klonalna hematopoeza u pacjentów z przeciwciałem cytoplazmatycznym związanym z przeciwciałami przeciw neutrofilom

Posted on by admin

Klonalna hematopoeza o nieokreślonym potencjale (CHIP)-zdefiniowana przez obecność somatycznej mutacji genowej związanej z rakiem hematologicznym z wariantowym allelem częstość ≥2%-występuje we krwi obwodowej co najmniej 10% osób w wieku powyżej 60 lat bez choroby hematologicznej w wywiadzie.Mutacje dotyczą głównie epigenetycznych regulatorów transkrypcji DNMT3A, TET2 i ASXL1, co prowadzi do przewagi konkurencyjnej zmutowanych hematopoetycznych komórek macierzystych z późniejszym odchyleniem różnicowania w kierunku przedziału mieloidalnego.Częstość występowania CHIP zwiększa się wraz z wiekiem i wiąże się z większym ryzykiem rozwoju nowotworów hematologicznych i chorób układu krążenia, co prowadzi do zwiększonej śmiertelności ogólnej.5

wykorzystując mysi model z makrofagami z niedoborem Tet2, wykazano, że miażdżyca i choroba niedokrwienna serca są napędzane przez CHIP poprzez zmienioną funkcję zapalną, co prowadzi do zwiększenia poziomu cytokin prozapalnych.6 nasza grupa niedawno wykryła korelację między mutacjami DNMT3A a przewlekłą chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi, dostarczając dalszych dowodów na ważną rolę CHIP w przewlekłych reakcjach zapalnych.7 jednak niewiele wiadomo o roli Chipa w chorobach autoimmunologicznych. Badanie z udziałem 56 pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów nie wykazało korelacji CHIP z aktywnością choroby.Przeciwciała przeciw neutrofilom cytoplazmatycznym (Anca)-associated autoimmune vasculitides (AAV) obejmują wiele martwiczych naczyń, w tym ziarniniakowatość z zapaleniem naczyń i mikroskopowym zapaleniem naczyń, i charakteryzują się ciężkim zapaleniem małych naczyń, potencjalnie wpływającym na każdy układ narządów. ANCA są skierowane przeciwko autoantygenom mieloperoksydazy (MPO) i proteinazy 3 (PR3). Po związaniu się z antygenami wyrażonymi powierzchniowo przez komórki, Anca IgG wywołuje niekontrolowaną aktywację neutrofili i monocytów, prowadząc do uszkodzenia śródbłonka i niewydolności narządu końcowego. U większości osób, największe obciążenie mutacją CHIP można znaleźć w komórkach mieloidalnych, 4, które są jedynymi autoantygenowo wyrażającymi pierwotną odpowiedź komórkami w AAV. Ponadto TET2 i DNMT3A odgrywają centralną rolę w wyciszaniu genów poprzez regulację metylacji DNA. W rzeczywistości zgłaszano przypadki wadliwego wyciszania genów w komórkach mieloidalnych u pacjentów z AAV. Ten rozregulowany proces obejmował autoantygeny ANCA i korelował z ryzykiem nawrotu choroby.119

podsumowując, Najnowsze dane potwierdzają ideę potencjalnych powiązań, dotyczących patogenezy i wyników klinicznych, między chip a chorobami autoimmunologicznymi/stanami zapalnymi. Dlatego scharakteryzowaliśmy CHIP w dużej kohorcie pacjentów z AAV, badając częstość występowania, dynamiczne zmiany w czasie, manifestacje narządów, wyciszanie antygenu ANCA i aktywację in vitro indukowaną Anca.

pobraliśmy próbki krwi obwodowej od pacjentów z AAV, obserwowanych na oddziałach i oddziałach nefrologii Charité/HELIOS (Berlin, Niemcy, od kwietnia 2005 r.do października 2018 r. Dane demograficzne i kliniczne pacjentów uzyskano z ich dokumentacji medycznej. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę na włączenie do badania, które zostało przeprowadzone zgodnie z deklaracją Helsińską. Aprobata etyczna została uzyskana od lokalnych komisji etyki.

