Frontiers in Physiology

wprowadzenie

sieci neuronowe, które leżą u podstaw odruchu chemosensorycznego układu oddechowego, są głównym celem zrozumienia etiologii kilku zaburzeń behawioralnych i fizjologicznych. Istnieje hipoteza, że zaburzone odruchy chemosensoryczne odgrywają rolę zarówno w zaburzeniach wrodzonych, jak i dorosłych, w tym w zespole nagłej śmierci niemowląt (SIDS), wrodzonym Zespole centralnej hipowentylacji (CCHS), centralnym bezdechu sennego, nieprawidłowym oddychaniu w zespole Retta i zespole hipowentylacji otyłości (Obonai et al., 1998; Ozawa et al., 2003; Amiel et al., 2009; Ramanantsoa et al., 2011; Lavezzi et al., 2013). Zgodnie z hipotezą fałszywego alarmu uduszenia uważa się, że nieodpowiednia aktywacja chemosensoryczna lub nadwrażliwość odgrywają rolę w podgrupach pacjentów cierpiących na zaburzenia paniczne (Klein, 1993). Dysfunkcja Chemosensory może również odgrywać rolę w chorobach neurodegeneracyjnych poprzez zaburzenia snu w oddychaniu, które jest związane z przyspieszoną progresją (Hakim et al., 2012; Verbraecken and McNicholas, 2013; Bahia and Pereira, 2015; Snyder et al., 2017). Tak więc lepsze zrozumienie sieci chemosensorycznych pnia mózgu dostarczy ważnych wskazówek do wielu patologii behawioralnych i fizjologicznych.

farmakogenetyczne receptory projektantów aktywowane wyłącznie przez designerskie leki (DREADDs) (Armbruster et al., 2007) zostały wykorzystane w wielu badaniach mapujących populacje nerwowe w chemoreflexie oddechowym (oddychanie odpowiedzią na podwyższony poziom CO2 we krwi). Technologia DREADD w połączeniu z międzysektorowym rozmieszczeniem genetycznym została wykorzystana do wyciszenia wysoce ukierunkowanych populacji neuronalnych podczas obserwacji czynności oddechowych u świadomych i niepohamowanych myszy przez nasze laboratorium i inne, unikając wielu nieporozumień z wcześniejszych podejść do mapowania obwodów (Ray et al., 2011, 2013; Brust et al., 2014; Hennessy et al., 2017; Sun and Ray, 2017; Sun et al., 2017). Te i większość innych badań prawie zawsze zawierały tylko CNO bez ekspresji DREADD, które nie wykazywały żadnych chemosensorycznych lub innych efektów oddechowych, argumentując, że CNO nie miało żadnego poza docelowego wpływu na oddychanie u świadomych i nieskrępowanych myszy pomimo zastosowanej dużej dawki, 10 mg / kg. Niemniej jednak stwierdzono w kilku innych badaniach, że CNO i jego produkty metabolizmu pleców mogą mieć poza celowy wpływ na zachowanie i poruszanie się w różnych testach, ale wyjście oddechowe nie zostało uwzględnione (Guettier et al., 2009; Joober, 2010; MacLaren et al., 2016; Gomez et al., 2017; Ilg et al., 2018; Mahler and Aston-Jones, 2018; Manvich et al., 2018; Padovan-Hernandez i Knackstedt, 2018). Wykazano również, że CNO i jego metabolity nie są równoważnie dystrybuowane między układem krążenia a mózgiem(Gomez et al., 2017).

drugi, nierozwiązany problem wynika ze stresu wywołanego przez paradygmat eksperymentalny, w tym trzymania zwierząt w komorze pletyzmograficznej całego ciała, manipulowania, iniekcji dootrzewnowej i pomiarów temperatury odbytnicy. We wcześniejszych badaniach Dredd respiratory, naiwne myszy wprowadzono do małej komory (140-400 mls) i pozwolono im się zaaklimatyzować 20-40 minut przed pozyskaniem danych (Ray i wsp ., 2011, 2013; Brust et al., 2014; Hennessy et al., 2017; Sun and Ray, 2017; Sun et al., 2017). Nie jest jednak jasne, czy ten czas jest wystarczający do zminimalizowania wywołanych stresem zmian oddechowych, które mogą działać jako czynnik oddziałujący z działaniem klozapiny.

