Hidden in plain sight–bardzo obfite i zróżnicowane planktoniczne chloroflexi Słodkowodne

obfitość i różnorodność rodzaju Chloroflexi w środowiskach słodkowodnych

opierając się na 16S rRNA odczytać obfitość z 117 metagenomów z jezior, zbiorników i rzek, przedstawiciele rodzaju Chloroflexi stanowiły do 7% populacji Chloroflexi.prokariotyczna społeczność w epilimnionie (rys. 1a, b), jednak z dużymi wahaniami. Podobnie jak w poprzednich obserwacjach, linia CL500-11 zdominowała próbki hipolimnionu (osiągając co najmniej 16% we wszystkich próbkach poza jedną próbką i prawie 27% w jednej próbce z jeziora Biwa) (rys. 1c), poza mniej znaną grupą określaną jako Gromada TK10. Większość sekwencji rRNA 16S związanych z TK10 w bazie danych SILVA pochodzi z gleby, ludzkiej skóry lub nieznanych próbek metagenomicznych, podczas gdy tylko cztery (1,5%) pochodzą z wód słodkich (dodatkowy plik 1: Rysunek S1A).

co zaskakujące, próbki epilimnionu były zdominowane przez sekwencje powiązane z „SL56 marine group” (do ok. 5% ogółu społeczności prokariotycznej). Sekwencje Silvy związane z SL56 zostały odzyskane z jeziora słodkowodnego i zestawów danych Global Ocean Series (GOS). Jednak próbka GOS, z której zostały opisane, jest w rzeczywistości słodkowodnym zbiornikiem danych, Lake Gatun (Panama). Jest to dość oczywiste z naszych wyników (rys. 1; dodatkowy plik 1: Rysunek S2), że klaster ten konsekwentnie występuje tylko w jeziorach, zbiornikach i rzekach, ale nie w Siedlisku morskim, co sugeruje, że został błędnie nazwany ” grupą morską.”Inna grupa sekwencji, określana jako JG30-KF-CM66, opisana z różnych środowisk (stos odpadów wydobywczych uranu, gleba, Słodkowodne, słup wody morskiej i osady), okazała się preferencyjnie rozmieszczona w rzekach (szczególnie Amazonii) niż jeziorach (Fig. 1a, b), aczkolwiek przy bardzo małej obfitości (maksymalnie 1% wszystkich prokariotów). Podobne obficie stwierdzono w słonawym Morzu Kaspijskim (głębokość 40 m i 150 m) (dodatkowy plik 1: Rysunek S2).

jednak nie mogliśmy znaleźć poparcia dla obecności ani klastra SAR202, ani jego słodkowodnego siostrzanego kladu CL500-9 we wszystkich badanych Słodkowodnych zestawach danych metagenomicznych. W siedliskach morskich i słonawych SAR202 znajdują się prawie wyłącznie w ciemnych warstwach afotycznych, gdzie stanowią do 30% społeczności prokariotycznej . Jeśli w siedliskach Słodkowodnych występują klady związane z SAR202, z pewnością nie są one zbyt obfite lub być może nie pochodzą ze słupa wody w oryginalnym raporcie (dodatkowy plik 1: Rysunek S1). Ogólnie rzecz biorąc, mimo że względna obfitość Chloroflexi w epilimni słodkowodnej jest znacznie niższa niż w głębszych wodach, są one domem dla bogatego i powszechnego zbioru nowych grup.

dzięki tym obserwacjom łatwo jest również zauważyć, że w badanych tutaj środowiskach wodnych (Słodkowodnych, słonawych i morskich) różnorodność przedstawicieli Chloroflexi jest zasadniczo różna, a środowiska Słodkowodne zawierają filogenetycznie bardziej zróżnicowany asortyment grup niż słonawe lub morskie. Ponadto istnieją wyraźne dowody na obecność wyłącznie Słodkowodnych grup (np., SL56) oraz grupy tylko morskie i słonawe (SAR202), przypominając, że zasolenie stanowi barierę dla przejścia siedlisk mikrobiologicznych między ekosystemami słodkowodnymi i morskimi . Nie jest to bynajmniej bariera nie do pokonania, ponieważ stosunkowo niedawne przejścia ze Słodkowodnych do morskich (np. Słodkowodne ” Ca. Methylopumilus spp.”i marine OM43 ) i odwrotnie (marine Pelagibacter i freshwater ld12) zostały zaproponowane. Jest jednak prawdopodobne, że grupy występujące w słonawych środowiskach mogą być po prostu lepiej „zagruntowane” dla bardziej udanych wypraw. Znajdujemy przykłady grup, które są obecne w słodkowodnych i słonawych metagenomach (JG30-KF-CM66 i CL500-11).

