kiedy myślisz o oddzielaniu białek, myślisz o oddzielaniu ich za pomocą żelu? Konkretnie za pomocą SDS-PAGE? Jeśli odpowiedziałeś „tak”, to nie bez powodu. SDS-PAGE jest wszechobecny w laboratoriach biologii molekularnej, ponieważ jest dobry w oddzielaniu białek. Jednak SDS-PAGE zajmuje dużo czasu i jest pracochłonny. Rozszerzmy więc zestaw narzędzi i spójrzmy na inny sposób oddzielania białek: elektroforezę w żelu kapilarnym.
elektroforeza w żelu kapilarnym (CGE) vel elektroforeza przesiewania kapilarnego vela. SDS-elektroforeza w żelu kapilarnym oddziela białka w żelu poprzez kolumny wypełnione pożywką oddzielającą.
wymagania sprzętowe
w elektroforezie w żelu kapilarnym Twoje anality (białka, które chcesz zbadać) migrują przez roztwór elektrolityczny przez naczynia włosowate przez siłę przyciągającą pola elektrycznego – podobnie jak bardziej znana strona SDS. Do wykonania CGE potrzebne są: fiolka z próbkami, fiolki źródłowe i docelowe, matryca przesiewająca, kolumna kapilarna, detektor kolumnowy, wyjście danych i urządzenie do obsługi oraz zasilacz wysokiego napięcia.
protokół w skrócie
w eksperymencie CGE próbka rozpoczyna się w fiolce źródłowej i kieruje się w stronę fiolki docelowej. Oto protokół w skrócie:
Krok 1: fiolki źródłowe i docelowe, a także łączące je kapilary, są wypełnione roztworem elektrolitycznym, a próbka jest wprowadzana do kapilary.
Krok 2: po przyłożeniu pola elektrycznego anality migrują z fiolki źródłowej do fiolki docelowej.
Krok 3: detektor kolumnowy (nic dziwnego) umożliwia wykrywanie w kolumnie. Detektor wysyła dane do urządzenia wyjściowego i obsługującego dane, takiego jak komputer.
Krok 4: te dane są następnie wyświetlane jako elektroferogram. Twoje anality są odczytywane jako szczyty o różnych czasach retencji.
aby dowiedzieć się więcej o tym, jak to działa, odwiedź pomocne materiały UC Davis.
więcej o matrycy
twoja matryca przesiewająca może składać się z wielu polimeryzowanych materiałów, w tym usieciowanego poliakrylamidu, dekstranu i poli(glikolu etylenowego lub tlenku etylenu). Kolumny są zwykle wykonane z wymiennych polimerów przesiewających. To od Ciebie zależy, czy stworzysz własne kolumny lub je kupisz. Laboratoria Beckman Coulter, Agilent Tech i Bio-Rad sprzedają zestawy przesiewające, ale wiedzą, że wymagają one również użycia ich instrumentów CGE.
dlaczego powinieneś używać CGE
teraz słyszałeś o tym, co to jest CGE, dlaczego powinieneś go używać?
- ma krótszy czas pracy. Uruchomienie CGE zajmuje 10-100 razy mniej czasu niż elektroforeza żelowa.
- w eksperymencie CGE jest mniej kroków niż w eksperymencie SDS-PAGE. Wynika to z faktu, że końcowe wyniki eksperymentu CGE są podawane przez komputer podłączony do urządzenia.
- CGE jest również lepiej przystosowany do małych białek niż tradycyjny SDS-PAGE.
- możesz analizować swoje białka w czasie rzeczywistym za pomocą CGE.
- sprzęt CGE może być używany wielokrotnie, bez konieczności robienia niekończących się żeli.
- wreszcie, większość procesu jest automatyczna. Po dodaniu próbki gotowe! Oznacza to, że nie musisz nadzorować procesu, tak jak robisz żel lub doprowadzić go do specjalnego sprzętu wykrywającego, gdy tylko żel zostanie uruchomiony.
dlaczego nie należy używać CGE
cóż, prawdę mówiąc mimo że CGE istnieje w obecnej formie od ponad dekady i dokonano wielu postępów technicznych, CGE nadal cierpi na problemy z odtwarzalnością. Innym problemem jest to, że separacje CGE są wykonywane szeregowo. Oznacza to, że w CGE nie można wygodnie porównywać pasów ruchu. Wreszcie, jeśli chodzi o żele 2D, CGE po prostu nie może konkurować z tradycyjną separacją 2D.
podsumowując, podczas gdy niektórzy badacze dumnie wykrzykują zastosowania technologii CGE, nadal istnieje wiele problemów z nią. Ale nie odrzucaj jeszcze CGE! Najnowszym impulsem w tej dziedzinie jest microchip CGE, który pokazuje wiele obiecujących dla szybkiej analizy białek. Więc następnym razem, gdy pomyślisz o separacji białek, nie zapomnij o CGE.
próbowałeś CGE? Jak ci się podoba w porównaniu do SDS-PAGE?