Jak przeprowadzić ekstrakcję DNA z wysuszonych plam krwi za pomocą żywicy Chelex

każdy biolog, który chce przeanalizować DNA, wie, że proces rozpoczyna się od ekstrakcji DNA z interesujących komórek. Komórki te mogą być RBC, pasożyty, lub bakterie, aby wymienić tylko kilka. Ponadto istnieją różne metody ekstrakcji DNA 1 do wyboru w zależności od rodzaju próbki, dalszej analizy i tak dalej. Wielu naukowców zaczyna od wysuszonych plam krwi (DBS), dlatego szczególnie interesujące jest to, jak wyodrębnić DNA z takich próbek. DBS jest powszechnie przygotowywany, zbierając krew na Whatman FTA card2 lub Whatman chromatograficzny 3 mm bibułę filtracyjną i pozostawiając do wyschnięcia przez pewien czas (~4 godziny) przed przetwarzaniem. Ta metoda pobierania próbek biologicznych jest stosowana od dziesięcioleci.

poniżej opisano przydatną metodę izolacji DNA z takich próbek przy użyciu BT Chelex 100 Resin3.

Krok pierwszy: Liza erytrocytów

• Wytnij suchą plamę krwi i umieść ją w probówce mikrokrążenia (1,5 ml) za pomocą dziurkacza. Nie zapomnij o etykiecie tuby, szczególnie podczas pracy na wielu próbkach. Dla celów kontroli jakości, obejmują również pozytywnej kontroli krwi miejscu.
• dodaj 1 ml 0,5% saponiny do probówki mikrokrążenia zawierającej plamkę krwi. Zamknij, wir i inkubuj w temperaturze 4 0C przez co najmniej 4 godziny, lub jeszcze lepiej, przez noc. W tym etapie kompleksy saponin z cholesterolem w błonie erytrocytów prowadzą do tworzenia się porów w błonie, a tym samym hemolizy.4 saponina jest powszechnie stosowanym odczynnikiem do lizy w uwalnianiu pasożytów (na przykład pasożytów malarii) z czerwonych krwinek.
• obracaj przez kilka sekund przy 4000 obr. / min, aby usunąć krople z wewnętrznej pokrywy i odsysać saponinę z probówki za pomocą bez barierowej końcówki pipety przymocowanej do pipety Pasteura na maszynie do montażu próżniowego. Można również użyć plastikowej pipety Pasteura. Pozostaw miejsce w rurce mikrokrążenia.

Krok drugi: mycie

• dodaj 1 ml buforowanej fosforanem soli fizjologicznej do mikrokrążenia, Zamknij, wir i inkubuj w temperaturze 4 0C przez 20-30 minut. Inkubacja przez noc nie spowoduje żadnych szkód. Ten etap zapewnia, że saponina jest usuwana z probówki.
• kręć przez kilka sekund przy 4000 obr / min, a następnie usuń PBS, tak samo jak usunąłeś saponinę. Pozostaw miejsce w rurce mikrokrążenia.

Krok trzeci: ekstrakcja DNA żywicą Chelex

zasada: Żywica Chelex działa poprzez zapobieganie degradacji DNA przez enzymy degradowalne (DNazy) i od potencjalnych zanieczyszczeń, które mogą hamować dalsze analizy. Ogólnie Rzecz Biorąc, Żywica Chelex zatrzymuje takie zanieczyszczenia, pozostawiając DNA w roztworze. Żywica Chelex zatrzymuje kationy takie jak Mg2+, ważny czynnik wpływający na działanie DNazy, chroniąc tym samym DNA przed degradacją.5,6

• pipetą i dodać 150 µl 6,7% roztworu żywicy Chelex do rurki mikrokrążenia zawierającej plamkę. Zamknij rurkę. Ważne przypomnienie: przygotowując 6,7% roztwór Chelex, używaj wody, która jest wolna od Dnaz, nukleaz (lub czegokolwiek, co mogłoby uszkodzić i zniszczyć DNA).
• inkubować w temperaturze 95 0C przez 10 minut za pomocą bloku grzewczego/ shakera. Ważne jest, aby otworzyć rurkę dwa razy, co 2 minuty, aby zwolnić ciśnienie,a następnie Potrząsać przez kilka sekund. To uwalnia DNA do roztworu.

Krok czwarty: unikaj kulek żywicy Chelex w końcowym ekstrakcie

• obracaj przez 5 minut przy 4000 obr. / min
• Pipetuj jak najwięcej ekstraktu do mniejszej rurki mikrokrążenia (0,6 ml) za pomocą końcówki barierowej aerozolu, unikając przenoszenia kulek Chelex.
• odwirować 0,6 ml mikrośrodka przy 4000 obr. / min przez 10 minut. Ideą drugiego spinu jest usunięcie wszelkich pozostałych kulek Chelex, które mogłyby przenieść się do końcowego ekstraktu. Dlaczego jest to ważne? Dwa główne powody: 1) Chelex wiąże się z jonami magnezu (niezbędny Ko-czynnik polimerazy Taq stosowany w PCR) i 2) Chelex fluoresces. Jeśli fluorescencja jest Twoim sposobem na wizualizację wyniku, może to spowodować fałszywie pozytywny wynik.
• pipetować około 100 µL i przenieść końcowy Ekstrakt do nowego mikrokrążenia. Etykieta i przechowywać w lodówce.

kilka wskazówek podczas ekstrakcji DNA

• Pracuj w czystym środowisku wolnym od zanieczyszczeń
• używaj końcówek pipet wolnych od nukleaz
• obchodź się ze wszystkimi próbkami w rękawiczkach
• ponownie unikaj kulek Chelex w końcowym ekstrakcie

wniosek

Chelex Resin7, zapewnia prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA z DBS, do stosowania w różnych molekularnych zastosowaniach analitycznych. Metoda ta nie wymaga drogiego sprzętu i jest niezawodna podczas testowania z innymi metodami.

1. GE Healthcare (2010). Niezawodna ekstrakcja DNA z kart Whatman FTA. Uwaga dotycząca zastosowania 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, Wielka Brytania: GE Healthcare.
2. Przygotowanie płyty FTA do analizy DNA. Protokół Whatman FTA BD08.
3. Bio-Rad (n. d.) Chelex® 100 i Chelex 20 Chelatująca żywica jonowymienna Instrukcja obsługi. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio-Rad Laboratories.
4. Baumann, E., Stoya, G., Völkner, A., Richter, W., Lemke, C., and Linss, W. (2000). Hemoliza ludzkich erytrocytów z saponiną wpływa na strukturę błony. Acta Histochemica, 102(1), 21-35.
5. Protokół Ekstrakcji: Chelex. Strona internetowa IBRC. Retrieved from http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, C. S., Boissaye, R., Stewart, J., and Staton, P. (n. d.). Opracowanie i wewnętrzna Walidacja protokołu ekstrakcji DNA Chelex ® dla wzorcowych wymazów z jamy ustnej.
7. BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 jako nośnik do prostej ekstrakcji DNA do typowania metodą PCR z materiału Kryminalistycznego. Biotechniques, 54(3), 134-139.