główni przedstawiciele Freshwater Chloroflexi

zautomatyzowane binowanie styków związanych z Chloroflexi z zespołów każdego 57 zbiorów danych należących do 14 różnych środowisk (28 jezior/zbiorników, 26 rzek i 3 słonawe zbiory danych) spowodowało segregację 102 magów (genomów zmontowanych metagenomem) w sumie (dodatkowy plik 2: Tabela S1). Analiza filogenomiczna MAGs z 30% lub większą kompletnością (N = 53) pokazuje, że niezwykle duża różnorodność MAGs została odzyskana z praktycznie wszystkich znanych klas Chloroflexi (Fig. 2). Trzydzieści pięć magów tworzyło trzy osobne nowe linie klasowe bez dostępnych hodowanych przedstawicieli (SL56, TK10 i JG30-KF-CM66).

podczas gdy fluorescencja hybrydyzacji in situ, a następnie katalizowane osadzanie reporterowe (CARD-FISH) wykryto dużą liczbę komórek CL500-11 w epilimnionie Jeziora Zuryskiego podczas częściowej mixis w zimie, szczytowe poziomy obfitości zawsze znajdowano w głębszych strefach, w obu jeziorach Zurychu (do 11% wszystkich prokariotów; Fig. 3a) i jezioro Biwa (do 14%; rys. 3d). CL500-11 obfitość koreluje ujemnie zarówno z temperaturą, jak i stężeniem chlorofilu a (plik dodatkowy 1: Rysunek S3). Jednak w próbkach zbiornika Řimov CL500-11 był poniżej granicy wykrywalności (< 0,18%), co sugeruje, że to stosunkowo płytkie siedlisko (maksymalna głębokość 43 m) nie stanowi preferowanej niszy dla tej grupy bakterii (dodatkowy plik 1: Rysunek S4). Komórki CL500 – 11 były wcześniej wizualizowane przez karciane ryby i pokazane jako duże, zakrzywione komórki . Podobne kształty i rozmiary zaobserwowano w próbkach ryb z Jeziora Zuryskiego o średniej długości 0,92 µm (zakres 0,4–1,6 µm; n = 277) i szerokości 0,28 µm (zakres 0,19-0,39 µm). Analiza objętości komórek (mediana 0.06 µm3) i biomasy dla tego klastra w porównaniu do wszystkich prokariotów (rys. 3c) sugeruje niezwykle wysoki udział populacji CL500 – 11 w całkowitej biomasie drobnoustrojów. Ich stosunek biomasy do obfitości wynosi prawie 2, tj. przy 10% obfitości stanowią prawie 20% całkowitej biomasy prokariotycznej, co wskazuje na niezwykłą adaptację do stosunkowo oligotroficznego głębokiego hipolimnionu, osiągając wysokie populacje nawet przy dużych rozmiarach komórek.

odzyskaliśmy 11 magazynków (10 Słodkowodnych, 1 słonawy) dla CL500-11 W sumie. Wszystkie cztery Magury jeziora Biwa z różnych miesięcy tworzą jeden gatunek. Jednak dwa gatunki z jeziora Zurych wydają się współistnieć przez cały rok (Marzec, Maj i Listopad) z jednym gatunkiem rozgałęziającym się razem z wcześniej opisanym MAG z jeziora Michigan (CL500-11-LM) i innymi gatunkami mającymi bliskich przedstawicieli również w słonawym Kaspijskim (> 95% ANI) i podobnymi metagenomicznymi wzorami rekrutacji fragmentów (Fig. 2 i 4c). Proponujemy kandydujący rodzaj Profundisolitarius (Pro. fun. di. so. li. ta’ri.us. L. ADJ. profundus deep; L. adj. solitarius alone; N. L. masc. n. Profundisolitarius (jedyny odludek z głębin) w obrębie Candidatus Profundisolitariaceae fam. listopad dla klastra CL500 – 11 (Klasa Anaerolinea).

