immunohistochemiczne barwienie nowotworów Urotelialnych CK20 i CK5/6: perspektywa

Streszczenie

Cytokeratyny należą do rodziny włókien pośrednich. Są one wyrażane w bardzo specyficzny sposób w komórkach nabłonkowych, gdzie odgrywają kluczową rolę w integralności i stabilności mechanicznej komórek. Opisano kilka rodzajów cytokeratyn w prawidłowym, jak i nowotworowym urothelium. W przypadku nowotworów urotelialnych ekspresja CK20 i CK5 / 6 została wykazana w kilku badaniach jako implikacja diagnostyczna i prognostyczna. Tak więc rak urotelialny niskiego stopnia przejawia ekspresję CK ograniczoną do komórek parasolowych, podczas gdy nowotwory wysokiego stopnia zwykle mają ekspresję w całej grubości urothelium z wyjątkiem warstwy podstawnej. Z drugiej strony ekspresja CK5/6 jest wyrażana w komórkach podstawnych we wszystkich rakach urotelialnych o niskim stopniu nasilenia i niektórych rakach urotelialnych o wysokim stopniu nasilenia. Rozproszone barwienie CK20 wraz z utratą CK5 / 6-dodatniej warstwy podstawowej jest zwykle związane z agresywnym zachowaniem klinicznym. Podwójne zabarwienie szkiełek dla tych cytokeratyn może ułatwić właściwą interpretację i korelację.

1. Wprowadzenie

Cytokeratyny należą do rodziny cytoszkieletów z włókna pośredniego o długości 10 nm obecnych we wszystkich komórkach. Włókna pośrednie ulegają ekspresji w sposób wysoce specyficzny dla danego typu komórki, a tutaj keratyny reprezentują typową kategorię włókien pośrednich obecnych w komórkach nabłonkowych. Włókna te stanowią złożoną grupę nierozpuszczalnych w wodzie polipeptydów o wielkości od 40 000 do 68 000 Mr. W nabłonku, włókna keratyny mogą być wiązane jako włókna tonofilamentów, oplot jądra, rozpiętości przez cytoplazmę, i dołączyć do płytek cytoplazmatycznych typowych połączeń komórek nabłonka-komórki, desmosomes. Tak więc, keratyny odgrywają ważną rolę funkcjonalną w integralności i stabilności mechanicznej zarówno pojedynczych komórek nabłonka, jak i tkanek nabłonkowych i są nieodłączną częścią kontinuum stabilności od pojedynczej komórki do tworzenia tkanki .

białka keratynowe można podzielić na małe kwaśne keratyny typu I i duże zasadowe do neutralnych keratyn typu II. Unikalną właściwością keratyn jest to, że w przeciwieństwie do innych białek włókna pośredniego, mogą one stanowić Stadium nitkowate tylko przez tworzenie par cząsteczek typu I i typu II (1 : 1). Wśród keratyn ludzkich, ostatnia nomenklatura konsensusu obejmuje keratyny typu i K9–K10, K12–K28 i K31–K40 oraz keratyny typu II K1–K8 i K71–K86. W ludzkim genomie geny keratyny są grupowane w dwóch różnych miejscach chromosomowych: chromosomie 17q21.2 (keratyny typu i, z wyjątkiem K18) i chromosomie 12q13.13 (keratyny typu II i K18). Uważa się, że dwie podrodziny cytokeratyny powstały w wyniku duplikacji genów i późniejszej dywergencji CK8 i CK18 .

każdy typ komórki nabłonkowej wyraża charakterystyczną kombinację dwóch do dziesięciu izotypów cytokeratyny. Tak więc, normalne komórki nabłonkowe in vivo Lub in vitro mogą być identyfikowane w odniesieniu do ich profilu izotypu cytokeratyny. Charakterystyczne profile cytokeratyny różnych normalnych typów komórek nabłonkowych są zwykle zachowywane po transformacji nowotworowej i ta cecha może być wykorzystana w diagnostyce nowotworu. Jednak profile cytokeratyny komórek nabłonkowych mogą również odzwierciedlać różnicowanie funkcjonalne, a nie tkankę pochodzenia. Tak więc, komórki metaplastyczne wyrażają cechy profilu cytokeratyny w ich morfologii, a nie w ich normalnym odpowiedniku .

