bandowanie i malowanie chromosomów
preparaty chromosomów szpiku kostnego w 107 przypadkach z chorobami szpikowymi były analizowane przez banding G w celu oceny wielkości delecji długiego ramienia chromosomu 20. Jak wcześniej opisano(Nacheva et al., 1995b), zidentyfikowano dwie kategorie delecji 20Q – Duże delecje (59 przypadków), powodujące utratę obu ciemnych pasm Giemsa z 20q (rysunek 1a, Góra) oraz małe delecje (48 przypadków), w których pozostaje jeden ciemny pasm Giemsa (rysunek 1a, dół). Następnie skupiliśmy się na tej drugiej grupie pacjentów (podsumowanie w tabeli 1).
Analiza delecji 20Q przez G-banding, malowanie chromosomów i sondy specyficzne dla locus. (A) G banded partial kariotype of normal (left) and deleated (right) chromosome 20 homologes showing a large delesion (top pair) and a small delesion (bottom pair) of the long arm. b) komórki metafazy szpiku kostnego hybrydyzowane z chromosomem 15 (czerwony) i chromosomem 20 (Zielony), wykazujące, że chromosom markerowy (strzałka) zidentyfikowany przez banding G jako del(20) (q11) w rzeczywistości pochodzi z chromosomu 15. c) komórka metafazy szpiku kostnego hybrydyzowana z farbą chromosomu 20 (czerwona) wykazująca obecność tajemniczej translokacji obejmującej chromosom 20 (strzałka), który został zidentyfikowany jako del (20Q) przez G banding. d) komórka metafazy szpiku kostnego od pacjenta z del (20)(q11.2q13.2) hybrydyzowana z farbą chromosomową 20 wykazującą hybrydyzację tylko z obydwoma homologami chromosomu 20. (e) częściowa komórka metafazy szpiku kostnego od pacjenta z MDS db122 hybrydyzowana z sondą centromeryczną chromosomu 20 (czerwona) i PAC dJ620E11 (Zielona) wykazująca hybrydyzację PAC dJ620E11 zarówno z normalnymi, jak i usuniętymi homologami chromosomu 20 (strzałka). F) częściowa komórka metafazy szpiku kostnego od pacjenta DB122 hybrydyzowana z sondą centromeryczną chromosomu 20 (czerwona) i PAC dJ661I20 (Zielona) wykazująca brak sygnału Zielonego na del (20) (q11.2q13.1) (Strzałka). G) częściowa komórka metafazy szpiku kostnego pacjenta z MDS db214 hybrydyzowana z sondą centromeryczną chromosomu 20 (czerwona) i PAC dJ242A14 (Zielona). Zwróć uwagę na brak zielonego sygnału na del (20) (q11.2q13. 1) (Strzałka). (h) częściowa komórka metafazy szpiku kostnego od pacjenta z MDS db214 hybrydyzowana z sondą centromeryczną chromosomu 20 (czerwona) i PAC dJ196H17 (Zielona) wykazująca obecność czerwonych i zielonych sygnałów zarówno w prawidłowych, jak i usuniętych (strzałka) homologach chromosomu 20
analizę ryb przy użyciu farby chromosomowej 20 przeprowadzono na 48 próbkach z małą delecją 20Q. W sześciu przypadkach „usunięcie 20q” okazało się być spowodowane tajemniczymi przearanżowaniami. W jednym przypadku jednoczesne zastosowanie Farb dla chromosomów 15 i 20 zidentyfikowało marker pochodzący z chromosomu 15, ale dwa normalne homologi chromosomu 20 (Fig. 1B). W pozostałych pięciu przypadkach malowanie chromosomów wykazało obecność niezrównoważonej translokacji z powtarzającym się punktem przerwania w 20q11. 2 i zmiennymi partnerami chromosomowymi (Fig. 1C). We wszystkich pięciu przypadkach marker der(20) był jedynym produktem translokacji zachowanym w genomie. Ponadto, mapowanie ryb wykazało, że punkt przerwania na chromosomie 20 wystąpił w regionie bliższym D20S107 i potwierdził utratę pozostałej części długiego ramienia chromosomu 20 (Dane Nie pokazane). Wyniki te zostaną szczegółowo przedstawione w innym miejscu.