DNA całej krwi przebadano pod kątem CHIP przy użyciu dostosowanej wersji panelu do sekwencjonowania Mieloidalnego Illumina TruSight (internetowa tabela uzupełniająca S1) na sekwencerie NextSeq. Analiza sekwencjonowania została przeprowadzona przy użyciu Centrum sekwencjonowania Platformy Illumina BaseSpace. Uwzględniono tylko warianty niesynonimiczne z częstością alleli ≥2%. Warianty kandydujące zostały zatwierdzone za pomocą ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania (metody uzupełniające Online). Łącznie zidentyfikowano 46 mutacji somatycznych u 34 ze 112 pacjentów z AAV (30,4%) z medianą częstości alleli wariantowych 5.2% (Tabela Uzupełniająca Online S2). Podczas gdy 25 pacjentów miało jedną mutację, ośmiu miało dwie, a jeden pacjent miał pięć. Najczęściej zmutowanymi genami były DNMT3A (19/46=39,1%), TET2 (7/46=15,2%) i ASXL1 (4/46=8,7%) (Fig. Spośród 46 mutacji, 26 to mutacje missense, 18 to mutacje truncating, a dwie to mutacje splice-site. Najczęstszą zmianą zasadniczą w mutacjach missense była C > T (16/30) (rysunek uzupełniający Online S1).

Rysunek 1.Analiza Sekwencyjna. (A) spektrum mutacji genów somatycznych znalezionych w naszej kohorcie 112 pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem naczyń związanym z ANCA (AAV). Geny oznaczone gwiazdką są objęte tylko przez panel Niestandardowy (metody uzupełniające Online). B) występowanie hematopoezy klonalnej o nieokreślonym potencjale (CHIP) w zależności od grup wiekowych. Pacjenci z pojedynczą mutacją są reprezentowani w kolorze jasnoniebieskim, pacjenci z wieloma mutacjami w kolorze ciemnoniebieskim. C) porównanie częstości występowania chipów w kohorcie AAV z częstością w wcześniej opisanych kohortach. Paski błędów przedstawiają przedziały ufności 95%. D) podłużne oznaczanie ilościowe częstotliwości alleli wariantowych (VAF) u wybranych pacjentów. Przedstawiono tylko pacjentów z istotnym zwiększeniem lub zmniejszeniem VAF w czasie. Schematy terapii podane są przedstawione jako kolorowe paski na osi X. Nawrót jest reprezentowany przez Trójkąty. UPN: unikalny numer pacjenta; AZA: azatiopryna; CYC: cyklofosfamid; MTX: metotreksat; MMF: mykofenolan mofetylu; RTX: rytuksymab.

w porównaniu z wcześniej zgłaszanymi częstościami występowania CHIP w niezelekcjonowanych kohortach kontrolnych o podobnym wieku i technologii sekwencjonowania, 15128743 częstość występowania CHIP u pacjentów z AAV była znacząco wyższa (30, 4% vs.13, 5%, P<0, 001) (rysunek 1C, tabela uzupełniająca Online S3). Mając na uwadze różne technologie sekwencjonowania stosowane w tych badaniach, zbadaliśmy kohortę kontrolną dopasowaną do wieku i płci 112 zdrowych osób, wśród których stwierdzono 22 mutacje U 20 osób (zdrowa grupa kontrolna vs.pacjenci z AAV: 17,9% vs. 30,4%, P=0.042) (Tabela Uzupełniająca Online S4, Dane Uzupełniające Online S2-S4). Warto zauważyć, że znaleźliśmy odpowiedni odsetek pacjentów z AAV z CHIP w wieku ≤55 lat (6/33=18,2%) (rysunek 1B). Dostępne były kolejne próbki krwi obwodowej u 19 pacjentów z układem AAV. Mediana okresu obserwacji wynosiła 2, 3 lat (zakres, 0, 3-10, 9 lat). Obciążenie mutacyjne seryjnych próbek od tych 19 pacjentów w dwóch do czterech punktach czasowych zostało określone ilościowo za pomocą głębokiego sekwencjonowania.171674 podczas gdy pięciu pacjentów wykazało istotny wzrost wielkości klonów, dwóch pacjentów miało nieznacznie zmniejszające się klony, a 12 pacjentów nie wykazało zmiany wielkości klonów w czasie (Fig. 1D, Online uzupełniające Fig. S5). Następnie zbadaliśmy jedną próbkę kontrolną od każdego z 20 pacjentów z chipami, pobraną od 2 do 10 lat po pierwszej próbce. Żadna z 20 próbek nie wykazała nowej mutacji.