natomiast grupa SL56 jest dominującą linią w zbiorniku Řimov (maksymalnie 1.1%), zarówno w analizie 16S rRNA, jak i CARD-FISH (Fig. 1 i 3). Maksymalne obficie prawie zawsze stwierdzano na wysokości około 5-20 m w temperaturze ok. 15 °C, co sugeruje, że grupa ta jest przede wszystkim epilimnetyczna (dodatkowy plik 1: rys. S3 i S4). Ten region słupa wody (termoklina), oprócz gradientu temperatury, ma również znacznie mniejsze natężenie światła w porównaniu z warstwami powierzchniowymi. Szczytowe obficie zaadaptowanych cyjanobacterium Planktothrix rubescens na głębokości około 13 m w warstwowych profilach letnich Jeziora Zurych pokrywają się z maksymalnymi obficiami SL56 (dodatkowy plik 1: Rysunek S3). Komórki SL56 mają kształt pręta i są wydłużone (średnia długość = 0,68 ± 0,25 µm; średnia szerokość=0,35 ± 0,09 µm; N = 6; Fig. 3e). Według naszej wiedzy, jest to pierwszy raport o specyficznej dla słodkowodnej grupy Chloroflexi, która wydaje się rozwijać w epilimnionie.

w sumie odzyskano 14 magów dla klastra SL56 (1 zawierającego 16S rRNA) i tworzą linię na poziomie klasy, znacznie różniącą się od wszystkich znanych Chloroflexi (Fig. 2). Ich jedynym krewnym jest pojedynczy MAG (Chloroflexi CSP1-4) opisany z osadów wodonośnych . Klad 16S rRNA, do którego CSP1-4 podobno jest stowarzyszony, to Gitt-GS-136, a większość sekwencji w tym kladzie pochodzi z osadów glebowych lub rzecznych (informacje z taksonomii Silvy). Jednak nie byliśmy w stanie wykryć żadnej sekwencji rRNA 16S (częściowej lub całkowitej) w dostępnej sekwencji genomu CSP1-4. Najbliższy Klad (w taksonomii 16S rRNA) do Gitt-GS-136 i SL56 jest KD4-96, którego sekwencje uzyskano z tych samych siedlisk (patrz dodatkowy plik 1: Rysunek S1B). Ponadto wszystkie znane sekwencje 16S rRNA z grupy SL56 pochodzą tylko z wód słodkich (jezioro Gatun, jezioro Zurych itp.). Łącznie wydaje się, że najbliżsi krewni filogenetyczni słodkowodnej linii SL56 zamieszkują siedliska glebowe lub osadowe.

SL56 MAGs zostały zrekonstruowane z odległych geograficznie miejsc (Europa, Ameryka Północna i Południowa, rys. 2), a co najmniej dziewięć różnych gatunków może zostać wykrytych (ANI, rys. 1). Nie otrzymano magów z próbek jeziora Biwa, ale trzy sekwencje 16S rRNA zostały pobrane w nierozwiązanych stygach. Zrekonstruowane Magy są globalnie rozmieszczone wzdłuż Słodkowodnych zbiorów danych z epilimnion (żaden nie wykryty w głębokim hipolimnion) (rys. 4 i dodatkowy plik 1: Rysunek S6). Z Morza Kaspijskiego nie zrekonstruowano żadnych magów SL56, a żaden z odzyskanych genomów nie zrekrutowano ze słonawych metagenomów. Proponujemy kandydujący rodzaj Limnocylindrus (Lim.no. cy. lin ’ Drus.Gr. fem. N. limne a lake; L. masc. n. cylindrus a cylinder; n. L. masc. N. Limnocylindrus cylinder z jeziora) w obrębie Limnocylindraceae fam. listopad, „Limnocylindrales” ord.nov., oraz Limnocylindria classis. listopad dla gromady Chloroflexi SL56.