w naszych badaniach nad rolą układu noradrenergicznego (NA) w kontroli oddechowej staraliśmy się wykorzystać dobrze ugruntowaną RC::P_hm4d allel DREADD (Ray et al., 2011) to test the role of NA neurons in baseline and hypercapnic respiration in unrestrained adult animals using whole-body plethysmography. Ponieważ neurony noradrenaliny i NA są również znane z odgrywania centralnej roli w odpowiedziach na stres (Valentino and Van Bockstaele, 2008; Chen et al., 2018), przeprowadziliśmy serię badań, aby porównać ekstensywne przyzwyczajenie (wielokrotne narażenie na paradygmat eksperymentalny, w którym zwierzę dowiaduje się, że doświadczenie nie jest groźne lub możliwe do przeżycia) i wysokie vs. Niskie (1 mg/kg) dawki CNO z wcześniej opublikowanymi protokołami DREADD(Ray et al., 2011, 2013; Brust et al., 2014; Hennessy et al., 2017; Sun and Ray, 2017; Sun et al., 2017). Tutaj po raz pierwszy pokazujemy, że wysokie ogólnoustrojowe dawki CNO są zdolne do wywoływania efektów poza celem na autonomiczną funkcję oddechową u świadomych myszy. Ujawniamy również, że poza-docelowy wpływ CNO na chemosensoryczną wydajność oddechową jest skutecznie demaskowany przez rozległe przyzwyczajenie i dlatego nie byłoby widoczne we wcześniejszych badaniach kontrolnych CNO, które nie przyzwyczajały zwierząt przed pomiarem oddechowym, wykorzystując tylko krótki okres aklimatyzacji przed zebraniem danych. Łącznie wyniki te sugerują, że wcześniej zmapowane populacje neuronów mogą pośrednio wpływać na kontrolę oddechową poprzez potencjalne role w regulacji odpowiedzi na stres. W szczególności, Dane te zgadzają się z ostatnimi doniesieniami sugerującymi, że CNO nie jest biologicznie obojętny w dużych dawkach poprzez metaboliczną konwersję do klozapiny (MacLaren et al., 2016; Gomez et al., 2017) i że off-target efekty behawioralne mogą objawiać się nie tylko z perturbacji obwodów behawioralnych, ale także z zakłóceń do podstawowych obwodów autonomicznych i homeostazy.

wyniki

sterownik DBH-Cre oznacza i jest ograniczony do wyrażających TH regionów noradrenergicznych w pniu mózgu, które są hamowane przez podawanie CNO

aby zbadać ekspresję i swoistość linii DBH-Cre, użyliśmy schematu hodowli pojedynczej rekombinazy (Fig.1A), w którym przekroczyliśmy sterownik do linii Ai9 (Madisen et al., 2010), który wyraża flokowane tdTomato. Barwienie przeciwciałem hydroksylazy tyrozynowej (TH) wykazało, że ekspresja tdtomato w pniu mózgu była ograniczona do regionów ekspresji th, w tym do locus coeruleus, A5, A1, A2, A7, jąder SubCV i subcd zgodnie z oczekiwaniami (Fig. Aby potwierdzić, że neurony na wyrażające receptor hM4D reagują na CNO, wykonaliśmy nagrania na neuronach locus coeruleus (LC), gdzie zaobserwowaliśmy hamowanie wypalania neuronów po zastosowaniu kąpieli CNO (N = 3, Fig.

zaburzenie neuronów noradrenergicznych za pośrednictwem CNO-hM4D u dorosłych myszy

aby zbadać rolę neuronów NA w oddychaniu wyjściowym i hiperkapnicznym, zastosowaliśmy system DREADD hamujący RC: P_hM4D skrzyżowany ze sterownikiem DBH-Cre. Z wykorzystaniem pletyzmografii całego ciała (Ray et al., 2011), mierzyliśmy reakcje wentylacyjne niepohamowanych dorosłych zwierząt w Warunkach powietrza w pomieszczeniu (21% O2/79% N2) i hiperkapnic (5% CO2/21% O2/74% N2) przed i po podaniu CNO (rysunek 1D). Aby rozwiązać problem dawkowania CNO i potencjalnego stresu wywołanego przez nasz eksperymentalny projekt, zwierzęta poddano jednemu z czterech warunków: (1) unhabituated i wstrzyknięto 10 mg/kg CNO; (2) habituated i wstrzyknięto 10 mg/kg CNO; (3) unhabituated i wstrzyknięto 1 mg/kg CNO; lub (4) habituated i wstrzyknięto 1 mg/kg CNO. Przyzwyczajenie polegało na 5-dniowym procesie obejmującym manipulację, badanie temperatury doodbytniczej, wstrzyknięcie soli fizjologicznej i ekspozycję na komorę pletyzmograficzną każdego dnia przez 30 minut, podczas gdy wcześniej nieleczone zwierzęta były narażone tylko na 20-45 minutowy okres aklimatyzacji Komory bezpośrednio przed zebraniem danych, jak to miało miejsce we wcześniejszych badaniach (Ray et al., 2011, 2013; Brust et al., 2014; Hennessy et al., 2017; Sun and Ray, 2017; Sun et al., 2017). Mierzone parametry oddechowe obejmowały częstość oddechu RR, objętość pływów (VT), wentylację minutową (VE), zużycie tlenu (VO2), wentylację minutową znormalizowaną do zużycia tlenu (VE/VO2), częstotliwość bezdechu, częstotliwość westchnienia oraz współczynniki zmienności dla odstępu międzyodrzwiowego i amplitudy (niestabilność okresowa i objętościowa). Jako dodatkową kontrolę porównaliśmy również zwierzęta przyzwyczajone i niehabituowane typu dzikiego, którym podawano sól fizjologiczną.

