA. Pomiar nieprawidłowych wzorców metylacji w ctDNA jest możliwy dzięki stabilnej metylacji regionów DNA zwanych „wyspami CpG”. Metylację ctDNA można wykryć poprzez leczenie wodorosiarczynem. Obróbka bisiarczynem chemicznie przekształca niemetylowane cytozyny w uracyl, pozostawiając metylowane cytozyny niezmodyfikowane. DNA jest następnie sekwencjonowane, i wszelkie zmiany do wzoru metylacji DNA mogą być zidentyfikowane. Hydroksymetylacja DNA jest podobnie powiązanym znakiem, który okazał się markerem prognostycznym zdrowych i chorych stanów w cfDNA, w tym raka. Pomiar nieprawidłowych wzorców hydroksymetylacji w ctDNA został udowodniony przez naukowców z University of Chicago (Chuan He lab,) Stanford University (Quake lab,) i firmy Cambridge Epigenetix.

ukierunkowane podejścieedytuj

w ukierunkowanym podejściu sekwencjonowanie ctDNA może być skierowane w stronę panelu genetycznego zbudowanego w oparciu o mutacyjne hotspoty dla nowotworu będącego przedmiotem zainteresowania. Jest to szczególnie ważne w przypadku informowania o leczeniu w sytuacjach, w których mutacje są identyfikowane w celach narkotycznych. Personalizacja ukierunkowanej analizy ctDNA dla każdego pacjenta jest również możliwa poprzez połączenie biopsji płynnych ze standardowymi biopsjami tkanek pierwotnych. Sekwencjonowanie całego genomu lub całego eksomu biopsji guza pierwotnego pozwala na odkrycie mutacji genetycznych specyficznych dla guza pacjenta i może być wykorzystane do późniejszego ukierunkowanego sekwencjonowania ctdna pacjenta. Najwyższą czułość wykrywania ctDNA uzyskuje się poprzez ukierunkowane sekwencjonowanie specyficznych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNPs). Powszechnie zmutowane geny, takie jak onkogeny, które zazwyczaj mają mutacje hotspot, są dobrymi kandydatami do ukierunkowanych metod sekwencjonowania. Odwrotnie, większość genów supresorowych nowotworów ma szeroki wachlarz możliwych mutacji funkcji w całym Genie i jako takie nie nadają się do ukierunkowanego sekwencjonowania.

ukierunkowane podejścia mają tę zaletę, że wzmacniają ctDNA poprzez reakcje łańcuchowe polimerazy (PCR) lub cyfrowe PCR. Jest to szczególnie ważne podczas analizy ctDNA nie tylko dlatego, że istnieją stosunkowo niskie poziomy DNA krążącego we krwi, ale także dlatego, że ctDNA stanowi niewielką część całkowitego wyodrębnionego DNA wolnego od komórek. Dlatego amplifikacja obszarów zainteresowania może drastycznie poprawić czułość wykrywania ctDNA. Jednakże, amplifikacja przez PCR może wprowadzać błędy biorąc pod uwagę nieodłączny poziom błędu polimeraz DNA. Błędy wprowadzone podczas sekwencjonowania mogą również zmniejszać czułość wykrywania mutacji ctDNA.

Droplet Digital PCR (Ddpcr)Edit

ta metoda pochodzi z cyfrowego PCR, pierwotnie nazwanego przez grupę Berta Vogelsteina na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa. Droplet Digital PCR wykorzystuje generator kropli do podziału pojedynczych kawałków DNA na krople za pomocą emulsji olej / woda. Następnie poszczególne reakcje łańcuchowe polimerazy zachodzą w każdej kropli przy użyciu wybranych starterów przeciwko regionom ctDNA i przechodzą do punktu końcowego. Obecność interesujących sekwencji mierzy się za pomocą sond fluorescencyjnych, które wiążą się z amplifikowanym regionem. ddPCR pozwala na wysoce ilościową ocenę alleli i częstotliwości mutacji w ctDNA, ale jest ograniczony przez liczbę sond fluorescencyjnych, które można wykorzystać w jednym teście (do 5). Czułość testu może się różnić w zależności od ilości analizowanego DNA i wynosi około 1 na 10 000.

Koraliki, Emulsyfikacja, Amplifikacja i Magnetics (BEAMing)Edytuj

ta technika opiera się na kroplowej cyfrowej PCR w celu identyfikacji mutacji w ctDNA za pomocą cytometrii przepływowej. Po wyekstrahowaniu ctDNA z krwi, PCR przeprowadza się za pomocą starterów zaprojektowanych w celu dotarcia do obszarów zainteresowania. Startery te zawierają również określone sekwencje DNA lub znaczniki. Amplified DNA miesza się z paciorkami magnetycznymi powlekanymi streptawidyną i emulguje w kropelki. Biotynylowane startery zaprojektowane do wiązania się z tagami są używane do wzmacniania DNA. Biotynylacja pozwala amplifikowanemu DNA związać się z kulkami magnetycznymi, które są pokryte streptawidyną. Po zakończeniu PCR kulki związane z DNA są oddzielane za pomocą magnesu. DNA na koralikach następnie denaturuje i pozwala hybrydyzować z fluorescencyjnymi oligonukleotydami specyficznymi dla każdego szablonu DNA. Powstałe kompleksy koralik-DNA są następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta jest w stanie uchwycić allele i częstotliwości mutacji dzięki sprzężeniu z ddPCR. Jednakże, w przeciwieństwie do ddpcr, większa liczba sekwencji DNA może być przesłuchiwana ze względu na elastyczność stosowania fluorescencyjnie związanych sond. Inną zaletą tego systemu jest to, że dna wyizolowane mogą być również wykorzystywane do sekwencjonowania. Czułość wynosi 1,6 na 104 do 4,3 na 105.