sekwencje TK10 16S rRNA znaleziono przy największej obfitości w próbkach Hipolimnionu jeziora Biwa (maksymalnie ok. 2%) (rys. 1a, c). Komórki były jajowate o szacowanej długości 1,08 ± 0,1 µm i szerokości 0,84 ± 0,09 µm (N = 12; Fig. 3e). Spójny klaster dziewięciu magów (trzy zawierające dodatkowy plik 16S rRNA 1: Rysunek S1) z odległych geograficznie miejsc (europa, azja i Ameryka Północna) został odzyskany. Te niezwykle kosmopolityczne organizmy żyjące w głębszych warstwach jeziornych nie są bardzo zróżnicowane (wartości ANI > 95%). Ta pozornie niska różnorodność może być konsekwencją bardzo wyspecjalizowanej niszy lub, co bardziej prawdopodobne, wynikiem stosunkowo niedawnego przejścia na słodką wodę, podobnego do ” Ca. Fonsibacter ” (Ld12 Alphaproteobacteria). Nie wykryto przedstawicieli 16S rRNA w morskich lub słonawych metagenomach, chociaż niektóre sekwencje 16S rRNA bazy danych SILVA uzyskano z osadów morskich i słupa wody(dodatkowy plik 1: Rysunek S1). Najbliżsi krewni z 16S rRNA wydają się pochodzić z gleby lub z próbek osadów sugerujących, że mogą to być ich pierwotne siedliska. Co ciekawe, klaster TK10 jest również głęboko rozgałęziony, dopiero po SL56 i CSP1-4 w drzewie filogenetycznym Chloroflexi na ogół, a wszyscy inni przedstawiciele Chloroflexi (Mags lub izolowane genomy) wydają się pochodzić z gałęzi odrębnej dla obu z nich. Proponujemy kandydujący rodzaj Umbricyclops (Um.bri.cy ” clops. L. fem. N. umbra shadow; L. masc. N. cyclops (z gr. Oko okrągłe; Cyclops) a cyclops; n. L. masc. N. Umbricyclops a round-eye living in the shade) w obrębie Umbricyclopaceae fam. listopad, Rząd Umbricyclopales ord.nov., oraz Umbricyclopia classis nov. dla tej grupy organizmów.

wyniki CARD-FISH pokazują, że komórki JG30-KF-CM66 są kuliste o szacowanej średnicy 0,56 µm (± 0,15 µm; N = 8; Fig. 3e); jednak bardzo niskie proporcje (< 0,28%) zaobserwowano dla JG30-KF-CM66 w Jeziorze Zuryskim i profilach głębokości zbiornika Řimov (dodatkowy plik 1: rysunki S3 I S4). Otrzymaliśmy 12 magów, głównie z kolumny głębokiej wody (osiem słonawych, cztery Słodkowodne), jeden z prawie kompletną sekwencją 16S, która utworzyła nową linię klasową w analizie filogenomicznej (Fig. 1). Najbliższymi krewnymi tych magów są marine SAR202 i Dehalococcoidea (Fig. 1 i dodatkowy plik 1: Rysunek S1). W obrębie tej gromady można wyróżnić odrębne grupy magów słonawych i słodkowodnych. Proponujemy kandydujący rodzaj Bathosphaera (Ba.tho.sphae ’ Ra. Gr. adj. bathos deep; L. fem. N. sphaera a; N. L.fem. N. Bathosphaera a coccoid bacteria living in the deep) w obrębie Bathosphaeraceae fam. listopad, Bathosphaerales ord.nov., oraz Bathosphaeria classis. listopad dla klastra Chloroflexi JG30-KF-CM66.

odzyskaliśmy również MAGs w klasach Chloroflexia (cztery MAGs) i Caldilineae(dwa MAGs) (rys. 1). Chloroflexia MAGs były związane z mezofilnym Oscillochloris trichoides DG-6 w Podrząd Chloroflexineae (jeden MAG) i trzy inne MAGs do Kouleothrix aurantiaca w Kouleotrichaceae fam. listopad tworząc nowy Podrząd, dla którego proponujemy nazwę Podrząd Kouleothrichniae. listopad Żadna z tych magów nie wykazuje żadnego znaczącego fragmentu poza miejscem ich pochodzenia. Dodatkowe 14 magów z Morza Kaspijskiego powiązanych z gromadą SAR202, które nie będą dalej omawiane tutaj, ponieważ zostały już opisane .