zaburzenie CNO-hM4D neuronów DBH-Cre powoduje deficyt Hiperkapniczny

w trzech warunkach, DBH-CRE; RC::Zwierzęta P_hM4D wykazały zmniejszenie VE I VE/VO2 po podaniu CNO, podczas gdy grupy kontrolne rodzeństwa nie wykazały różnic w wartościach przed i po CNO. Niehabituowane zwierzęta, którym wstrzyknięto 10 mg/kg CNO, wykazały znamienny spadek RR (-12,17%, p = 0,034) i VT (-30,87%, p = 0,0016), co skutkowało zmniejszeniem VE (-38,64%, p = 0,0031) i nieznacznym zmniejszeniem VO2 (-14,25%, p = 0,042) (ryc. 2). Zmniejszenie VE było większe niż zmniejszenie VO2, co skutkowało ogólnym zmniejszeniem VE/VO2 (-26,89%, p = 0,0095). Niehabituowane zwierzęta, którym wstrzyknięto 1 mg/kg CNO, wykazywały tendencję do zmniejszonego RR (-12,88%, p = 0,066) i znacznie zmniejszonego VT (-16,52%, p = 0,00085) I VE (-28,08%, p = 0,0070), co prowadziło do ogólnego zmniejszenia VE/VO2 (-22,23%, p = 0,016) (ryc. 3). Wreszcie, u zwierząt przyzwyczajonych, którym podawano 1 mg/kg CNO, zaobserwowano zmniejszenie RR (-10,77%, p = 0,074), tendencję do zmniejszenia VE (-25,07%, p = 0,074) i zmniejszenie ogólnego VE/VO2 (-23,70%, P = 0,024) (rycina 4). W żadnej kohorcie nie obserwowano istotnych zmian częstości bezdechów, częstotliwości Westchnień, okresowej lub objętościowej niestabilności ani temperatury.

::P_hM4D i kontrola rodzeństwa u zwierząt przyzwyczajonych do wstrzyknięć 10 mg/kg CNO, zauważyliśmy znaczne zmniejszenie VE / VO2 (p = 0,0235), spowodowane zmniejszeniem RR (p = 0,00036) I VE (P = 0,037) (ryc. 5). Jednak w przeciwieństwie do innych kohort, nie było różnicy między DBH-Cre; RC::P_hM4D a zwierzętami kontrolnymi rodzeństwa w tych parametrach: RR (-12,72 vs.-10,22%, p = 0,6268), VE (-24,88 vs. -23,94%, p = 0,4150) lub VE/VO2 (-15,4 vs. -22,55%, p = 0,4643).

5

Rysunek 5. Zarówno DBH-Cre; RC::P_hM4D zwierzęta i grupy kontrolne rodzeństwa, którym podawano 10 mg/kg CNO, wykazują deficyt hiperkapniczny. Po podaniu CNO, DBH-CRE; RC::P_hM4D kontrole zwierząt i rodzeństwa nie wykazują zmian w wentylacji powietrza w pomieszczeniu i zmniejszenia RR (a), VE (C) I VE/VO2 (E) w Warunkach hiperkapnicznych bez znaczących zmian VT (B), VO2 (D), częstotliwości bezdechu (F), częstotliwości westchnienia (G), okresowej (H) lub niestabilności objętościowej (I) oraz temperatury (J).

Zwierzęta przyzwyczajone i Niehabituowane typu dzikiego, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, nie wykazały żadnych zmian Presaliny i Postsaliny

chociaż nie zaobserwowano fenotypów w grupach kontrolnych, w których wstrzyknięto 1 mg/kg CNO, zajęliśmy się możliwością, że sam zastrzyk spowodował fenotyp obserwowany w grupach kontrolnych, w których wstrzyknięto 10 mg/kg CNO, testując zwierzęta przyzwyczajone i niehabituowane typu dzikiego, w których wstrzyknięto sól fizjologiczną (ryc. 6). Zarówno w kohortach wyhodowanych, jak i niehabitualizowanych zwierzęta nie wykazywały żadnych różnic w parametrach oddychania po podaniu presaliny i postsaliny. Nie zaobserwowano istotnych zmian w częstości bezdechów, częstotliwości Westchnień, okresowej lub objętościowej niestabilności ani temperatury.

