Clemizol i modulatory sygnalizacji serotoninowej tłumią napady padaczkowe w zespole Draveta

Streszczenie

zespół Draveta jest katastrofalną epilepsją dziecięcą z napadami padaczkowymi o wczesnym początku, opóźnionym rozwojem mowy i motoryki, zaburzeniami snu, zachowaniem przypominającym lęk, znacznym deficytem funkcji poznawczych i zwiększonym ryzykiem zgonu. Jest to spowodowane głównie przez de novo mutacje genu SCN1A kodującego neuronalny kanał sodowy aktywowany napięciem. Danio pręgowany z mutacją w homologie SCN1A rekapituluje spontaniczną aktywność napadową i naśladuje drgawkowe ruchy behawioralne obserwowane w zespole Draveta. Tutaj pokazujemy, że fenotypowe badanie bibliotek leków u mutantów scn1 danio pręgowanego szybko i skutecznie identyfikuje nowe leki. Wykazujemy, że klemizol wiąże się z receptorami serotoninowymi, a jego działanie przeciwpadaczkowe może być naśladowane przez leki działające na szlaki sygnałowe serotoniny, np. trazodon i lorkaseryna. Zbiegło się to z odkryciami danio pręgowanego, leczono pięciu pacjentów z zespołem Dravet z klinicznie zatwierdzonym agonistą receptora serotoninowego (lorkaseryna, Belviq®) i zaobserwowaliśmy obiecujące wyniki w zakresie zmniejszenia częstotliwości napadów i/lub ciężkości. Nasze odkrycia pokazują szybką drogę od przedklinicznych odkryć danio pręgowanego, poprzez identyfikację celu, do potencjalnych klinicznych metod leczenia zespołu Draveta.

wprowadzenie

epilepsje dziecięce klasyfikowane jako katastrofalne są często związane z mutacją genetyczną. Wśród nich zespół Draveta był związany z ponad 600 mutacjami de novo w jednym genie, SCN1A (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). Dzieci cierpiące na zespół Draveta wykazują napady padaczkowe już w 6 miesiącu życia, opóźniony rozwój językowy i ruchowy, zaburzenia snu, zachowania podobne do lęku i poważny deficyt poznawczy (Dravet, 2011). Zgłaszano również objawy zaburzeń ze spektrum autyzmu (Li i wsp., 2011), a ryzyko nagłej niewyjaśnionej śmierci z padaczką (SUDEP) w tej populacji szacuje się na 15-krotnie wyższe niż w przypadku innych epilepsji dziecięcych (Kearney, 2013). Dostępne leki przeciwpadaczkowe nie zapewniają odpowiedniej kontroli napadów, a resekcyjne procedury neurochirurgiczne nie są zwykle dostępne. Nowe metody leczenia zespołu Dravet pozostają ważną niezaspokojoną potrzebą, pomimo pewnego poziomu skuteczności w ograniczonych badaniach klinicznych dotyczących kanabidiolu (Epidiolex®) i styrypentolu (Diacomit®), które mogą być związane odpowiednio z problemami bezpieczeństwa poznawczego lub apetytu (Perez et al., 1999; Chiron i in., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky et al., 2016).