wkład freshwater Chloroflexi w funkcjonowanie ekosystemu

wgląd metaboliczny w zrekonstruowane Chloroflexi MAGs (kompletność ≥ 30%) sugeruje przede wszystkim heterotroficzny styl życia, który w niektórych grupach jest wzmacniany przez wytwarzanie energii napędzanej światłem za pomocą rodopsyn (CL500-11, Chloroflexales, SL56 i TK10) lub tlenowej fototrofii bezoksygenicznej (Chloroflexales). MAGs każdego klastra zawierają niezbędne geny dla centralnego metabolizmu węglowodanów, w tym glikolizy, glukoneogenezy i cyklu kwasu trikarboksylowego. Kluczowe geny dla asymilacyjnej redukcji siarczanów (syntaza 3′-fosfoadenozyny 5 ’ – fosfosiarczanu (PAPS) i siarczan adenylotransferazy) były nieobecne w większości magów, co sugeruje wykorzystanie egzogennych zredukowanych związków siarki . Geny denitryfikacji (azotan reduktazy/azotyn oksydoreduktazy alfa i beta podjednostki i azotyn reduktazy) stwierdzono w TK10 MAGs, ale kolejne enzymy odpowiedzialne za produkcję azotu cząsteczkowego były nieobecne.

w środowisku wodnym Thaumarchaeota i cyjanobakterie są głównym źródłem kobalaminy i jej prekursorów korynoidowych dla dużej społeczności auksotropów lub tych nielicznych zdolnych do uratowania. De novo synteza kobalaminy ma wysoki koszt metaboliczny, a hipoteza czarnej Królowej została przedstawiona jako wyjaśnienie powodów, dla których tylko kilku członków społeczności podejmuje się jej produkcji . Żaden ze zrekonstruowanych Chloroflexi magów nie koduje niezbędnych genów do biosyntezy pierścienia corrinowego od podstaw, a kobalaminy o wysokim powinowactwie (BtuBFCD) lub innych podejrzewanych transporterów corrinoidów (DET1174-DET1176) również nie brakuje, co może być konsekwencją niekompletności genomu lub użycia nieopisanego transportera. Jednak nie wszystkie te organizmy wydają się być auksotropami, ponieważ Mags klastra JG30-KF-CM66 koduje geny dla szlaku odzyskiwania kobinamidu do kobalaminy, który wykorzystuje importowane korrinoidy wraz z półproduktami ze szlaku biosyntezy ryboflawiny do syntezy kobalaminy . ZH-chloro – G3 MAG zawiera prawie kompletny Szlak biosyntezy kobalaminy (brakuje tylko CobC) i ryboflawiny (dodatkowy plik 3: Tabela S2).

geny zespołu Flagellar były obecne w kilku Magach klastrów CL500-11 i TK10 (Fig. 1 i dodatkowy plik 3: Tabela S2). Jednakże, L-I P-elementy pierścieniowe, które kotwiczą wić do zewnętrznej błony brakowało we wszystkich wić MAGs i genomów chloroflexi odniesienia (na przykład, Thermomicrobium, Sphaerobacter). Ponadto Mags i referencyjne genomy Chloroflexi nie kodowały genów do biosyntezy LPS i nie wykryto układów wydzielania, poza Sec i Tat (brak układów wydzielania typu I–IV zakotwiczonych w błonie zewnętrznej) (dodatkowy plik 3: Tabela S2). Porównawcza genomika dostępnych genomów Chloroflexi wzmacnia wnioskowanie, że podczas gdy mikrografy elektronowe sugerują dwie gęste elektronowo warstwy u większości członków tego typu, Chloroflexi prawdopodobnie posiada pojedynczą błonę lipidową (monoderm), a nie dwie (diderms).

