mikroskopia domyślnie jest techniką, która pozwala nam obserwować, a nie mierzyć, zdarzenia biologiczne i wyciągać wnioski na podstawie tego, co widzimy, a nie na podstawie niektórych obliczeń. Temat tego artykułu może zatem wydawać się nieco zaskakujący, ponieważ zajmuje się pomiarami kolokalizacji. Chociaż istnieją sytuacje, w których można określić kolokalizację białka wizualnie, bardziej dokładne potwierdzenie wzajemnego rozkładu dwóch sond często będzie konieczne.
dlaczego wizualne określenie Kolokalizacji jest niewystarczające?
tylko wtedy, gdy zebrano obrazy zgodnie z kontrolowanym protokołem do analizy kolokalizacji (wystarczający sygnał w każdym kanale, brak autofluorescencji lub przepuszczania sygnału), można bezpiecznie powiedzieć, że dwie sondy kolokalizują się wyłącznie na podstawie obserwacji. W tym przypadku, jeśli zielony sygnał kolokalizuje się z Czerwonym sygnałem, a obraz jest w większości żółty, nie jest potrzebny pomiar statystyczny. Ale jeśli nie widzisz nakładania się, nie oznacza to, że go nie ma! Może być tak, że natężenia obu kanałów nie są takie same. Mianowicie, kolor pośredni, który widzimy, może pojawić się tylko wtedy, gdy obie sondy mają tę samą intensywność. Dlatego wnioski oparte na wzrokowym oznaczaniu często mogą prowadzić do fałszywie negatywnych wyników.
jakie istnieją metody pomiaru nakładania się?
chociaż nie ma jednego standardowego podejścia do tej kwestii, istnieją dwie metody, które są szeroko stosowane i ogólnie akceptowane. Obejmują one albo współczynnik korelacji Pearsona (PCC) lub Współczynnik kolokalizacji Mandera (MCC).
te dwie metody odnoszą się do dwóch różnych aspektów kolokalizacji – korelacji i współwystępowania. Współczynnik Pearsona jest związany ze korelacją intensywności pikseli w dwóch kanałach. Mierzy zależność między sygnałami-czy wartości sygnału w jednym kanale rosną jednocześnie z drugim, czy jeden sygnał spada, gdy drugi wzrasta. Korelacja różni się od współwystępowania, które jest matematycznie wyrażone przez współczynnik Mandera. Obrazuje to zasięg jednego sygnału nad drugim, co pokazuje, w jakim stopniu dwie sondy zajmują to samo miejsce. Przyjrzyjmy się temu nieco dalej.
współczynnik korelacji Pearsona (PCC)
definicja: PCC odzwierciedla liniową zależność między intensywnościami sygnału. Wartości mogą wahać się między 1 (doskonała korelacja dodatnia) i -1 (doskonała korelacja ujemna), podczas gdy 0 oznacza, że nie ma korelacji. Możliwe jest wizualne eksplorowanie PCC poprzez scattergram, gdzie współrzędne na wykresie reprezentują wartości pikseli (sygnału) w obu kanałach. Im więcej punktów skupionych wokół linii prostej, tym lepsza korelacja między dwoma sygnałami
wymagania: PCC należy mierzyć w regionie zainteresowania (ROI), aby uniknąć fałszywych alarmów lub negatywów. Jeśli mierzysz PCC na całym obrazie, piksele tła będą doskonale korelować i nadmuchać PCC. W przeciwieństwie do tego, Jeśli pomiar jest wykonywany w regionie, który nie jest interesujący, w którym występuje heterogeniczny rozkład obu kanałów, PCC ulegnie depresji.
możesz wybrać zwrot z inwestycji ręcznie lub progowo, aby wykluczyć tło. Niezależnie od tego, jak to zrobisz, bądź ostrożny, zwłaszcza podczas progowania. Wybór zwrotu z inwestycji musi obejmować wszystkie odpowiednie regiony komórki(komórek), tj. każde miejsce, w którym można oczekiwać dystrybucji sondy. Jeśli do wyboru zwrotu z inwestycji (progowania) używa się metody opartej na intensywności, może się zdarzyć, że nieumyślnie wykluczysz odpowiednie wyniki. Jak to możliwe? Można mieć region wzajemnego wykluczenia, w którym nie pojawia się żadna etykieta, a to może być wynik biologicznie istotny (obie cząsteczki nie są wyrażone w tym miejscu w komórce). Jednak próg nie będzie uwzględniał tego regionu w ROI, co naraża Cię na utratę odpowiednich wyników.
zalecane do: PCC należy stosować na obrazach, jeśli istnieje liniowa zależność między intensywnościami. Jeśli dane pasują do bardziej złożonego modelu, PCC nie będzie działać dobrze. Inną metodę należy również wybrać, jeśli zachodzi nierównomierne nakładanie się sond, gdzie sondy współdzielą, ale w różnych proporcjach. Może to nastąpić, gdy GFP jest używany jako jedna sonda. Jego poziom ekspresji może różnić się między komórkami i potencjalnie powodować depresję PCC z powodu wysokiej zmienności między komórkami.