stosunek stężenia klozapiny do CNO jest wyższy w mózgu niż w surowicy

aby określić biodostępność CNO i klozapiny, mierzyliśmy ich stężenia w surowicy i mózgu za pomocą spektrometrii masowej. Trzydzieści minut po dootrzewnowym wstrzyknięciu CNO u myszy, CNO występuje w mniejszej względnej obfitości w porównaniu z jego metabolitem wstecznym klozapiną w surowicy i mózgu dla wszystkich badanych dawek, 0,1 mg/kg (surowica P = 0,0054, mózg p = 0,0001) (Fig.mózg P = 0.0005) (rys. 7C). Podczas analizy stosunku klozapiny do CNO wartości te były zawsze powyżej zera i były wyższe w mózgu niż w surowicy (nośnik P > 0, 5, 0, 1 mg/kg p > 0, 5, 1 mg/kg p = 0, 0018, 10 mg/kg p = 0, 0160) (Fig.

dyskusja

wstępnym celem tego badania było zbadanie roli neuronów DBH-Cre w fizjologii układu oddechowego po ostrych zaburzeniach u niepohamowanych i świadomych dorosłych zwierząt. Ponieważ noradrenalina i Neurony NA odgrywają dobrze udokumentowaną rolę w zachowaniach stresowych (Valentino and Van Bockstaele, 2008; Chen et al., 2018), staraliśmy się również zbadać, czy przyzwyczajenie do prawdopodobnego stresującego protokołu fizjologicznego miałoby wpływ na wcześniej obserwowane fenotypy układu oddechowego. W protokole pletyzmograficznym całego ciała, stosowanym w naszym laboratorium i innych, zwierzęta są traktowane, badane doodbytniczo pod kątem temperatury, wystawiane na nowe środowisko (komora pletyzmograficzna) i wstrzykiwane dootrzewnowo. Wcześniejsze badania wykazały, że obsługa i przyzwyczajenie do iniekcji i innych „rutynowych” procedur może modyfikować parametry behawioralne i fizjologiczne, w tym oddychanie(Misslin et al., 1982; Andrews and File, 1993; Lapin, 1995; Ryabinin et al., 1999). Inne stosowane stresory również modyfikują oddychanie zarówno w warunkach wyjściowych, jak i hiperkapnicznych (Isom i Elshowihy, 1982; Kinkead et al., 2001).

w naszych badaniach wykorzystujących Wysokie dawki CNO odkryliśmy, że hamowanie neuronów NA zdefiniowanych przez DBH-Cre za pośrednictwem HM4D spowodowało zmniejszenie hiperkapnicznego odruchu VE / VO2 w czterech zdefiniowanych kohortach eksperymentalnych, ze zmniejszonym RR, VT I VE, co potwierdza wcześniejsze badania (Biancardi et al., 2008; Viemari, 2008; Gargaglioni et al., 2010). Jednakże, grupa kontrolna z przyzwyczajeniem rodzeństwa, po podaniu dawki 10 mg/kg CNO stosowanej we wcześniejszych badaniach oddechowych, wykazała deficyt wentylacji w Warunkach hiperkapnicznych o takiej samej wielkości, jak u zwierząt DBH-Cre; RC:: P_hM4D. Żadna inna grupa kontrolna rodzeństwa nie wykazała tego fenotypu, w tym kohorta przyzwyczajona, która otrzymała tylko (1 mg / kg CNO) lub sól fizjologiczną. Wyniki te sugerują, że wyższe dawki CNO (10 mg/kg) mają wpływ na odpowiedź hiperkapniczną, która jest demaskowana po intensywnym przyzwyczajeniu, jednocześnie przypuszczalnie zmniejszając poziom stresu u zwierząt, oraz że niższe dawki CNO nie mają wpływu na kontrolę oddechową u zwierząt przyzwyczajonych. Wyniki te są również zgodne z pracą Korsaka et al. who wykazała, że niska dawka CNO (2 mg / kg) nie wywołuje efektów poza celem w zdolności do pracy w teście wysiłkowym, który obejmował wcześniejsze szkolenie(Korsak i wsp ., 2018) oraz Fleury Curado et al. who nie wykazywał specyficznego wpływu niskiej dawki CNO (1 mg/kg) na wydech oddechowy (Fleury Curado i wsp ., 2018).