przeprowadzono eksploracyjne analizy statystyczne w celu zidentyfikowania związków między chipem a parametrami klinicznymi (76 pacjentów z ziarniniakowatością z zapaleniem naczyń i 34 Z mikroskopowym zapaleniem naczyń). Pacjenci z CHIP byli znacząco starsi niż pacjenci z CHIP (mediana odpowiednio 70,5 vs 63,0 lat, P = 0,017). Częstość występowania CHIP nie była większa u pacjentów, którzy otrzymali leczenie immunosupresyjne przed pobraniem próbek (100% steroidów, 90% cyklofosfamidu, 20% rytuksymabu, 16% azatiopryny, 13% metotreksatu). Nie obserwowano różnic w morfologii krwi, rozmieszczeniu krwinek czerwonych, stężeniu kreatyniny, chorobach współistniejących, rozwoju nowotworów złośliwych, aktywności choroby i ryzyku nawrotów AAV w odniesieniu do stanu układu scalonego. Schematy objawów chorobowych były jednak różne: u pacjentów chorych na ziarniniakowatość z zapaleniem naczyń stwierdzono mniej chorób nerek (68,2% vs. 88,5%, P = 0,049) i układu nerwowego (0% vs.19,2%, P=0,028) (tabele uzupełniające Online S5-S8, tabele uzupełniające Online S6-S8).

następnie dążyliśmy do zbadania wyciszania antygenu ANCA i aktywacji in vitro indukowanej ANCA. W tym celu przeprowadzono in vitro testy stymulacji neutrofili z wykorzystaniem utleniania dihydrorhodaminy z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko antygenom ANCA MPO i PR3 w podgrupie pacjentów z AAV i zdrowych kontrolerów (metody uzupełniające Online), u których wynik testu był negatywny na CHIP. U pacjentów z CHIP zaobserwowano zmniejszoną aktywację w porównaniu do pacjentów z CHIP AAV (wskaźnik anty-MPO: stymulacja: 6,29 vs.13,01, P=0,057; wskaźnik anty-PR3: stymulacja 7,72 vs. 13,00, P=0.026) (Fig. Ponadto poziomy mRNA we krwi obwodowej PR3, MPO, CD177, RUNX3 i JMJD3 mierzono za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Pacjenci z chip AAV wykazywali zwiększoną ekspresję MPO i PR3 mRNA w porównaniu do poziomów w zdrowych grupach kontrolnych (MPO: 1,94 vs.0,86, P=0,026; PR3: 2,02 vs. 0,58, p=0,057), różnica ta była mniej widoczna u pacjentów z CHIP. Jednak pacjenci z CHIP AAV wykazywali zmniejszoną ekspresję mRNA RUNX3 w porównaniu do poziomu w zdrowych grupach kontrolnych (0.28 vs.0, 79, P=0, 007) (rycina 2). Ze względu na małą liczbę pacjentów nie byliśmy w stanie dalej dzielić pacjentów z CHIP AAV według częstotliwości genów lub alleli wariantowych i dlatego nie mogliśmy ocenić ich potencjalnego wpływu na nasze Wyniki (Tabela uzupełniająca Online S9). Ponadto istotne różnice w liczbie neutrofilów i limfocytów między pacjentami z AAV i zdrowymi kontrolami mogły wpłynąć na nasze wyniki i ograniczyć zdolność do wyciągania uogólnionych wniosków (tabela uzupełniająca Online S10).

Rysunek 2.Dane funkcjonalne. Poszczególne punkty danych są przedstawione w punktach rozproszonych i podsumowane w polach. (A) Detekcja oksydacyjna neutrofilów metodą DHR; przedstawiony jest wskaźnik stymulacji SI = średnia fluorescencja kanałowa komórek stymulowanych w stosunku do komórek niestymulowanych, (B, C) ekspresja błon neutrofilowych CD177 lub PR3 mierzona na izolowanych neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem przeciwciał anty-NB1 lub anty-PR3, przedstawiony jako wskaźnik ekspresji EI (B) lub procent komórek mPR3 – i CD177-dodatnich (C). EI = (mfistimulated cells – mfiunstimulated cells) /mfiunstimulated cells. (D) mRNA expression measured in PB leukocytes with qPCR. (m)PR3: (membrane-)proteinase 3; MPO: myeloperoxidase; RUNX3: Runt-related transcription factor 3; JMJD3: jumonji domain-containing protein 3; DHR: dihydrorhodamine; NB1: neutrophil-specific antigen; PB: peripheral blood; EI: expression index; SI: stimulation index; MFI: mean fluorescence intensity.