współczynniki Kolokalizacji Mandera
definicja: MCC jest metryką opisującą współwystępowanie-frakcję jednego białka, która kolokalizuje się z drugim. MCC da Ci dobrą miarę kolokalizacji, gdy oznaczysz jedno białko w pęcherzyku i chcesz zobaczyć, jak kolokalizuje się z określoną strukturą w komórce, powiedzmy mikrotubulą. Jeśli założymy, że wszystkie pęcherzyki kolokalizują się z mikrotubulami, ale tylko część mikrotubul kolokalizuje się z pęcherzykiem, możesz obliczyć MCC dla każdego kanału i uzyskać metrykę, która ilościowo opisuje to ułamkowe nakładanie się.
wymagania: połów z MCC polega na tym, że wymaga eliminacji tła. Najtrudniejszą częścią jest ustawienie punktu odcięcia dla intensywności, który umożliwi odejmowanie tła. MCC mierzy całkowitą fluorescencję jednej sondy w każdym pikselu powyżej zera. Jednak piksele powyżej zera są niezwykle rzadkie, ze względu na takie czynniki, jak: autofluorescencja, wyciek światła, niespecyficzne etykietowanie lub fluorescencja z nieostrych równin obrazu. Pomiar MCC wymaga zatem starannego doboru progu (odcięcia).
pierwszym sposobem na to jest globalne progowanie, gdzie od każdego piksela odejmuje się wartość progową, tak aby każdy poziom poniżej wybranego odcięcia był tłem, a każdy piksel powyżej przypadał na interesujący region. Chociaż jest to bardzo intuicyjne, globalne progowanie jest raczej prymitywne i może prowadzić do niepożądanych sytuacji, takich jak wykluczenie pikseli o niskiej wartości, które są blisko tła, ale w rzeczywistości są pozytywne.
bardziej automatyczną i mniej subiektywną opcją jest metoda Costes, gdzie próg jest szacowany przez wielokrotne obliczanie PCC. Służy to do określenia zakresu wartości pikseli, które są dodatnie i dlatego nie powinny być wykluczane. PCC oblicza się dla różnych grup pikseli, a wartości pikseli, dla których PCC jest równe lub bliskie zeru, przyjmuje się jako wartości progowe. Niemniej jednak należy go również sprawdzić wizualnie, ponieważ na obrazach o niższym stosunku sygnału do szumu może zidentyfikować bardzo niski poziom progowy, dzięki czemu nie odróżnia oznaczonych struktur od tła.
zalecane dla: gdy biologiczne pytanie twojego eksperymentu dotyczy stopnia, w jakim białko/struktury nakładają się, MCC powinno być miarą wyboru. Współczynniki te są bardziej intuicyjnie interpretowane niż PCC i są niezależne od proporcjonalności sygnału (różnic w liczbie struktur oznaczanych przez każdą sondę).
zanim rozpoczniesz analizę
niezależnie od wyboru pomiaru kolokalizacji, bardzo ważne jest, aby kolekcja obrazów była wykonana we właściwy sposób. Spróbuj kontrolować jak najwięcej czynników i przygotuj zestaw próbek kontrolnych, które pozwolą Ci monitorować jak najwięcej zmiennych.
należy pamiętać, że na określenie wizualnej kolokalizacji wpływa wiele czynników, w tym subiektywność obserwatora, fakt, że każdy mózg może widzieć kolory inaczej, możliwa ślepota barw obserwatora i rozdzielczość przestrzenna, która określa rozmiar piksela, między innymi. Pamiętaj, aby przetwarzać obrazy, które zamierzasz analizować w jednolity sposób i pamiętaj, że każda niekontrolowana manipulacja może spowodować utratę istotnych informacji.
i wreszcie
te obliczenia są implementowane w większości pakietów oprogramowania do analizy obrazu, np. Ale biorąc pod uwagę, że pomiar kolokalizacji jest nadal nieco mylącym polem, wymagane są ulepszenia, więc śledź nowe wersje i pakiety oprogramowania.
jak mierzyć kolokalizację? Daj nam znać pisząc w komentarzach!
Literatura:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. Praktyczny przewodnik do oceny kolokalizacji w mikroskopii biologicznej. American Journal of Physiology-Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Colocalization Analysis in Fluorescence Microscopy. W: Taatjes, Douglas J., Roth, Jürgen (ed.), Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, New York: Humana Press, 2012, s. 97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Testy statystyczne do pomiaru kolokalizacji w mikroskopii biologicznej. Journal of microscopy. 2013; 252(3): 295-302
pomogło ci to? Następnie podziel się z siecią.