2. Ekspresja cytokeratyny w Urothelium podczas rozwoju Embriologicznego

cytokeratyny są pierwszym typem włókna pośredniego, który pojawia się podczas embriogenezy, a wszystkie komórki na pewnym etapie rozwoju płodu są dodatnie dla cytokeratyny. Pierwsze izotypy cytokeratyny do ekspresji to para CK8 + CK18. Podczas embriologicznej transformacji nabłonkowo-mezenchymalnej ekspresja cytokeratyny jest tracona przez pewne linie komórek, które albo pozostają cytokeratyną ujemną i rozwijają się w tkankę łączną, albo później ponownie wyrażają cytokeratyny wtórnego nabłonka . Rozwój embriologiczny pęcherza moczowego pochodzi z kloaki, struktury hindgut, która jest wspólną komorą dla odpadów żołądkowo-jelitowych i moczowych. W 4-7 tygodniu rozwoju kloaka dzieli się przegrodą moczowo-płciową na dwie części: tylny kanał odbytowy i przedni kanał moczowo-płciowy. Górna część zatoki moczowo-płciowej tworzy pęcherz moczowy .

we wczesnym rozwoju pęcherza moczowego nabłonek wyściełający stopniowo przekształca się z prostego nabłonka śródskórnego w wielowarstwową wyściółkę moczowo-płciową. Jako wzór wyściółki endodermalnej w przewodzie pokarmowym, rozwijająca się wyściółka moczowo-płciowa jest początkowo dyfuzyjnie dodatnia dla CK20 we wszystkich warstwach. Podczas późniejszego dojrzewania urothelium rozwija się warstwa podstawna, co można wykazać pozytywnością CK5 i CK13. Dalsze dojrzewanie urothelium wiąże się z utratą CK20 praktycznie we wszystkich warstwach z wyjątkiem komórek parasolowych. Tak więc wydaje się, że istnieją trzy różne fazy rozwoju urotelialnego. Pierwszy etap charakteryzuje się brakiem komórek podstawnych i ekspresją CK20 we wszystkich warstwach. Druga faza jest określana przez pojawienie się warstwy podstawowej, ale wzór ekspresji CK20 jest nadal rozproszony. W trzecim i ostatnim etapie dochodzi do dojrzewania wzoru ekspresji CK20, który charakteryzuje się CK20 tylko w warstwie parasolowej. Warstwa podstawowa jest dobrze rozwinięta i może być wykazana przez immunosterowanie CK5/6 lub ck13 .

3. Cytokeratyna ekspresja w normalnym Urothelium

pęcherz moczowy jest wyłożony przez urothelium, który jest wyspecjalizowany funkcjonować jako bariera dla moczu i pomieścić zmiany w objętości wewnątrzczaszkowej. Urothelium pojawia się jako nabłonek wielowarstwowy, z trzema strefami komórkowymi: (1) Podstawowa Warstwa komórkowa złożona z komórek stykających się i zorientowanych prostopadle do płaszczyzny błony podstawnej; (2) Środkowa Strefa komórkowa złożona z 2-5 warstw komórkowych; (3) luminalna lub powierzchowna warstwa komórkowa złożona z późnych komórek pośrednich i dużych, często dwujądrowych, „parasolowych” komórek z ich wierzchołkową powierzchnią skierowaną do światła. Komórki parasolowe charakteryzują się rodzajem połączeń komórkowych zonula occludens oraz obecnością wyspecjalizowanych blaszek asymetrycznej błony jednostkowej w apicznej błonie komórkowej oraz wewnątrzkomórkowych pęcherzyków wrzecionowatych . Ten wygląd jest spowodowany obecnością obfitej uroplakiny w błonie komórkowej .

w normalnym DOROSŁYM urothelium, ck7, CK8, CK18 i CK19 ulegają ekspresji we wszystkich warstwach komórek urotelialnych, CK5 ulega ekspresji bazalnej, a CK20 wiąże się z komórkami parasolowymi (Fig.1).