In summary, we detected CHIP in 34 out of 112 patients (30.4%), znacznie większa częstość występowania niż zgłaszana w zdrowych kohortach i w naszej grupie kontrolnej dopasowanej do wieku,ale porównywalna ze zwiększoną częstością zgłaszaną u pacjentów z rakiem, niedokrwistością aplastyczną18 i chorobami układu sercowo-naczyniowego.Chociaż zaproponowano zmianę sygnalizacji zapalnej jako mechanizm leżący u podstaw związku zespołów mielodysplastycznych z chorobami autoimmunologicznymi / stanami zapalnymi,19 podobny mechanizm może wiązać CHIP z takimi stanami, a w szczególności z AAV. Dysregulowana transkrypcja autoantygenów ANCA jest powszechnie obserwowana w AAV i może być zmieniona przez CHIP. Co ciekawe, pacjenci z CHIP, ale nie CHIP AAV wykazywali regulację ekspresji autoantygenowego mRNA, która była wcześniej zgłaszana.119 to dość zaskakujące odkrycie sugeruje, że podwyższona ekspresja antygenu ANCA jest przypuszczalnie zjawiskiem wtórnym w AAV, wywołanym przez sygnalizację zapalną, która jest wadliwa w komórkach chipowych. W związku z tym u pacjentów z chipami obserwowano zmniejszoną aktywację neutrofilów wywołaną ANCA. Co ciekawe, wcześniej wykazaliśmy, że indukowana ANCA produkcja reaktywnych form tlenu odgrywa główną rolę w obniżaniu regulacji aktywacji zapalnej poprzez oksydacyjne hamowanie kaskady zapalnej-kaspazy-1-interleukiny-1β.20 zmniejszona produkcja reaktywnych form tlenu przez neutrofile chipowe, którą odkryliśmy, może zatem przyczynić się do nadmiernej aktywacji zapalenia, a tym samym wpłynąć na patogenezę AAV. Klinicznie stwierdzono mniej objawów nerkowych i neuronalnych u pacjentów z chipem, co potwierdza tezę, że CHIP działa jako modyfikator choroby w AAV.

w analizie podłużnej ponad 25% pacjentów wykazało wzrost wielkości klonów w czasie bez istotnego wpływu specyficznego leczenia na ekspansję klonów. Częstość występowania CHIP nie była zwiększona u pacjentów wcześniej leczonych lekami immunosupresyjnymi/cytotoksycznymi i nie została wzbogacona o mutacje związane z odpowiedzią na uszkodzenie DNA(tabela uzupełniająca S11). W związku z tym wydaje się mało prawdopodobne, aby wysoka częstość występowania CHIP była jedynie konsekwencją leczenia cytotoksycznego i wraz z powiększającymi się rozmiarami klonów uzasadniała ściślejszą obserwację chorych na AAV ze względu na znane ryzyko progresji do zespołów mielodysplastycznych lub ostrej białaczki szpikowej.1513

łącznie nasze dane ujawniają nowe skojarzenie AAV z chipem o potencjalnie modyfikującym przebieg choroby, jak pokazano w aktywacji neutrofili, regulacji transkrypcji autoantygenów i manifestacji narządów. Przyznajemy, że biorąc pod uwagę wiele testów, wartości P nie obrazują globalnego błędu typu I. Przyszłe badania i badania funkcjonalne są teraz uzasadnione, aby potwierdzić te wyniki i rozszyfrować mechanizmy molekularne.