CAncer Personalized Profiling by deep Sequencing (CAPP-Seq)Edit

ta metoda została pierwotnie opisana przez grupy Ash Alizadeh i Maximilian Diehn na Uniwersytecie Stanforda. Technika ta wykorzystuje biotynylowane sondy selekcyjne oligonukleotydów do celowania w sekwencje DNA istotne dla detekcji ctDNA. Publicznie dostępne bazy danych raka zostały wykorzystane do skonstruowania biblioteki sond przeciwko nawracającym mutacjom w raku poprzez obliczenie ich wskaźnika nawrotów. Protokół został zoptymalizowany pod kątem niskich poziomów DNA obserwowanych w kolekcji ctDNA. Następnie izolowane DNA poddawane jest głębokiemu sekwencjonowaniu w celu zwiększenia czułości. Technika ta pozwala na przesłuchanie setek regionów DNA. Czułość wykrywania CTDNA CAPP-Seq wynosi 2,5 cząsteczki na 1 000 000.

Tagged AMplicon deep Sequencing (tam-Seq)Edit

TAM-Seq umożliwia ukierunkowane sekwencjonowanie całych genów w celu wykrycia mutacji w ctDNA. Najpierw ogólny etap amplifikacji jest wykonywany przy użyciu starterów, które obejmują cały interesujący gen w sekcjach 150-200bp. Następnie stosuje się układ mikroprzepływowy do dołączania adapterów z unikalnym identyfikatorem do każdego amplikonu w celu dalszego wzmacniania DNA w równoległych reakcjach singleplex. Wykazano, że technika ta skutecznie identyfikuje mutacje rozproszone w genie supresorowym guza TP53 u pacjentów z zaawansowanym rakiem jajnika. Czułość tej techniki wynosi 1 do 50.

bezpieczne sekwencjonowanie (Safe-Seq)Edycja

metoda ta została pierwotnie opisana przez Berta Vogelsteina i jego grupę z Johns Hopkins University. Safe-Seq zmniejsza współczynnik błędu masowo równoległego sekwencjonowania w celu zwiększenia wrażliwości na rzadkie mutanty. Osiąga to poprzez dodanie sekwencji unikalnego identyfikatora (UID) do każdego szablonu DNA. DNA jest następnie wzmacniane za pomocą dodanych UID i sekwencjonowane. Wszystkie cząsteczki DNA o tym samym UID (rodzina UID) powinny mieć tę samą sekwencję DNA, ponieważ zostały one amplifikowane z jednej cząsteczki. Jednakże mutacje mogą być wprowadzone przez amplifikację, lub nieprawidłowe przydziały bazy mogą być wywoływane w etapach sekwencjonowania i analizy. Obecność UID pozwala na oddzielenie tych błędów metodologicznych od prawdziwych mutacji ctDNA. Mutacja jest uważana za „supermutant”, jeśli 95% sekwencjonowanych czytań jest zgodnych. Czułość tego podejścia wynosi 9 na 1 milion.

duplex sequencingEdit

ta metoda jest ulepszeniem pojedynczych UID dodanych w technice Safe-Seq. W sekwencjonowaniu dupleksowym, randomizowane dwuniciowe DNA działają jak unikalne znaczniki i są dołączone do niezmiennego elementu dystansowego. Znaczniki są dołączone do obu końców fragmentu DNA (znaczniki α i β), co skutkuje dwoma unikalnymi szablonami dla PCR – jedna nić z znacznikiem α na końcu 5′ i znacznikiem β na końcu 3 'oraz druga nić z znacznikiem β na końcu 5′ i znacznikiem α na końcu 3′. Te fragmenty DNA są następnie amplifikowane starterami przeciwko niezmiennym sekwencjom znaczników. Amplifikowane DNA jest sekwencjonowane i analizowane. DNA z Adaptorami dupleksu są porównywane i mutacje są akceptowane tylko wtedy, gdy istnieje konsensus między obydwoma nićmi. Metoda ta uwzględnia zarówno błędy z sekwencjonowania, jak i błędy z wczesnego etapu amplifikacji PCR. Czułość podejścia do odkrywania mutantów wynosi 1 do 10^7.

Integrated Digital Error supression (iDES)-enhanced CAPP-SeqEdit

iDES poprawia analizę CAPP-Seq ctDNA w celu zmniejszenia błędu, a tym samym zwiększenia czułości wykrywania. Raportowany w 2016 r., iDES łączy CAPP-Seq z technologią sekwencjonowania kodów kreskowych duplex i algorytmem obliczeniowym, który usuwa stereotypowe błędy związane z etapem hybrydyzacji CAPP-Seq. Metoda integruje również sekwencjonowanie dupleksu, gdzie jest to możliwe, i obejmuje metody bardziej efektywnego odzyskiwania dupleksu z DNA wolnego od komórek. Czułość tej ulepszonej wersji CAPP-Seq wynosi 4 w 100 000 egzemplarzy.