(a)

(b)

(a)
(b)

1

(a) normalny urothelium odsłaniający wiele warstw komórek, w tym komórki podstawne, komórki pośrednie i komórki parasolowe. b) plama Immunohistochemiczna ujawniająca normalny wzór barwienia urothelium. Komórki parasolowe zdobią CK20 (magenta). Komórki pośrednie są nieutwardzone. Komórki podstawne zdobione są barwieniem CK5 / 6 (brązowym).

istnieje również kilka komórek ck20-dodatnich w pośredniej warstwie komórkowej niektórych normalnych okazów .

4. Ekspresja cytokeratyny w brodawkowatej neoplazji Urotelialnej

transformacja nowotworowa komórek urotelialnych prowadzi do raka urotelialnego, najczęstszej postaci raka pęcherza moczowego w większości krajów. Wielu pacjentów obecnych z powierzchownych guzów, które są albo nieinwazyjne (pTa) lub inwazji tylko lamina propria (pT1). Chociaż nawrót jest częsty (50-70%), choroba może być Zwykle kontrolowana przez leczenie miejscowe. Niemniej jednak, 10-15% pacjentów z chorobą powierzchowną ostatecznie przejść do mięśni inwazyjnych i choroby przerzutowej. Wzrost stopnia, charakteryzujący się utratą różnicowania, oraz obecność zmian dysplastycznych są wyznacznikami złego rokowania. Ponadto, niektóre raki urotelialne wykazują różnicowanie podstawno-płaskonabłonkowe, co jest związane z gorszym rokowaniem .

immunohistochemiczny wzór barwienia cytokeratyny20 i CK5/6 różni się w zależności od rodzaju i charakteru nowotworu urologicznego. Na przykład, brodawkowate nowotwory urotelialne o ograniczonym potencjale złośliwym (PUNLMP), jak również rak brodawkowaty o niskim stopniu złośliwości ujawniają CK20 ograniczone do komórek parasolowych i barwienie CK5 / 6 ograniczone do warstwy podstawowej, identyczne z rozkładem tych keratyn w normalnym urotelium (fig. 2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Rysunek 2

(a) rak brodawkowaty o niskim stopniu złośliwości. B) plama Immunohistochemiczna przedstawiająca ekspresję ck20 (magenta) ograniczoną do komórek parasolowych i dobrze uformowaną warstwę podstawną przedstawioną przez zabarwienie CK5 / 6 (brązowy). C) rak urotelialny niskiego stopnia z przebarwieniem komórek podstawnych, ale bez komórek parasolowych.

z drugiej strony, raki urotelialne o wysokim stopniu nasilenia mają tendencję do rozproszonej immunoreaktywności wobec CK20, obejmującej komórki parasolowe, jak również warstwę pośrednią. Ponadto warstwę podstawową można wykazać dodatnim wynikiem CK5 / 6 (Fig.3).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

ryc. 3

(a) rak brodawkowaty o wysokim stopniu złośliwości. B) wysokiej jakości brodawkowaty rak urotelialny z rozproszonym barwieniem o pełnej grubości dla CK20 i obecnością warstwy podstawowej, co wykazano przez barwienie CK5 / 6. C) wysokogatunkowy rak urotelialny ujawniający rozproszoną obecność komórek podstawnych i zabarwienie o pełnej grubości dla CK20.

z drugiej strony, rak brodawkowaty wyższego stopnia ujawnia ekspresję CK20 w całej grubości urothelium przy braku warstwy podstawnej i negatywnym zabarwieniu dla CK5 / 6 (Fig.4).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Rysunek 4

(a) rak urotelialny wysokiego stopnia z częściową utratą komórek podstawnych, ale rozproszone zabarwienie dla CK20. (b) wysokiej jakości rak urotelialny z prawie całkowitą utratą komórek podstawnych. C) wysokiej jakości brodawkowaty rak urotelialny ujawniający rozproszone zabarwienie immunohistochemiczne dla CK20 i całkowity brak warstwy podstawowej bez zabarwienia dla CK5 / 6.