mutacje w SCN1A, genie kodującym tworzącą pory podjednostkę α kanału sodowego bramkowanego napięciem (Nav1.1), zidentyfikowano u prawie 85% pacjentów z zespołem Draveta (Dravet, 2011). Kanały Nav1. 1 przyczyniają się do szybkiej depolaryzacji błon neuronalnych obserwowanych podczas generowania potencjału czynnościowego (Hodgkin et al., 1952). Myszy heterozygotyczne z powodu mutacji utraty funkcji w Nav1. 1 rozwijają spontaniczne i wrażliwe na temperaturę napady we wczesnym okresie życia i umierają przedwcześnie około 25 dnia poporodowego (Yu et al., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Ostre badania elektrofizjologiczne u tych i pokrewnych myszy z niedoborem Scn1a sugerują zmniejszenie gęstości prądu sodowego i związane z tym zmniejszenie aktywności wypalania dla subpopulacji neuronów hamujących ekspresję GABA (ale nie pobudzających głównych komórek), których kulminacją jest zmniejszone hamowanie synaptyczne i nadpobudliwość sieci (Yu i wsp., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Ta hipoteza „interneuronopatii” jest zgodna z innymi formami katastrofalnych epilepsji dziecięcych i została potwierdzona u myszy, u których Scn1a został wybiórczo usunięty z subpopulacji interneuronu wyrażającego parwalbuminę lub somatostatynę(Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). U tych myszy odnotowano również zachowania autystyczne (Han i wsp ., 2012). Co ciekawe, wstępne badania nad ludzkimi neuronami pobudzającymi i hamującymi pochodzące z wykorzystaniem indukowanej technologii pluripotencjalnych komórek macierzystych od dwóch pacjentów z zespołem Dravet zgłaszały deficyty prądu sodowego aktywowanego napięciem dla obu typów komórek, sugerując homeostatyczną kompensację wczesnej utraty funkcji krytycznego kanału sodowego specyficznego dla mózgu lub dodatkowe mechanizmy przyczyniające się do fenotypu padaczkowego obserwowanego u tych pacjentów (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013).

chociaż myszy i ludzkie indukowane pluripotencjalne neurony pochodzące z komórek macierzystych przyczyniają się do naszego zrozumienia podstawowej patofizjologii zespołu Draveta, systemy te nie są dobrze przystosowane do szybkiej identyfikacji nowych terapii ze względu na zmienność tych modeli i odtwarzalność pomiarów ilościowych. Ponieważ danio pręgowane są idealnym systemem modelowym kręgowców do wykonywania ekranów opartych na fenotypie małocząsteczkowym (MacRae et al., 2015) i jesteśmy podatni na manipulacje genetyczne, skupiliśmy nasze wysiłki na mutancie kanału sodowego danio pręgowanego. Mutanty danio pręgowanego zawierające mutację missense w ortologu SCN1A, scn1Lab, zidentyfikowano na ekranie mutagenezy (Schoonheim et al., 2010). Ze względu na duplikację całego genomu przodków, mutanty scn1lab danio pręgowanego są haploinsufficient dla Nav1. 1 i analogiczne do myszy Scn1a+/− lub pacjentów z zespołem Draveta. U zmutowanych larw już po 3 dniach od zapłodnienia (DPF) obserwuje się napadowe zachowania i epizody krótkiego wyładowania międzypłytkowego i długotrwałego polyspike ictal-like electrographic discharge, z progresją do silniejszych fenotypów napadowych między 4 A 7 dpf (Baraban i in., 2013; Hong et al., 2016). Zmutowane larwy umierają przedwcześnie, wykazują deficyty metaboliczne (Kumar et al., 2016) i są odporne na wiele leków przeciwpadaczkowych (AED) (Dinday et al., 2015). Podobnie jak w leczeniu klinicznym zespołu Dravet, pewne osłabienie aktywności napadowej można uzyskać za pomocą walproinianu, benzodiazepin, bromków, styrypentolu, a także diety ketogennej (Baraban i in., 2013). Wykorzystując zmutowane larwy ryb danio pręgowanego scn1lab i dwustopniową strategię przesiewową opartą na fenotypie, przebadaliśmy obecnie ponad 2300 związków. Klemizol, antagonista receptora histaminowego pierwszej generacji (H1), został zidentyfikowany jako silny inhibitor aktywności napadów behawioralnych i elektrograficznych (Baraban i in., 2013). Leki przeciwhistaminowe są jednak przeciwwskazane w populacji padaczki dziecięcej (Miyata i wsp ., 2011), a Analog receptora H1 u danio pręgowanego wykazuje mniej niż 50% podobieństwa do człowieka (Peitsaro et al., 2007). Używamy tu przedklinicznych modeli danio pręgowanego, aby wykazać, że klemizol, ale nie leki przeciwhistaminowe, działają przeciwpadaczkowo. Na podstawie wiązania ligandów i dodatkowych ukierunkowanych badań przesiewowych u zmutowanych danio pręgowanego scn1 zidentyfikowaliśmy kilka modulatorów serotoniny (5-HT) jako skutecznych w tłumieniu napadów, w tym dwa (trazodon i lorkaseryna) związki zatwierdzone przez FDA. Lorkaseryna (Belviq®) została przepisana w ramach programu współczucia dzieciom z zespołem Dravet i spowodowała zmniejszenie aktywności napadów u niektórych pacjentów. Proponujemy, aby modulacja sygnalizacji 5-HT stanowiła nowatorską interwencję terapeutyczną dla tej katastrofalnej epilepsji dziecięcej.