zwiększony stosunek klozapiny do poziomu CNO w surowicy i w mózgu (Fig.7) jest zgodny z najnowszymi badaniami, które sugerują, że CNO jest łatwo metabolizowany do klozapiny i wykazuje większą przepuszczalność mózgu w porównaniu do CNO u myszy i gdzie indziej (Jann i wsp., 1994; Chang et al., 1998; Guettier et al., 2009; Gomez et al., 2017; Raper et al., 2017). Nie jest jednak jasne, czy obserwowane efekty uboczne są spowodowane CNO lub klozapiną. Ponieważ nasze pomiary hiperkapniczne wystąpiły <30 minut po zastosowaniu CNO, jest prawdopodobne, że działanie układu oddechowego poza celem jest pośredniczone przez klozapinę. Nasze wyniki (rycina 7) pokazują wysoki względny poziom klozapiny w mózgu, chociaż CNO nie jest całkowicie nieobecny. Jednak Huckstepp i współpracownicy zastosowali bezpośrednią aplikację CNO do rdzenia brzusznego u znieczulonych szczurów, aby wykazać, że tylko w powietrzu w pomieszczeniu, a nie w Warunkach hiperkapnicznych lub niedotlenienia, aplikacja CNO ma niewielki efekt, zwiększając częstotliwość i zmniejszając czas wydechowy, ale pozostawiając VT bez zmian, bez wyraźnego efektu obserwowanego podczas hiperkapni(Huckstepp et al., 2015). Biorąc pod uwagę bezpośrednie zastosowanie u znieczulonych szczurów i ramy czasowe eksperymentów, jest prawdopodobne, że małe efekty poza celem były mediowane przez CNO, a nie przez klozapinę.

tylny metabolit klozapina jest powszechnie stosowanym lekiem uspokajającym i przeciwpsychotycznym w schizofrenii z wieloma endogennymi celami, w tym antagonistycznymi działaniami o niskim powinowactwie w receptorach dopaminergicznych D1, D2 i D4, receptorach serotoninergicznych 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT3, 5-HT6 i 5-HT7, receptorach histaminowych H1 oraz receptorach adrenergicznych α1 i α2, między innymi (Fitton and Heel, 1990; Ashby and Wang, 1996). Efekty uboczne widoczne tutaj mogą wynikać z różnych lub połączonych mechanizmów i celów. Klozapina może wpływać na oddychanie jako środek uspokajający. Wcześniejsze badanie wykazało zmniejszenie RR i VT poniżej 5 I 10% CO2 zarówno podczas powolnego snu, jak i szybkiego ruchu gałek ocznych w porównaniu do cichego stanu czuwania u myszy (Nakamura i wsp ., 2007). Alternatywnie, hamowanie ukierunkowanych neuronów wyrażających DREADD może skutkować działaniem antyanxiogennym lub anksjolitycznym podobnym do naszego protokołu przyzwyczajenia, aby ujawnić chemosensoryczne efekty poza celem za pośrednictwem CNO / klozapiny. Oba wyjaśnienia są poparte kilkoma badaniami, które wykazały, że CO2 odgrywa rolę w wrodzonych i wyuczonych reakcjach na strach i zachowaniach związanych z lękiem(Ziemann et al., 2009; Feinstein et al., 2013; Taugher et al., 2014; Dlouhy et al., 2015; Winter et al., 2017). Tak więc neurony ukierunkowane w niektórych z tych badań mogą rzeczywiście odgrywać rolę w kierowaniu anksjogennymi reakcjami behawioralnymi, a nie fizjologicznymi odruchami chemosensorycznymi, ponieważ zarówno układ katecholaminergiczny, jak i serotonergiczny są zaangażowane w zachowania lękowe / lękowe i homeostazę chemosensoryczną (Brust et al., 2014; Hennessy et al., 2017).

i odwrotnie, fenotypy chemosensoryczne obserwowane przy wysokich poziomach CNO mogą być prawdziwe, ponieważ byliśmy w stanie podsumować hiperkapniczny deficyt mediowany przez NA przy dawkach CNO, o rząd wielkości niższej u myszy przyzwyczajonych, podczas gdy grupy kontrolne nie wykazały efektu CNO. Jednak pełne porównania we wcześniejszych badaniach są trudne ze względu na brak, w niektórych przypadkach, zgłoszonych danych VO2, VT, RR I VE/VO2. Na przykład zmiany temperatury ciała lub tempa metabolizmu mogą również wpływać na wiele sposobów na wyjście oddechowe i chemosensoryczne, a temperatura pletyzmografu w komorze była znacznie różna w niektórych przypadkach (34 vs.30°C w naszych badaniach), wpływając na zakres dynamiczny składnika barometrycznego kształtu fali, a tym samym objętość pływu. Warto zauważyć, że nie widzieliśmy ani znaczących zmian w charakterystyce fal oddechowych w żadnym z naszych warunków, ani ostrego zatrzymania krążenia, które zaobserwowano w naszych wcześniejszych badaniach nad wysokimi dawkami, całych rombów(Sun et al., 2017).