ten wzór z rozproszonym barwieniem ck20 o pełnej grubości przy braku barwienia warstwy podstawowej jest również cechą spotykaną w rakach urotelialnych o wysokiej jakości z lamina propria lub inwazją mięśni (ryc. 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Fig.5

(a) rak urotelialny o wysokim stopniu zaawansowania z wczesną inwazją wykazujący silne zabarwienie cytoplazmatyczne CK20 i brak komórek podstawnych. (b) wysokiej klasy rak urotelialny z rozległą inwazją. Komórki rakowe są dyfuzyjnie dodatnie dla CK20, ale podstawowa warstwa jest nieobecna.

zasugerowano, że wzór barwienia CK20 jest przydatnym uzupełnieniem morfologii w diagnostyce raka urologicznego. Zasugerowano również, że ekspresja CK20 może przewidywać potencjał złośliwy w guzach urorotelialnych o niskim stopniu złośliwości, a zatem CK20 może być przydatny w definiowaniu strategii leczenia pacjentów z tymi nowotworami. Ekspresja CK20 została zachowana przez większość czystych nowotworów urotelialnych, zachowując normalny powierzchowny wzór lokalizacyjny w niektórych dobrze zróżnicowanych guzach brodawkowych lub wykazując niejednorodną lub jednolicie dodatnią reakcję we wszystkich warstwach komórek. Części raka z różnicowaniem płaskonabłonkowym wykazują zmniejszenie ekspresji CK20. Obszary te jednak reagują pozytywnie dla CK5 / 6(Fig .6(A) i 6 (b)) w sposób odmienny od rozkładu podstawowego warstwy podstawowej.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

ryc. 6

(a) rak urotelialny wysokiego stopnia z ogniskowym różnicowaniem płaskonabłonkowym. b) barwienie immunohistochemiczne wykazujące silne barwienie CK5 / 6 w obszarze różnicowania płaskonabłonkowego. Pozostała część przebarwień na CK20. c) wysokogatunkowy rak urotelialny o podstawowych cechach morfologicznych. d) barwienie immunohistochemiczne w raku podstawnokomórkowym charakteryzujące się silną odpornością na CK5 / 6 i całkowitym brakiem pozytywności CK20.

w niektórych przypadkach, cały rak może wykazywać cechy basosquamous. Te przypadki wykazują silną reaktywność dla CK5 / 6 z niewielką lub zerową dodatniością dla CK20(Fig. 6(C) i 6 (d)).

dwa niedawno opublikowane badania dostarczyły dodatkowych dowodów dotyczących znaczenia klinicznego różnych schematów immunostaining dla CK20 i CK5 / 6. W jednym z tych badań analizowano próbki nowotworów od 222 pacjentów z rakiem urotelialnym górnych dróg moczowych leczonych radykalną nefroureterektomią pod kątem ekspresji siedmiu podstawowych / luminalnych markerów immunohistochemicznych (CK5, EGFR, CD44, CK20, P63, GATA3 i FOXA). Stosując CK5 i CK20 zdefiniowano cztery podtypy raków urotelialnych górnych dróg moczowych:(i)wyłącznie dodatnie CK20 i ujemne CK5 (CK20+/CK5−)(ii)wyłącznie dodatnie CK5 i ujemne ck20 (CK20−/CK5+)(iii)oba markery dodatnie (CK20+/CK5+)(iv)oba markery ujemne (ck20−/CK5−)

w wielowymiarowej analizie regresji Coxa Podtyp ck20+/CK5 był niezależnym ujemnym Marker prognostyczny z 3,83− krotnym zwiększonym ryzykiem zgonu specyficznego dla raka w porównaniu do pozostałych trzech podtypów .