w pozostałych 42 przypadkach malowanie chromosomów było zgodne z małą delecją śródmiąższową 20Q (Fig.1D). Większość (33 przypadki) miała delecję 20Q jako jedyną nieprawidłowość kariotypową. W pozostałych dziewięciu przypadkach delecji 20q towarzyszyły różne dodatkowe aberracje chromosomalne (Tabela 1). Wszystkie 42 przypadki z małą delecją 20Q poddano dalszemu mapowaniu ryb za pomocą sond specyficznych dla locus.
analiza mapowania delecji
42 pacjentów z małymi delecjami 20Q analizowano metodą FISH przy użyciu centromerycznego PAC (CEP20), PAC hybrydyzującego do dystalnego regionu 20Q (LSI 20Q13) i PAC hybrydyzującego w obrębie CDR (LSI D20S108). U każdego pacjenta zaobserwowano sygnały zarówno z LSI 20Q13, jak i CEP20, ale nie z LSI D20S108 na usuniętym chromosomie 20, potwierdzające obecność delecji śródmiąższowej (podsumowano na fig. 3). Metafazy każdego pacjenta hybrydyzowano z mapowaniem PACs na granicach znanych CDRs MPD i MDS/AML-D20S107, który leży na proksymalnej granicy CDRs i D20S176, który leży telomerycznie na dystalnej granicy CDRs (Bench et al., 1998a; Wang et al., 1998).
podsumowanie danych mapowania. Na rysunku przedstawiono wyniki Fish i mikrosatelitowego PCR, które umożliwiają wyznaczenie nowych CDR MDS / AML i MPD. Pacjenci byli analizowani przez ryby za pomocą sond specyficznych dla locus, z wyjątkiem pacjenta RB42, dla którego wykonano mikrosatelitową PCR. Mikrosatelitowy PCR był wcześniej wykonywany u pacjentów MH40 i JH41 (Bench i wsp ., 1998a). Markery o. i odpowiadające im PACs są pokazane po lewej stronie. Wskazana jest odległość między znacznikami w megabasepairs lub centiMorgans. Znaczniki w nawiasach są oddzielone mniej niż 0,1 Mb. Dystalna granica MPD CDR została wcześniej zgłoszona (Wang et al., 1998). CDR MDS / AML jest otoczony przez PACs dJ620E11 i dJ196H17. MPD CDR jest flankowany przez DS20S108 i D20S481. Pacjent DB214 wykazał również zachowanie PACs dJ149D20 (D20S481), dJ81O8 (D20S454), dJ207N8 (stSG34079) i dJ734B23 (WI-4255) (dane nie są wyświetlane)
u 37 pacjentów (25 z MDS lub AML, 12 z MPD) obie sondy nie wytworzyły sygnału na usuniętym chromosomie 20, wykazując obecność rozległych delecji, które nie pomogłyby udoskonalić CDR. Takie próbki nie były dalej badane. Jednak u czterech pacjentów z MDS (DB53, MH40, DB122 i DB214) i jednej z MPD (JH41) jedna z dwóch sond dała sygnał na usuniętym chromosomie 20 i próbki te poddano bardziej szczegółowej analizie.
oprócz 42 pacjentów z małymi delecjami 20Q, które analizowano za pomocą sond specyficznych dla locus, kolejnych sześciu pacjentów z delecją 20Q (czterech z MDS, dwóch z MPD), u których metafazy szpiku kostnego nie były dostępne, analizowano za pomocą mikrosatelitowego PCR. DNA z oczyszczonych granulocytów i komórek T analizowano przy użyciu dużego panelu markerów polimorficznych, które obejmowały CDR MPD i MDS/AML (Tabela 2). U wszystkich czterech pacjentów z MDS delecje wykraczały poza granice opublikowanego CDR. Jednak u jednego z dwóch pacjentów z MPD (RB42) centromeryczna granica delecji znacznie zmniejszyła CDR MPD (rycina 2, Tabela 2).
Mikrosatelitarne wyniki PCR, które określają bliższą granicę nowego wspólnego usuniętego regionu MPD. Mikrosatelitowy PCR wykonano za pomocą wskazanych markerów na DNA wyekstrahowanym z oczyszczonych granulocytów (G) i komórek T (T) od pacjenta rb42. Groty strzał wskazują górny pas każdego allelu. Otwarte groty strzałek wskazują na allel, który jest deletowany w granulocytach. Dwa allele są zatrzymywane w D20S108, podczas gdy jeden allel jest tracony w D20S858 i D20S46
redukcja często usuniętego obszaru u pacjentów z MDS/AML
wstępna analiza FISH wykazała czterech pacjentów z MDS z delecjami, które naruszały CDR MDS / AML. W każdym przypadku delecja 20q była obecna we wszystkich badanych metafazach. W trzech przypadkach (DB53, DB214 i MH40) delecja 20Q była obecna jako jedyna nieprawidłowość. U pacjenta DB122 delecja 20Q była pierwotną, jedyną nieprawidłowością, w której oprócz delecji 20Q występowały również dwie podklony zawierające trisomię 21 lub trisomię 8 i trisomię 21. Te cztery przypadki zostały zbadane przy użyciu dodatkowych sond specyficznych dla locus w celu ustalenia granic delecji.