nasze wyniki pokazują po raz pierwszy, że CNO ma nieoczekiwany wpływ na hiperkapniczny odruch chemosensoryczny, który jest demaskowany przez rozległe przyzwyczajenie. Co ważne, pomimo wysokiego poziomu, efekt CNO poza celem został wcześniej wykluczony z powodu braku fenotypu w kontrolach rodzeństwa, ale co wykazujemy, staje się jasne po przyzwyczajeniu. Oferujemy poza-docelową charakterystykę CNO w mysim systemie modelowym w celu uzupełnienia badań na szczurach i naczelnych nieludzkich. Wyniki tutaj podnieść możliwość, że dodatkowe CNO pośredniczy, poza celem wpływ na obwody badane lub autonomiczne lub homeostatyczne obwody mogą istnieć, ale mogą być maskowane w innych kontrolowanych eksperymentach. Co ważne, dane te ujawniają, że badacze powinni dążyć do wykorzystania minimalnych dawek ligandu aktywującego możliwego w połączeniu z wysokim poziomem przyzwyczajenia i że odpowiednie kontrole muszą być włączone do chemicznych manipulacji genetycznych, aby w pełni docenić i zinterpretować dane eksperymentalne.

materiały i metody

zatwierdzenie etyczne

badania zostały zatwierdzone przez Baylor College Of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee zgodnie z protokołem AN-6171.

Hodowla, tło genetyczne i utrzymanie myszy

utrzymywaliśmy kolonie wszystkich naszych heterozygotycznych szczepów myszy poprzez krzyżowanie wsteczne do myszy C57BL/6J i homozygotycznych szczepów przez krzyżówki rodzeństwa. Do eksperymentów histologicznych DBH-Cremice zostały połączone z homozygotyczną myszą Ai9 (Madisen et al., 2010) (JAX 007909). W przypadku eksperymentów pletyzmograficznych myszy DBH-Cre zostały połączone z homozygotycznym RC:: P_hM4D (Ray et al., 2011) myszy do wyprowadzenia zwierząt, w których wszystkie myszy nosiły allel RC:: P_hM4D. Zwierzęta rodzeństwa, które nie odziedziczyły allelu Cre, były używane jako zwierzęta kontrolne dla potomstwa Cre dodatniego. Rosa26 specyficzne Startery dla myszy Ai9, RC:: P_hM4D i RC:: ePe były 5′-GCACTTGCTCTCCCAAAGTC, 5′-GGGCGTACTTGGCATATGAT i 5′-CTTTAAGCCTGCCCAGAAGA i dają pasmo 495 bp (ukierunkowane) i pasmo 330 bp (wt). Cre-specyficzne dla wszystkich kierowców rhombomere Cre były 5′-ATCGCCATCTTCCAGCAGGCACCATTGCCC i 5′ – GCATTTCTGGGGATTGCTTA i dały pasmo 550 bp, jeśli jest dodatnie. Do eksperymentów LC-MS myszy C57BL/6J uzyskano z Center of Comparative Medicine (CCM), Baylor College Of Medicine.

Histologia

DBH-Cre w wieku od czterech do ośmiu tygodni; AI9 dorosłe myszy były przezskórnie perfuzowane roztworem 0,1 M buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS), a następnie 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS. Mózgi rozcięto i upuszczono przez 2 godziny w 4% PFA przed płukaniem PBS i wyrównaniem w 20% sacharozie w PBS. Mózgi następnie podzielono na sekcje 30 µm, zamontowano na szkiełkach i oznaczono immunofluorescencyjnymi przeciwciałami. Zabarwiliśmy przez noc przeciwciałem przeciw hydroksylazy tyrozynowej w celu identyfikacji neuronów katecholaminergicznych (1:1000, Millipore AB152), a następnie przez 2 godziny z osłem anty-króliczym cy3 wtórnym (1:500, Jackson 711-165-152) w 0,1% Triton-X w PBS (PBST) z 5% osłem serum. Obrazy zostały zebrane za pomocą pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego Zeissa.

Elektrofizjologia

poziome plasterki mózgu zawierające locus coeruleus (300 µm) zostały wycięte za pomocą wibratomu (Leica VT 1000s, Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) od dorosłych myszy DBH-Cre; rr2p; RC::ePe (~1 miesiąc) w 4°C sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF). Plastry zanurzano w komorze perfuzowanej natlenionym ACSF (95% O2 i 5% CO2) zawierającym w mM: 124 NaCl, 2,0 KCl, 1,3 MgSO4, 2,5 CaCl2, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 i 10 glukozy (2-3 ml/min). Nagrania pełnokomórkowe przeprowadzono w temperaturze 30°C przy użyciu konwencjonalnych technik patch-clamp i wzmacniacza MultiClamp 700B (Molecular Devices, Union City, CA). Neurony GFP-dodatnie z locus coeruleus zostały wizualnie zidentyfikowane, a następnie zobrazowane za pomocą obrazu podczerwieni z kontrastem różnicowym interferencji na scenie mikroskopu pionowego (Axioskope FS2, Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy). Pipety płatkowe (oporność 4-6 mln j.) napełniono (w mM): 110 K-glukonianem, 10 KCI, 10 HEPES, 10 Na2-fosfokreatyną, 2 MG3-ATP i 0,2 Na3-GTP; pH skorygowano do 7,2, a osmolarność do 300 mOsm. Potencjał utrzymywania wynosił -70 mV. CNO zastosowano w kąpieli.