w drugim badaniu stwierdzono korelację immunohistochemicznego zabarwienia CK5/6 i CK20 z rokowaniem wczesnego raka urotelialnego. Ponadto badano i korelowano z wynikami klinicznymi profile ekspresji genów w podgrupach nieinwazyjnych mięśniowo brodawkowatego raka urotelialnego górnego odcinka dróg (UTUC) sklasyfikowanego według poziomów ekspresji CK5/6 i CK20. Podgrupy te obejmowały CK5/6-high/ck20-low, CK5/6-high/CK20-high I CK5/6-low / ck20-high. Ta ostatnia grupa charakteryzująca się niską ekspresją CK5/6 i wysoką ekspresją ck20 była prognostyczna dla gorszego rokowania nieinwazyjnych mięśniowo brodawkowatych nowotworów urotelialnych wysokiego stopnia. Analiza transkrypcyjna wykazała 308 genów różniących się ekspresją w poszczególnych podgrupach. Analizy funkcjonalne genów zidentyfikowały adhezję komórek jako wspólny proces różnicowo wzbogacony w tej podgrupie w porównaniu z innymi, co mogłoby tłumaczyć jej fenotyp wysokiego ryzyka. W tej podgrupie wzbogacono również sygnatury późnego cyklu komórkowego/proliferacji . Wydaje się więc, że guzy urotelialne charakteryzujące się rozproszonym barwieniem dla CK20 przy braku widocznej warstwy podstawnej stanowią najbardziej agresywny Podtyp brodawkowatego raka urotelialnego.

Cytokeratyna 5/6 jest obecna w prawidłowym rogowaceniu naskórka i płaskonabłonkowego nabłonka śluzówki, a także w komórkach podstawnych lub komórkach mioepitelialnych piersi, gruczołów ślinowych i prostaty . W biopsjach gruczołu krokowego i piersi CK5 / 6 dekoruje warstwę komórek podstawnych i dlatego jest przydatny w diagnostyce raka inwazyjnego, który jest pozbawiony komórek podstawnych. Struktura urothelium różni się od struktury nabłonka gruczołu krokowego lub gruczołu sutkowego, w wyniku czego obecność lub brak komórek podstawnych nie może być stosowany do rozwarstwienia nowotworów urotelialnych do typów łagodnych lub złośliwych. Jednak brak komórek podstawnych w nowotworach urotelialnych może wskazywać na złe rokowanie. Tak więc, rak urotelialny o wysokiej jakości z zachowaną warstwą podstawną może zachowywać się mniej agresywnie w porównaniu do innego guza o wysokiej jakości, w którym warstwa podstawna została utracona. W naszym laboratorium stosujemy podwójne barwienie dla tych cytokeratyn, co jest niezwykle pomocne w prawidłowej interpretacji tych plam.

podobny schemat barwienia można również zaobserwować w raku urotelialnym in situ . Zmiany te są zwykle silnie reaktywne dla CK20 i mogą, ale nie muszą, utrzymywać CK5 / 6-dodatnią warstwę komórek podstawnych. Przylegający typ raka urotelialnego in situ i pagetoidalne rozszerzenie komórek rakowych można również rozpoznać po dodatnim zabarwieniu CK20 (Fig.7).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

ryc. 7

(a) rak Urotelialny in situ z silną odpornością na ck20 o pełnej grubości z wyraźną warstwą komórek podstawnych dodatnią na CK5/6. B) inny rak urotelialny in situ charakteryzujący się silnym zabarwieniem na CK20 i brakiem warstwy podstawnej. c) pagetoidowe rozszerzenie raka urotelialnego wykazane przez silne zabarwienie cytoplazmatyczne dla CK20 na tle wielu warstw komórek podstawnych reaktywnych dla CK5 / 6.

w niewielu przypadkach rak in situ może być reaktywny dla CK5 / 6, co wskazuje na różnicowanie bazaloidów .