materiały i metody

konserwacja danio pręgowanego

monitorowanie napadów

przy 5 dpf poszczególne larwy danio pręgowanego umieszczano w pojedynczej studzience z przezroczystego 96-studzienkowego mikropłytka zawierającego podłoże zarodkowe. Larwy zostały wybrane losowo, ponieważ określenie płci nie jest możliwe na tym etapie. Mikropłyty zostały umieszczone wewnątrz urządzenia śledzenia ruchu DanioVision i zaaklimatyzowane przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wykresy ruchowe uzyskano dla każdej studni w czasie nagrywania 10 min przy użyciu systemu DanioVision z oprogramowaniem EthoVision XT (DanioVision, Noldus Information Technology); ustawienia wykrywania progowego w celu identyfikacji obiektów ciemniejszych niż tło zostały zoptymalizowane dla każdego eksperymentu. Punktowanie napadów przeprowadzono stosując następującą trójstopniową skalę ustaloną dla napadów indukowanych pentylenetetrazolem(Baraban i in., 2005): etap 0, Brak lub bardzo mała aktywność pływania; etap I, zwiększone, krótkie ataki aktywności pływania; Etap II, szybkie „podobne do wiru” krążące zachowanie pływania; i Etap III, napadowe drgawki podobne do klonu całego ciała i krótka utrata postawy. Ryby typu dzikiego są zwykle punktowane na etapie 0 lub I. Wykresy analizowano pod kątem przebytej odległości (w milimetrach) i średniej prędkości (w milimetrach na sekundę). Jak informowaliśmy wcześniej (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), zmiany prędkości były najbardziej czułym testem zachowania napadowego.

w badaniach elektrofizjologicznych larwy danio pręgowanego zostały na krótko sparaliżowane α-bungarotoksyną (1 mg / ml) i unieruchomione w 1,2% agarozie; lokalne rejestracje potencjału pola uzyskano ze struktur przedmózgowia za pomocą techniki pojedynczej elektrody, jak opisano wcześniej (Baraban et al., 2005; Hong et al., 2016). Dla każdej ryby z częstotliwością 1 kHz uzyskano sesje nagraniowe z wykorzystaniem potencjału lokalnego pola agarozowego trwające od 10 do 30 minut. System iZAP (Hong et al., 2016) był stosowany do długoterminowego nieinwazyjnego monitorowania danio pręgowanego w przypadku braku środka paraliżującego. System autonomicznie zatrzymuje kilka larw danio pręgowanego pod wieloma zintegrowanymi elektrodami powierzchniowymi w komorach mikroprzepływowych. larwy scn1Lab były stale monitorowane przez 5 godzin. potencjał pola elektrycznego był rejestrowany w sposób ciągły przy 1 kHz, z wyjątkiem przerw od 2 do 3 minut w celu zmiany mediów do obróbki złożonej i mycia. Zarejestrowane dane zostały przeanalizowane przy użyciu MATLAB do Wykresów potencjału terenowego i analizy częstotliwości.