bliższa granica CDR MDS/AML została oczyszczona przez pacjentów DB53, MH40 i DB122. Bliższa granica delecji w DB53 leżała między D20S107 a WI-11538 (Rysunek 3), w odległości około 400 kb. Dla pacjenta MH40 PAC zawierający WI-11538 (dJ357E14) konsekwentnie powodował zmniejszenie sygnału zgodne z obecnością punktu przerwania delecji proksymalnej w tym PAC(ryc. 3). Ponadto bliższa granica delecji u pacjenta DB122 leżała między sts-R52161 a stSG25449 (Fig. 1e, f), w odległości mniejszej niż 200 kb (Fig. 3 i 4). Stanowi to duże udoskonalenie bliższej granicy MDS / AML CDR.
podsumowanie klonu bakteryjnego contig. Rysunek ten ilustruje reprezentatywną próbkę klonów PAC i BAC, które tworzą contig. Te klony, które są częścią ścieżki kafelkowej używanej do sekwencjonowania, są pokazane w normalnym typie. CDR MDS / AML obejmuje obszar 2,6 Mb między dJ620E11 i dJ196H17, podczas gdy MPD CDR rozciąga się od D20S108 do D20S481, odległość 2,7 Mb. Obszar nakładania się dwóch CDR ma rozmiar 1,7 Mb. Nie wszystkie PACs, BACs i markery są wskazane. Pokazana jest część pełnej mapy pomiędzy dJ128O17 i dJ272H18. Pełną mapę można obejrzeć pod adresem http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name=Chr_20ctg125&class = Map
pacjent DB214 pozwolił na znaczne udoskonalenie dystalnej granicy MDS / AML CDR. Dalsza granica tego usunięcia leżała między WI-12515 a stSG40369 (rysunek 1g,h), W odległości mniejszej niż 100 kb (rysunki 3 i 4).
te dane znacznie zmniejszają CDR MDS / AML do obszaru leżącego między PAC dJ620E11, który zawiera sts-R52161, A PAC dJ196H17, który zawiera WI-12515 (Fig.3 i 4). Klon bakteryjny contig przedstawiony poniżej pokazuje fizyczną wielkość tego regionu na około 2,6 Mb.
zmniejszenie wspólnego delecji u pacjentów z MPD
u pacjentów z JH41 (diagnoza PV), proksymalna granica delecji została wcześniej określona za pomocą mikrosatelitowego PCR, aby leżała między D20S438 i D20S107 (Bench i wsp., 1998a). PAC dJ155H19, który zawiera D20S107 (ryc. 4), konsekwentnie powodował zmniejszenie sygnału zgodne z obecnością punktu przerwania delecji proksymalnej w tym PAC (ryc. 3).
granulocyty i limfocyty T od dwóch dodatkowych pacjentów badano za pomocą mikrosatelitowego PCR (Tabela 2). Jeden pacjent z PV (RB42) wykazał zachowanie heterozygotyczności w D20S108, ale utratę w d20s858(fig. 2, Tabela 2). Bliższy punkt przerwania delecji u tego pacjenta znajdował się pomiędzy D20S108 a D20S858, w odległości mniejszej niż 200 kb (ryc. 3 i 4).
te dane znacznie zmniejszają MPD CDR, który jest teraz flankowany przez D20S108 (to badanie) i D20s481 (Wang et al., 1998). Szacowana wielkość fizyczna tego regionu wynosi 2.7 Mb, wykorzystując dane z klonu bakteryjnego contig przedstawionego poniżej. Region nakładania się nowych CDR MDS / AML i MPD zdefiniował połączony „mieloidalny” CDR wynoszący 1,7 Mb (Rysunek 3).