  1. Genovese G, Kahler AK, Handsaker RE. Klonalna hematopoeza i ryzyko raka krwi wnioskowane z sekwencji DNA krwi. N Engl J Med. 2014; 371(26):2477-2487. PubMedhttps://doi.org / 10.1056 / NEJMoa1409405Google Scholar
  2. Steensma DP, Bejar R, Jaiswal S. Klonalna hematopoeza o nieokreślonym potencjale i jej odróżnienie od zespołów mielodysplastycznych. Krew. 2015; 126(1):9-16. PubMedhttps://Doi. org / 10.1182 / blood-2015-03-631747google Scholar
  3. Buscarlet M, Provost S, Zada YF. DNMT3A i TET2 dominują w krwiotwórczości klonalnej i wykazują łagodne fenotypy oraz różne predyspozycje genetyczne. Krew. 2017; 130(6):753-762. PubMedhttps://Doi. org / 10.1182 / blood-2017-04-777029Google Scholar
  4. Arends CM, Galan-Sousa J, Hoyer K. rozkład linii krwiotwórczej i ewolucyjna dynamika hematopoezy klonalnej. Białaczka. 2018; 32(9):1908-1919. PubMedhttps://doi.org/10.1038/s41375-018-0047-7Google Scholar
  5. Jaiswal S, Natarajan P, Silver AJ. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. N Engl J Med. 2017; 377(2):111-121. PubMedhttps://doi.org/10.1056/NEJMoa1701719Google Scholar
  6. Fuster JJ, MacLauchlan S, Zuriaga MA. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 2017; 355(6327):842-847. PubMedhttps://doi.org/10.1126/science.aag1381Google Scholar
  7. Frick M, Chan W, Arends CM. Rola klonalnej hematopoezy dawcy w allogenicznym przeszczepie krwiotwórczych komórek macierzystych. J Clin Oncol. 2019; 37(5):375-385. PubMedGoogle Scholar
  8. Savola P, Lundgren S, Keranen MAI. Klonalna hematopoeza u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów. Rak Krwi J. 2018; 8(8):69. Google Scholar
  9. Ciavatta DJ, Yang J, Preston GA. Epigenetyczne podstawy nieprawidłowej regulacji genów autoantygenowych u ludzi z zapaleniem naczyń ANCA. J Clin Invest. 2010; 120(9):3209-3219. PubMedhttps://doi.org / 10.1172 / JCI40034Google Scholar
  10. Jones BE, Yang J, Muthigi A. Gene-specific DNA methylation changes predict remission in patients with ANCA-associated vasculitis. J Am Soc Nephrol. 2017; 28(4):1175-1187. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2016050548Google Scholar
  11. McInnis EA, Badhwar AK, Muthigi A. Dysregulation of autoantigen genes in ANCA-associated vasculitis involves alternative transcripts and new protein synthesis. J Am Soc Nephrol. 2015; 26(2):390-399. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2013101092Google Scholar
  12. Coombs CC, Zehir A, Devlin SM. Hematopoeza klonalna związana z leczeniem u pacjentów z nowotworami niehematologicznymi jest częsta i wiąże się z niepożądanymi wynikami klinicznymi. Komórka Macierzysta. 2017; 21(3):374-382.e4. PubMedhttps://doi.org / 10.1016 / j.stem.2017.07.010 Google Scholar
  13. Desai P, Mencia-Trinchant N, Savenkov O. mutacje somatyczne poprzedzają ostrą białaczkę szpikową lata przed diagnozą. Nat Med. 2018; 24(7):1015-1023. PubMedhttps: / / doi.org / 10.1038 / s41591-018-0081-zGoogle Scholar
  14. Gibson CJ, Lindsley RC, Tchekmedyian V. Klonalna hematopoeza związana z niekorzystnymi skutkami po autologicznym przeszczepieniu komórek macierzystych chłoniaka. J Clin Oncol. 2017; 35(14):1598-1605. PubMedGoogle Scholar
  15. Abelson S, Collord G, ng SWK. Przewidywanie ryzyka ostrej białaczki szpikowej u osób zdrowych. Natura. 2018; 559(7714):400-404. Google Scholar
  16. Christen F, Hoyer K, Yoshida K. Genomic landscape and clonal evolution of acute myeloid leukemia with t (8; 21): an international study on 331 patients. Krew. 2019; 133(10):1140-1151. PubMedhttps:/ / doi.org / 10.1182 / krew-2018-05-852822google Scholar
  17. Damm F, Mylonas E, Cosson A. nabył inicjujące mutacje we wczesnych komórkach krwiotwórczych pacjentów z PBL. Rak Discov. 2014; 4(9):1088-1101. PubMedhttps://Doi.org / 10.1158 / 2159-8290.CD-14-0104GOOGLE Scholar
  18. Yoshizato T, Dumitriu B, Hosokawa K. mutacje somatyczne i hematopoeza klonalna w niedokrwistości aplastycznej. N Engl J Med. 2015; 373(1):35-47. PubMedhttps://Doi.org / 10.1056 / NEJMoa1414799Google Scholar
  19. Sallman DA, List A. centralna rola sygnalizacji zapalnej w patogenezie zespołów mielodysplastycznych. Krew. 2019; 133(10):1039-1048. PubMedhttps://doi.org/10.1182/blood-2018-10-844654Google Scholar
  20. Schreiber A, Luft FC, Kettritz R. Phagocyte NADPH oxidase restrains the inflammasome in ANCA-induced GN. J Am Soc Nephrol. 2015; 26(2):411-424. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2013111177Google Scholar

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.