skrining Biblioteki związków

związki do skriningu leków zakupiono od Selleck Chemicals i dostarczono jako 10 mM roztwory DMSO. Do badań przesiewowych wykorzystano bibliotekę Ion Channel Ligand firmy Selleck (Katalog #L2700), GPCR Compound Library (Katalog #L2200) oraz dostosowaną bibliotekę modulującą 5-HT. Związki biblioteczne wymieniono w dodatkowej Tabeli 1. We wszystkich ekranach biblioteki leków związki były kodowane i eksperymenty były przeprowadzane przez badaczy, którzy byli ślepi na naturę związku. Wyjściowe zapisy zachowań ruchowych uzyskano z mutantów w zarodkach, jak opisano powyżej; następnie uzyskano drugi wykres ruchowy po zmianie roztworu w badany związek i okresie równowagi wynoszącym 20 minut. Związki do badań dotyczących ruchu rozpuszczono w pożywce zarodka i testowano w stężeniu 250 µM, przy końcowym stężeniu DMSO wynoszącym 2,5%.

kryteria uzyskania pozytywnego trafienia były następujące: (i) zmniejszenie średniej prędkości o ≥40%; oraz (ii) zmniejszenie do poziomu 0 LUB i napadu drgawkowego na wykresie poruszania się co najmniej 50% badanych ryb. Każdy badany związek sklasyfikowany jako „pozytywne trafienie” w teście poruszania się oceniano pod kątem toksyczności przez bezpośrednią wizualizację za pomocą stereomikroskopu po 90 minutowej ekspozycji na lek. Toksyczność (lub śmiertelność) zdefiniowano jako brak widocznego bicia serca lub ruchu w odpowiedzi na zewnętrzną stymulację u co najmniej 50% badanych ryb. Nadpobudliwość zdefiniowano jako związek powodujący ≥40% wzrost prędkości pływania i (lub) aktywność napadową w stadium III u co najmniej 50% badanych ryb. Dodatnie trafienia zidentyfikowane w pierwotnym badaniu przesiewowym zostały potwierdzone przy użyciu metody przesiewowej w drugim teście z niezależnym sprzęgłem danio pręgowanego. Związki zostały następnie zakupione oddzielnie od Sigma-Aldrich i przetestowane przy użyciu metody przesiewowej locomotion po raz trzeci na niezależnym sprzęgle danio pręgowanego. Leki, które zmniejszyły średnią prędkość pływania powyżej progu i były nietoksyczne w trzech niezależnych testach lokomocji, były dalej analizowane za pomocą testu elektrofizjologicznego. W badaniach elektrofizjologicznych leki najpierw potwierdzono w stężeniu 250 µM za pomocą testu lokomocji, a następnie tę samą danio pręgowaną oceniano za pomocą lokalnego zapisu potencjału pola. Wszystkie badania przesiewowe przeprowadzono przy użyciu zakodowanych związków i przeanalizowano przez badaczy zaślepionych na tożsamość związku.

analiza filogenetyczna

analiza filogenetyczna sekwencji białka Htr2 ludzkiego i danio pręgowanego przeprowadzono za pomocą oprogramowania PhyML w ramach podobnych do SH parametrów testu prawdopodobieństwa (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper et al., 2008). Sekwencje białkowe pochodzą z Ensembl Human HTR2A (ENST00000542664), HTR2B (ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198) i danio pręgowanego htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (enst00000258400), ENSDART00000104569), HTR2CL1 (ENSDART00000024191).