pletyzmografia

pletyzmografia na świadomych, niepohamowanych myszach została przeprowadzona zgodnie z opisem na dorosłych zwierzętach w wieku od 6 do 12 tygodni (Ray et al., 2011). Habituowane myszy poddawano 5-dniowemu protokołowi habituacji, w którym każdy dzień składał się z kilku minut obsługi, temperatury pobieranej przez sondę doodbytniczą, dootrzewnowego wstrzyknięcia soli fizjologicznej i 30 minut w komorze pletyzmograficznej. Następnie myszy testowano w ciągu 1 tygodnia od ostatniego dnia przyzwyczajenia. Niehabituowane myszy nie były narażone na manipulację ani na komora pletyzmografu. Wszystkie myszy nie były wcześniej leczone CNO i były stosowane tylko raz.

w dniu badania myszy pobierano z klatki domowej, ważono i pobierano temperaturę doodbytniczą. Następnie zwierzęta umieszczano w przepływowej komorze pletyzmograficznej z regulacją temperatury (płaszczem wodnym w temperaturze 30°C) i pozwalano na aklimatyzację przez co najmniej 20 minut w Warunkach powietrza w pomieszczeniu (21% O2/79% N2). Po aklimatyzacji i pomiarze w powietrzu w pomieszczeniu Gaz komorowy zamieniono na hiperkapniczną mieszaninę 5% CO2 / 21% O2/74% N2 przez 20 minut. Gaz komorowy był następnie przełączany z powrotem na powietrze pokojowe na 20 minut. Myszy na krótko usuwano w celu pomiaru temperatury doodbytniczej i iniekcji dootrzewnowej CNO (National Institute of Mental Health Chemical Synthesis and Drug Supply Program) rozpuszczonego w soli fizjologicznej (1 lub 0,1 mg/ml) dla skutecznego stężenia odpowiednio 10 lub 1 mg/kg. Zwierzę wróciło do komory na kolejne 20 min powietrza pokojowego, 20 min hiperkapni i 20 min powietrza pokojowego. Zwierzę zostało następnie usunięte z komory, a temperatura odbytnicy została pobrana natychmiast po zakończeniu eksperymentu.

chromatografia cieczowa-Spektrometria Mas

dwadzieścia cztery myszy typu dzikiego, równomiernie podzielone według płci, zważono i potraktowano 10 mg/kg CNO, 1 mg/kg CNO, 0, 1 mg/kg CNO lub nośnikiem. Trzydzieści minut po wstrzyknięciu próbki krwi pobrano przez nakłucie serca i umieszczono w MIKROTAINERACH BD. Próbki odwirowywano w temperaturze 4°c przy 13 500 obr. / min w wirówce stołowej i pobierano supernatanty. Surowicę i mózgi trzymano w temperaturze -20°C aż do ekstrakcji.

rozpuszczalniki klasy HPLC wodę, chloroform acetonitrylu i metanol oraz kwas mrówkowy klasy spektrometrii masowej otrzymano z Sigma-Aldrich (St.Louis, MO). Roztwór kalibracyjny zawierający wiele kalibrantów w roztworze acetonitrylu, kwasu trifluorooctowego i wody zakupiono od Agilent Technologies (Santa Cruz, CA). Metabolity i wzorce wewnętrzne, w tym kwas N-acetylo-asparaginowy-D3, tryptofan-15n2, kwas glutaminowy-d5, tymina-D4, kwas giberelinowy, Trans-zeatyna, kwas jasmonowy, kwas antranilowy 15N i testosteron-D3 zostały zakupione od Sigma-Aldrich (St.Louis, MO). Microtainer R SST TM otrzymano od Bectona Dickinsona (Franklin Lakes, NJ).

ekstrakcja składała się z 750 µl zimnego metanolu:wody (4:1) zawierającego 20 µl z dodatkiem wzorców wewnętrznych, które dodawano do każdej próbki mózgu (50 mg) i kontroli jakości, a następnie homogenizowano przez 1 min każda. Następnie dodano 750 µl 100% acetonitrylu zawierającego 20 µl wzmocnionych wzorców wewnętrznych do przemywania próbki (100 µl) i kontroli jakości, a następnie sonikowano przez 5 minut. Wszystkie próbki odwirowywano przy 5000 obr. / min przez 10 min w temperaturze 4°C. Otrzymany supernatant zebrano i wstrzyknięto 20 µl do LC-MS.