sekwencje rodopsyny zostały rozpoznane w 18 Magach tego badania od przedstawicieli CL500-11, Chlorofleksji, SL56 i TK10, które są filogenetycznie najbliższe ksanthorhodopsynom (dodatkowy plik 1: Rysunek S8A i B) i są dostrojone do pochłaniania zielonego światła podobnego do innych rodopsyn słodkowodnych i przybrzeżnych (dodatkowy plik 1: Rysunek S8C). Kilka magów koduje geny do biosyntezy karotenoidów, umożliwiając możliwość anteny karotenoidowej, która jest cechą charakterystyczną ksanthorhodopsyn . Spośród pozostałości związanych z wiązaniem saliniksantyny (dominującego karotenoidu Salinibacter ruber) znaleźliśmy zaskakująco wysoką liczbę konserwowanych (10 identycznych z 12 w co najmniej jednej sekwencji rodopsyny) (dodatkowy plik 1: Rysunek S8D), co sugeruje, że antena karotenoidowa może być związana, dzięki czemu przynajmniej niektóre z tych sekwencji bonafide xanthorhodopsins.

nawet przedstawiciele CL500 – 11 i TK10, którzy znajdują się głównie w hipolimnionie podczas stratyfikacji, są zdolni do fototrofii; jednak mogą potencjalnie uzyskać dostęp do strefy fotycznej podczas mixis zimowej i wczesnej wiosny. Oprócz fotoheterotrofii opartej na rodopsynie, pobraliśmy również MAGs klasy Chlorofleksji kodującej geny dla fotosystemów typu II białek centrum reakcji L I m (pufL i pufM), bakteriochlorofilu i biosyntezy karotenoidów. Klaster sekwencji genu pufM wraz z innymi sekwencjami pufM związanymi z Chloroflexi (dodatkowy plik 1: Rysunek S9). Jednak nie znaleziono dowodów na Wiązanie węgla, zarówno poprzez szlak 3-hydroksypropionianowy, jak i cykl Calvina–Bensona w żadnym fotosystemie nośnym MAG, co może być konsekwencją niekompletności MAG. Może się również zdarzyć, że są to tlenowe fototrofy bezoksygenowe, które nie utrwalają węgla, np. Słodkowodne Gemmatimonadetes i Acidobacteria (obie tlenowe) .

Evolutionary history of pelagic Chloroflexi

z analiz filogenomicznych wynika, że zbiór przedstawicieli rodzaju Chloroflexi odzyskanych w tej pracy, wraz z istniejącymi sekwencjami genomu z izolatów i magów, oferuje tylko częściowy szkic złożonej ewolucyjnej historii tego typu. Na przykład najbardziej rozbieżne gałęzie ” ok. Limnocylindria „(Gromada SL56) i ” Ca. Umbricyclopia „(Gromada TK10) nie mają praktycznie żadnych bliskich krewnych poza osadem wodonośnym MAG (spokrewnionym z ” Ca. Limnocylindria”). Jednak powiązane klony 16S rRNA zostały odzyskane z gleby/osadów dla obu tych grup, co sugeruje przejście do pelagicznego stylu życia (dodatkowy plik 1: Rysunek S1B).

biorąc pod uwagę brak powiązanych morskich sekwencji rRNA 16S dla tych grup, oprócz ich niewykrywalności w morskich metagenomicznych zestawach danych sugeruje również pochodzenie z gleby / osadu, a nie Środowiska solnego. Chociaż nie można formalnie wykluczyć możliwości pochodzenia morskiego, najbardziej prawdopodobna wydaje się kierunkowość przejścia z gleby/osadu na słupy wody słodkiej. Ponadto, biorąc pod uwagę, że ” ok. Limnocylindria ” i ” Ca. Umbricyclopia „rozbieżność przed dywergencją klas Dehalococcoidea i marine SAR202 (Klasa” Ca. Monstramaria”), które są jak dotąd jedynym znanym ekologicznie chloroflexi morskim (pierwszym w osadach morskich, a drugim w głębokich kolumnach wody oceanicznej), jest prawdopodobne, że pierwotna Chloroflexi pochodzi z Siedliska glebowo-osadowego. Sukces morskiego SAR202 w głębokich oceanach jest niezwykły; jest to najszerzej rozpowszechniona, być może numerycznie najbardziej obfita Grupa Chloroflexi na planecie. Jednak niektóre sekwencje 16S rRNA od jego najbliższych krewnych, Dehalococcoidea, zostały również odzyskane z osadów Słodkowodnych, chociaż zdecydowana większość wydaje się pochodzić z głębokich osadów morskich (oba siedliska beztlenowe).