ilościowa analiza ekspresji mRNA w czasie rzeczywistym

poziomy ekspresji genów htr2 danio pręgowanego zbadano przy użyciu RNA pobranego z 25 głów lub ogonów z 5 homozygotycznych larw mutantów DPF typu dzikiego lub scn1Lab i rozcięto mózgi z pojedynczych dorosłych samców danio pręgowanego typu dzikiego. Całkowity RNA ekstrahowano za pomocą odczynnika TRIzol® (Invitrogen), zgodnie z protokołem producenta i traktowano Dnazą i (Invitrogen). Oczyszczony mRNA poddano retrotranskrypcji do cDNA za pomocą systemu syntezy pierwszej nici SuperScript®III (Invitrogen)z mieszaniną oligo(dT) 20. Poziomy ekspresji genów htr2 danio pręgowanego i eukariotycznego współczynnika wydłużenia translacji 1 alfa 1, podobnego do 1 (eef1a1l1) określono za pomocą maszyny PCR w czasie rzeczywistym StepOne™ (Applied Biosystems). Reakcje przeprowadzono w objętości 20 µl na 96-studzienkowych płytkach przy użyciu SYBR ® Green Master Mix (Applied Biosystems) z podkładem 250 nM i 3 µl cDNA. Sekwencje oligonukleotydowe są wymienione w dodatkowej Tabeli 2. Analizowano dane z trzech niezależnych eksperymentów. Dane wyrażono jako wartości Ct i wykorzystano do określenia wartości ΔCt.

badania na ludziach

Po udanej identyfikacji związków w naszym modelu danio pręgowanego i uwzględnieniu farmakokinetyki dzieciom przepisano Belviq® (lorkaserin) zgodnie z protokołem współczucia w Children ’ s Hospital Colorado (IND 125307). Dzieci zakwalifikowane do stosowania produktu Belviq®, jeśli miały mutację SCN1A lub kliniczną diagnozę zespołu Dravet, i zawiodły co najmniej dwa leki, w tym styrypentol, w niektórych przypadkach, z wyłączeniem blokerów kanału sodowego. U dzieci konieczne było wykonanie elektrokardiogramu i echokardiogramu przed rozpoczęciem leczenia oraz co 6 miesięcy podczas stosowania produktu. Ponadto byli zobowiązani do przeprowadzania wizyt kontrolnych co 3 miesiące w celu zapewnienia odpowiedniego wzrostu, a także oceny dodatkowych skutków ubocznych. Badania laboratoryjne były wymagane co 6 miesięcy w celu uwzględnienia badań hematologicznych, czynności wątroby i czynności nerek. Dawkę produktu Belviq® rozpoczynano od dawki 2,5 mg przed snem i stopniowo zwiększano w razie potrzeby co tydzień do maksymalnej dawki 10 mg dwa razy na dobę lub 0,3 mg/kg mc. / dobę-w zależności od tego, co nastąpiło wcześniej.

uzyskano zgodę instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej na retrospektywne gromadzenie danych, w tym zrzeczenie się zgody. Pozyskano dane z retrospektywnego przeglądu elektronicznej dokumentacji medycznej w Children ’ s Hospital Colorado, w tym wiek, rodzaje napadów i częstotliwość przed i po zastosowaniu produktu Belviq®, zdarzenia niepożądane, dawka produktu Belviq® i jednoczesne stosowanie leków.

analiza statystyczna

Dane przedstawia się jako średni ± błąd standardowy średniej (SEM), o ile nie zaznaczono inaczej. Dla porównania między dwiema grupami zastosowano test t ucznia. Gdy wariancja nie miała rozkładu normalnego, zastosowano nieparametryczny Test U Manna-Whitneya. Jednokierunkowa ANOVA po wielokrotnym teście porównawczym Dunnetta do analizy przeciwko próbce kontrolnej lub parami wielokrotnych porównań między środkami Holma-Sidaka. Różnice uznane za istotne statystycznie oznaczone są gwiazdkami (*P < 0, 05; * * P < 0, 01).