5. Embriologiczne różnicowanie Urotelialne a Dedifferencjacja w neoplazji Urotelialnej

ścisła korelacja między wzorcami ekspresji izotypu cytokeratyny a różnicowaniem nabłonkowym sugeruje, że cytokeratyny są kluczowe dla struktury i/lub funkcji tkanki nabłonkowej. Jednak trudno było ustalić, jaki jest dokładny udział osób lub kombinacji izotypów cytokeratyny w normalnym i nowotworowym fenotypie i zachowaniu komórek nabłonkowych. Tak więc zmiany w immunolokalizacji CK20, które wskazują na większe ryzyko nawrotu raka urotelialnego, prawdopodobnie odzwierciedlają wtórną zmianę związaną z dysregulacją programu różnicowania urorotelialnego podczas karcynogenezy, zamiast wskazywać, że CK20 jest bezpośrednio zaangażowany. Można spekulować, że wzorce ekspresji CK20 i CK5 / 6 w różnych rakach urotelialnych mają tendencję do naśladowania etapów rozwoju embriologicznego i różnicowania urothelium. Tak więc, rak moczowo-płciowy o wysokiej jakości (z inwazją lub bez inwazji), charakteryzujący się rozproszoną ekspresją CK20 bez żadnej warstwy podstawowej, może reprezentować wczesne stadium różnicowania urologicznego po oddzieleniu Zatoki moczowo-płciowej od kloaki . Na tym etapie rozwoju, urothelium przejawia rozproszone zabarwienie CK20, ale brakuje warstwy podstawowej. W niektórych rakach urotelialnych o wysokiej jakości występuje jednolite zabarwienie wszystkich warstw przez CK20, ale istnieje również dobrze uformowana warstwa podstawna, którą można wykazać przez ekspresję CK5 / 6. Może to być równoznaczne z pośrednim Stadium embrionalnego różnicowania urotelialnego. Dobrze zróżnicowany rak moczowo-płciowy charakteryzuje się obecnością dojrzałego wzorca ekspresji CK20, gdzie jego ekspresja jest w większości ograniczona do komórek parasolowych, podczas gdy dobrze zdefiniowana warstwa podstawnokomórkowa immunoreaktywna dla CK5/6 jest również obecna (Fig.8 i 9).

Rysunek 8

(a) rysunek przedstawiający etapy różnicowania podczas rozwoju embriologicznego urothelium. We wczesnych stadiach rozwijający się urothelium zachowuje ekspresję CK20 normalnie obserwowaną w kloace. Na tym etapie nie ma warstwy podstawowej. b) podczas rozwoju urothelium warstwy podstawowej nie można wykazać poprzez barwienie CK5/6. C) końcowy etap różnicowania urotelialnego z normalną ekspresją CK20 ograniczoną do komórek parasolowych i obecnością normalnej warstwy podstawnej manifestującej ekspresję CK5 / 6.

Rysunek 9

(a) rysunek przedstawiający immunohistochemiczny wzór barwienia w raku urotelialnym brodawkowatym o niskiej jakości z ekspresją CK20 ograniczoną do komórek parasolowych i obecnością dobrze zdefiniowanej warstwy podstawnej, która wyraża CK5/6. b) rak urotelialny wysokiego stopnia ujawnia ekspresję CK20 we wszystkich warstwach urothelium, z wyjątkiem warstwy podstawowej, która zawiera CK5 / 6. Może to stanowić pośredni etap dedifferentiacji guza. c) w raku urotelialnym wysokiego stopnia warstwa podstawna może być nieobecna, ale zachowany jest rozproszony wzór barwienia ck20. Cechy te mogą wskazywać na dalsze dediferentiation raka.

wzór ten może być równoważny końcowemu etapowi rozwoju urotelialnego i dojrzewania w okresie wewnątrzmacicznym.

podsumowując, immunohistochemiczne barwienie raka urotelialnego dla CK20 i CK5 / 6 może dostarczyć przydatnych informacji dotyczących charakteru raka urotelialnego i jego klinicznego zachowania.

dostępność danych

brak danych na poparcie tego badania.

konflikty interesów

autorzy oświadczają, że nie mają funduszy ani konfliktów interesów do ujawnienia.

podziękowania

autorzy pragną docenić cenną pomoc i wiedzę techniczną następujących pracowników nadzorczych i technicznych naszego laboratorium immunohistochemicznego w wykonywaniu dwukolorowego barwienia immunohistochemicznego: Pani Rajaa Al Abdulla, przełożony; Pani Huda Ahmed Al Hijji, przełożony; i Pani Zuhoor Ali, starszy technolog.