klon bakterii contig obejmujący wspólne usunięte regiony MPD i MDS/AML
wcześniej skonstruowaliśmy 11 Mb YAC contig tego regionu chromosomu 20 (Bench et al., 1998a). Aby stworzyć bardziej szczegółową mapę fizyczną, stworzyliśmy teraz sąsiadującą mapę opartą na PAC i BAC. Klony PAC i BAC zidentyfikowano przez hybrydyzację STSs do bibliotek genomowych (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et al., 1998). Klony nakładały się za pomocą odcisków palców ograniczeń (Gregory et al., 1997) oraz mapowanie zawartości STS, pozwalające na grupowanie klonów w stygi. Aby pomostować contigs, nowe STSs i sondy DNA, opracowane z końców contigs, zostały wykorzystane do dalszego badania bibliotek. Nowe PACs i BACs zostały następnie połączone w ciągi w ten sam sposób, dopóki nie powstała Mapa ciągła.
klon bakteryjny contig zawiera łącznie 456 klonów bakteryjnych, z których 376 to PACs, a 80 to BACs. Rozciąga się od D20S607 do SEMG1 i zawiera 202 markery DNA, z których 185 to stss, a 17 to sondy DNA. Wielkość contiga opierała się na średniej 3,5 kb na Pasmo HindIII (P Deloukas (2000), wyniki niepublikowane). Szacowany rozmiar contig został obliczony jako 5 Mb przez pomnożenie całkowitej liczby różnych pasm odcisków palców w contig przez 3,5. Reprezentacja mapy ilustrująca minimalną ścieżkę kafelkowania i PACs, które były używane do eksperymentów z rybami, została pokazana na fig. 4. Pełna wersja mapy znajduje się pod adresem http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name= Chr_-20ctg125&class=Map.
Identyfikacja wyrażonych sekwencji
czterdzieści trzy unikalne Esty znajdowały się między D20S607 i stsg34035 włącznie. Spośród nich, 34 Est zostały zmapowane przez hybrydyzację do „poligrid” PACs i BACs lub przez Kolonię PCR kolonii bakteryjnych zawierających PACs lub BACs (Fig.4). Dodatkowe dziewięć ESTs, wcześniej mapowane w tym regionie chromosomu 20 (Bench et al., 1998a; Deloukas et al., 1998) zostały umieszczone na contig przez wyrównanie sekwencji EST z dostępną sekwencją genomową PAC lub BAC.
w celu zidentyfikowania domniemanych sekwencji novel expressed, 23 klony PAC z minimalnej ścieżki kafelkowania zostały częściowo lub całkowicie zsekwencjonowane. Sekwencję genomową tych klonów analizowano za pomocą programu NIX (Williams et al., 1998), który umożliwia jednoczesną obserwację wielu narzędzi identyfikacji genów, w tym Graala, GENSCANA i BLAST. Zidentyfikowano osiem wcześniej niezmapowanych Est i genów (Tabela 3). Sześć z nich leży w MPD CDR, a siedem w MDS CDR. Uzyskano dowody na to, że sześć z tych ośmiu domniemanych sekwencji ekspresji reprezentowało bona fide transkrybowane geny, zamiast przetwarzanych pseudogenów lub genomowych zanieczyszczeń DNA w bazie danych EST. KCNS1 jest genem kodującym podjednostkę kanału bramkowanego napięciem potasowym. ESTs AA053206 / Aa053121 zostały następnie uznane za pochodzące z genu SGK2 (Kobayashi et al., 1999). Wyrównanie sekwencji cDNA do sekwencji genomowej wykazało strukturę egzonu / intronu dla trzech z pozostałych sześciu Estów (AI312497, AA568401 i aa910031) z sekwencją konsensusu miejsca splicingu obecną na wszystkich granicach egzonu/intronu. We wszystkich trzech przypadkach obecność każdego eksonu została potwierdzona przez programy przewidywania eksonów, takie jak Graal. Istnienie egzonu zostało również przepowiedziane przez Graala, GENSCANA i Genefinder w regionie PAC dJ1108D11, który wyrównał się do EST AA993161, co sugeruje, że ten EST również reprezentował transkrypcyjny Gen.