wyniki

wpływ klemizolu na zachowania napadowe u danio pręgowanego

leczyliśmy larwy zmutowane scn1Lab (5 dpf) klemizolem w stężeniach między 30 a 400 µM, a następnie monitorowaliśmy wpływ na spontaniczne zachowania napadowe za pomocą automatycznego oprogramowania do śledzenia ruchu. Na podstawie 250 powtarzanych badań kontroli ruchu u nieleczonych mutantów scn1Lab, jako próg pozytywnego zahamowania napadów ustalono zmniejszenie średniej prędkości pływania ≥40% (>1, 5 × SD) w stosunku do wartości wyjściowych. Klemizol (Ros. 1A) wykazywał działanie przeciwpadaczkowe przy ekspozycji 300 i 400 µM (ekspozycja 30-min) oraz przy ekspozycji 100 µM (ekspozycja 90-min) (Fig. 1B); długotrwałe narażenie było toksyczne w wyższych stężeniach. Aby ustalić, czy klemizol może tłumić spontaniczne napady u drugiego mutanta scn1 danio pręgowanego, przebadaliśmy zmutowane larwy scn1Laa (5 dpf) w teście śledzenia ruchu. Larwy zidentyfikowane jako zachowania napadowe III stopnia (np. drgawki całego ciała, szybkie pływanie i krótka utrata postawy; rys. 1C) zostały potwierdzone jako wykazujące wyładowania elektrograficzne ze składnikami zewnętrznymi i iktalnymi w kolejnych nagraniach terenowych z przedmózgowia (Fig. 1D). Średnia prędkość pływania dla larw zidentyfikowanych jako S3 lub „domniemanych mutantów scn1Laa” danio pręgowanego była znacznie wyższa niż w przypadku kontroli rodzeństwa lub wszystkich badanych larw (Fig. 1E); mutanty zostały potwierdzone jako homozygoty scn1Laa przez post hoc PCR. Następnie przetestowaliśmy leki, które wcześniej wykazały hamowanie napadów samoistnych w zespole Draveta i mutantów scn1Lab (250 µM styrypentolu i 250 µM diazepamu), a także lamotryginę 250 µM (AED, który może nasilać napady w zespole Draveta). Zgodnie z oczekiwaniami styrypentol i diazepam, ale nie lamotrygina, znacząco tłumiły napady drgawkowe u larw zmutowanych scn1Laa; klemizol 250 µM był również skuteczny w tym teście (Fig. 1F). Łącznie badania te pokazują, że klemizol może tłumić napady padaczkowe w dwóch różnych liniach zmutowanych scn1 danio pręgowanego.

badanie mechanizmu działania klemizolu

drugorzędowe badanie przesiewowe z użyciem mutantów scn1Lab

trzeciorzędowe badania przesiewowe w celu zidentyfikowania obiecujących związków ołowiu dla kliniki

5-ekspresja receptora HT u larw danio pręgowanego

ponieważ klemizol ma znaczące powinowactwo wiązania do HTR2A i HTR2B, a zarówno trazodon, jak i lorkaseryna są modulatorami sygnałowymi 5-HT, staraliśmy się potwierdzić ekspresję tych receptorów u danio pręgowanego. Wyrównanie sekwencji białek ludzkich i receptorów HTR2 dla danio pręgowanego wykazało ewolucyjną konserwację za pomocą ortologów danio pręgowanego, przy czym Htr2aa i Htr2ab wykazują 59,3% identyczności białka z ludzkim HTR2A; oraz pojedynczy ortolog HTR2B, Htr2b wykazujący 62,0% identyczności białka. Oznaczanie poziomu ekspresji htr2 przy użyciu wyizolowanych głów lub ogonów 5 mutantów DPF typu dzikiego lub scn1lab ujawniło wzbogaconą ekspresję htr2a i htr2cl1 w głowie. Podobne wyniki uzyskano z mózgu dorosłego rybka danio pręgowanego typu dzikiego, ponieważ zmutowane larwy nie przeżywają do dorosłości(Fig. 4).