wszystkie Próbki analizowano przy użyciu 6490 potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) sprzężonego z systemem HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) przez wielokrotne monitorowanie reakcji (MRM). Na wykryty metabolit uzyskano około 8-11 punktów danych. Wykryte metabolity to klozapina, CNO i norklozapina (N-demetyl klozapina). W metodzie zastosowano tryb ESI positive. Kolumną HPLC była kolumna ACQUITYUPLC C18 (100 Å, 1,8 µm i 2,1 mm × 100 mm. Milford, MA, USA) o natężeniu przepływu 0,5 ml/min.

gromadzenie i analiza danych

pletyzmografia

pletyzmografia zmiany ciśnienia zostały zmierzone przy użyciu przetwornika różnicy ciśnień Validyne dp45 i komory referencyjnej oraz demodulatora nośnika CD15 i zarejestrowane za pomocą LabChartPro w czasie rzeczywistym. Przebiegi analizowano w trybie offline za pomocą LabChartPro i niestandardowego kodu MATLAB w celu określenia częstości oddechów (RR), objętości pływów (VT) (Ray et al., 2011), minute ventilation (VE), and pattern analysis. Fale oddechowe były zbierane w okresach, gdy zwierzę było w stanie spoczynku, a odczyty były wolne od artefaktów ruchowych. Analizowano co najmniej 1 min skumulowane dane zebrane ze śladów o długości co najmniej 10 s z ostatnich 10 min danego stanu doświadczalnego. Zużycie O2 określono poprzez porównanie składu gazu między kalibracją w pustej komorze a oddychaniem na żywo za pomocą czujnika tlenu i analizatora AEI. Temperatura w komorze była stale monitorowana za pomocą sondy Thermoworks MicroThermo 2 i była rejestrowana za pomocą LabChartPro w czasie rzeczywistym.

pomiary Poincaré ’ ego oraz częstość Westchnień i bezdechów zostały określone za pomocą 1 min śladów wolnych od ruchu z każdego stanu oddychania. Westchnienia definiowano jako oddech o amplitudzie co najmniej dwa razy większej od przeciętnego oddechu. Apneas były definiowane jako interwał międzyodrzwiowy (ibi) co najmniej dwa razy większy od średniego IBI. Współczynnik zmienności (CV) IBI i amplitudy obliczono również na podstawie tego samego 1-minutowego zestawienia śledzenia każdego stanu oddychania (błąd standardowy IBI lub Amplituda/średnia IBI lub Amplituda).

statystyki

pletyzmografia

wyniki (RR, VT, VE, VO2, VE/VO2, liczba apneas i westchnień oraz CV IBI i amplituda) dla powietrza w pomieszczeniu i danych hiperkapnicznych porównano między kohortami DBH-Cre; RC::P_hM4D i kontrolami rodzeństwa przy użyciu liniowego modelu regresji mieszanych efektów z typem zwierzęcia (eksperymentalne (Pre vs.Post Injection) jako stałe efekty i identyfikator zwierzęcia jako efekt losowy. Dane dotyczące temperatury porównano przy użyciu liniowego modelu regresji efektów mieszanych z typem zwierzęcia (eksperymentalne vs. Kontrola) jako stałym efektem. P < 0,05 użyto do wskazania istotności statystycznej, a poszczególne punkty danych, średnia i standardowy błąd średniej są pokazane na wszystkich wykresach.

chromatografia cieczowa-Spektrometria Mas

uzyskany obszar pod pikiem dla każdej próbki został znormalizowany przez kontrolę wewnętrzną, a następnie do pojazdu przed wykonaniem analizy statystycznej. Do porównania względnej obfitości klozapiny i CNO w każdej tkance z podziałem na grupy stężeń użyto testu t niesparowanego.

Etyka

wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee of Baylor College Of Medicine. Eksperymenty były zgodne z krajowymi normami opieki i wykorzystania zwierząt doświadczalnych określonymi przez Stowarzyszenie oceny i Akredytacji opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi.

author Contributions

js, FS-M, MC-M i RR Js, FS-M i PZ przeprowadziły eksperymenty i przyczyniły się do analizy danych. Js, FS-M, VM, MC-M i RR napisał artykuł.

finansowanie

to badanie było wspierane przez granty R01HL130249 i R01HL130249-S1 od National Heart, Lung, and Blood Institute; March of Dimes Basil O ’ Connor Award; i McNair Medical Institute.

Oświadczenie o konflikcie interesów

autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek relacji handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

podziękowania

dziękujemy Dr Shailę K. Mani i Benjaminowi Arekielowi za pomocne dyskusje. Dziękujemy również Baylor College Of Medicine Proteomics Core facility za wykonanie chromatografii cieczowej-spektrometrii masowej.