analiza sekwencji PACs z poziomu minimalnej ścieżki kafelkowania pozwoliła również ustalić strukturę genomową znanych i nowych genów w tym regionie. Dostosowanie RPTPrho cDNA do PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 i dJ269M15 wykazało, że gen ten obejmuje co najmniej 1,2 Mb. PAC dJ138B7 zawierał dwa geny (h-l (3)mbt i SGK2) oraz 5′ część genu odpowiadającą SHGC-36858. W szczególności Gen H-l (3) MBT zawiera 20 eksonów z dwoma alternatywnymi egzonami końcowymi. Analiza dJ644L1 wykazała, że ludzki gen MafB składa się z pojedynczego eksonu. Analiza skończonej sekwencji została również przeprowadzona przez Centrum Sangera (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) i można ją obejrzeć pod adresem http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&class=GenomeSequence.
dane te wskazują na obecność sześciu genów i kolejnych 14 niespójnych estymacji w nowym CDR MDS / AML oraz łącznie 14 genów z 23 unikalnymi Estymacjami w nowym CDR MPD (Tabela 3). W regionie nakładania się dwóch CDR występuje sześć genów i 10 unikalnych Estów.
profilowanie ekspresji
uważa się, że zaburzenia mieloproliferacyjne, zespoły mielodysplastyczne i ostra białaczka szpikowa wynikają z transformacji komórki multipotentnej w obrębie przedziału hematopoetycznych komórek macierzystych (Bonnet i Dick, 1997; Kralovics i Prchal, 1998). Co więcej, wcześniej wykazano, że delecja 20q może powstać w komórce progenitorowej zdolnej do powstania zarówno komórek mieloidalnych, jak i limfocytów B (White i in., 1994). Rozważania te sugerują, że gen lub geny na chromosomie 20Q, które są inaktywowane w tych chorobach, prawdopodobnie ulegają ekspresji w normalnych komórkach macierzystych układu krwiotwórczego. W związku z tym ustaliliśmy, które z transkrybowanych sekwencji zostały poddane ekspresji w szpiku kostnym i oczyszczonych komórkach CD34 dodatnich.
amplifikację odwrotnej transkrypcji PCR (RT–PCR) przeprowadzono za pomocą starterów reprezentujących każdą z 51 transkrybowanych sekwencji (Fig. 5). Dla każdej transkrybowanej sekwencji przeprowadzono co najmniej dwie niezależne amplifikacje RT-PCR. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano startery odpowiadające EST (WI-7685) pochodzące z 3′ UTR genu CD34 (Fig.5). W przypadku gdy dwie lub więcej est odpowiadały tej samej transkrybowanej sekwencji, taki sam wynik uzyskano dla każdego EST.
Analiza ekspresji genów w obrębie contig. Dane RT-PCR przedstawiono dla trzech markerów EST w obrębie contig (AI312497, stSG3032, aa716165) i dla WI-7685, EST pochodzącego z 3′ UTR genu CD34. RT-PCR wykonywano z wykorzystaniem RNA pochodzącego z komórek szpiku kostnego dwóch zdrowych osobników (BM) lub z komórek CD34 dodatnich kolejnego zdrowego osobnika (CD34+). Podane są rozmiary produktów PCR. M, ΦX174 / haeiii digest; +RT, odwrotna transkrypcja wykonywana w obecności odwrotnej transkryptazy; −RT, pozorna odwrotna transkrypcja wykonywana bez odwrotnej transkryptazy; −ve, PCR ustawione bez DNA; + ve, PCR ustawione przy użyciu genomowego DNA
dane przedstawiono na rysunku 5, tabele 3 i 4. Z 37 wyrażonych sekwencji w MPD CDR, 20 uległo ekspresji w jednojądrzastych komórkach szpiku kostnego. 16 z nich uległo również ekspresji w komórkach CD34 dodatnich. W ramach CDR MDS/AML 11 z 20 transkrybowanych sekwencji uległo ekspresji w komórkach jednojądrzastych szpiku kostnego. Osiem z nich uległo ekspresji również w komórkach CD34 dodatnich. Spośród 16 transkrybowanych sekwencji, które leżą w obszarze nakładania się MPD i cdr MDS/AML, osiem ulegało ekspresji w komórkach szpiku kostnego, z czego pięć ulegało ekspresji również w komórkach CD34 dodatnich. Te pięć transkrybowanych sekwencji reprezentuje zatem geny pierwszorzędowe, ponieważ leżą one zarówno w obrębie CDR MPD, jak i MDS/AML i ulegają ekspresji w obrębie przedziału komórek macierzystych układu krwiotwórczego. Należą do nich dwa nieznane geny odpowiadające ESTs SHGC-36858 i WI-12515, a także trzy geny, SFRS6, H-l(3)mbt i MYBL2.