zmniejszenie częstości napadów padaczkowych u pacjentów z zespołem Draveta

zespół Draveta jest katastrofalną padaczką dziecięcą i rzadkim zaburzeniem (http://www.rarediseases.org/) z wyniszczającymi skutkami, w tym trudną do opanowania padaczką, poważnie ograniczonym rozwojem poznawczym i ryzykiem SUDEPU. Nasze dane przedkliniczne potwierdzają, że modulacja sygnalizacji 5-HT może tłumić napady związane z mutacjami utraty funkcji SCN1A. Ponieważ zidentyfikowane modulatory 5-HT są związkami zatwierdzonymi przez FDA o znanych profilach bezpieczeństwa, leczenie tymi lekami może zmienić częstotliwość napadów u dzieci z zespołem Dravet. To podejście translacyjne dotyczy rzadkich i niszczących chorób, dla których badania kliniczne na dużą skalę nie są wykonalne (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

ponieważ klemizol nie jest obecnie wytwarzany lub dostępny w postaci klinicznej, a trazodon może działać jako agonista lub antagonista receptora 5-HT, w zależności od stężenia (Maj i wsp., 1979; Marcoli et al., 1998), zdecydowaliśmy się ocenić Belviq® (lorcaserin) w ramach programu współczucia poza etykietą w małej populacji dzieci z zespołem Draveta. Wykazano, że dzieci te są odporne na co najmniej pięć zatwierdzonych leków przeciwpadaczkowych. Pięcioro dzieci (Średni wiek: 11,8 lat; zakres: 7-18 lat) heterozygotycznych z delecją w SCN1A było leczonych prospektywnie Belviq® i następnie wzdłużnie w Children ’ s Hospital Colorado (Aurora, CO). Protokół leczenia został zatwierdzony przez Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB), a rodzice pacjentów z zespołem Dravet wyrazili pisemną zgodę na udział ich dziecka. Zrewidowaliśmy retrospektywnie liczbę napadów atonicznych, mioklonicznych i uogólnionych toniczno-klonicznych (GTC), efektów ubocznych i równoczesnych AED.

charakterystykę kliniczną dzieci z zespołem Dravet leczonych produktem Belviq® podsumowano w tabeli 1. Wśród pięciu pacjentów leczonych produktem Belviq®nie odnotowano zgonów, a produkt Belviq® był dobrze tolerowany bez poważnych zdarzeń niepożądanych powodujących przerwanie leczenia. Podczas leczenia poza etykietą produktu Belviq® u jednego pacjenta początkowo nie występowały napady drgawkowe przez 3 tygodnie, u jednego pacjenta nie występowały napady drgawkowe przez 2 tygodnie, a u trzeciego pacjenta 1-2 dni w tygodniu. U wszystkich pięciu pacjentów zaobserwowano zmniejszenie całkowitej liczby napadów. Uogólnione napady toniczno-kloniczne były znacznie zmniejszone u pacjentów 1, 2 i 3. Rzeczywiście, pacjent 2 doświadczył 90% redukcji uogólnionych napadów toniczno-klonicznych bez potrzeby stosowania leków ratunkowych. Dwóch pacjentów nadal stosuje Belviq® bez zwiększenia częstości napadów i, zgodnie z oczekiwaniami, najczęstszym działaniem niepożądanym było zmniejszenie apetytu. Jeden pacjent ponownie rozpoczął leczenie po raz drugi z tymczasową poprawą na krótki okres czasu, a następnie zmniejszył się.

dyskusja

Clemizol, lek przeciwhistaminowy pierwszej generacji odkryty w latach 50., 1952), został zidentyfikowany jako potencjalny terapeutyczny w leczeniu zespołu Dravet przy użyciu scn1lab mutant danio pręgowanego do przesiewania bibliotek leków (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Tutaj potwierdziliśmy działanie przeciwpadaczkowe klemizolu przy użyciu drugiego modelu scn1 mutanta danio pręgowanego. Niestety, clemizol jest szybko metabolizowany u myszy z okresem półtrwania w osoczu <10 min (w porównaniu do 3,4 h u ludzi) (Nishimura i wsp., 2013), ograniczając jego ocenę w modelach mysich. Z powodzeniem stosowany jako lek przeciwhistaminowy (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) z ostrymi i przewlekłymi badaniami zgłaszającymi niską kolejność toksyczności (Finkelstein et al., 1960), klemizol nie jest już produkowany i obecnie nie jest dostępny do podawania poza etykietą. Bez środków do skutecznej oceny klemizolu w przedklinicznych modelach gryzoni, użyliśmy danio pręgowanego do zaangażowania docelowego (receptory 5-HT) i identyfikacji powiązanych leków (trazodon i lorkaseryna) o odpowiednich profilach bezpieczeństwa ułatwiających szybkie przełożenie do zastosowania klinicznego. Opisano również stosowanie współczucia, off-label recepty Belviq® (lorcaserin) u pacjentów z medycznie trudnym zespołem Dravet.

antagoniści receptora przeciwhistaminowego H1 są zwykle przeciwwskazani w populacji dzieci i młodzieży (Miyata i wsp ., 2011) i badania przesiewowe tych leków potwierdziły ich niezdolność do stłumienia (a w niektórych przypadkach zaostrzenia) napadów u danio pręgowanego scn1. Dane dotyczące wiązania wykazały nieznane wcześniej powinowactwo klemizolu do receptorów HTR2A i (lub) HTR2B. W kolejnym badaniu fenotypowym ukierunkowanych bibliotek zidentyfikowano dwa związki modulujące 5-HT, trazodon i lorkaserynę, zdolne do tłumienia napadów behawioralnych i elektrofizjologicznych w sposób porównywalny z klemizolem. Belviq® (lorcaserin)jest agonistą HTR2C zatwierdzonym przez FDA przepisanym do przewlekłego zarządzania wagą (Thomsen et al., 2008). Desyrel® (trazodon) jest również zatwierdzonym przez FDA lekiem przeciwdepresyjnym, powszechnie przepisywanym na zaburzenia snu (Mendelson, 2005). Często klasyfikuje się go jako antagonistę odwrotnego HTR2A i HTR2C oraz inhibitor wychwytu 5-HT (Stahl, 2009). Jednak badania na szczurach sugerują, że trazodon lub jego metabolit meta-chlorofenylopiperazyna (mCPP) mogą działać jako agonista HTR2C w wyższych stężeniach (Maj i wsp., 1979; Marcoli et al., 1998). W szczególności wykazano, że przewlekłe leczenie trazodonem chroni przed napadami wywołanymi elektrowstrząsami u myszy (Chavan i wsp ., 2010; Borowicz et al., 2012), potwierdzając nasze dane z scn1lab mutant danio pręgowanego. Działanie klemizolu za pośrednictwem receptora 5-HT jest również zgodne z niedawnym ekranem fenotypowym, w którym wykazano, że modulatory sygnalizacji serotoninergicznej (w tym klemizol) są skutecznym leczeniem w przedklinicznym modelu choroby Machado-Josepha (Teixeira-Castro i wsp., 2015); a badania tutaj sugerują, że clemizol i trazodon uzasadniają dalszy rozwój do badań poza etykietą u pacjentów z zespołem Draveta.

nasze wyniki również dodają do rosnącej liczby dowodów sugerujących modulację sygnalizacji serotoninergicznej jako silnego tłumika aktywności napadowej, zwłaszcza w katastrofalnych epilepsjach dziecięcych, takich jak zespół Draveta. Ostatnio 7 z 10 pacjentów leczonych małymi dawkami fenfluraminy blokującej wychwyt zwrotny 5-HT zostało zgłoszonych jako wolne od napadów przez 1 rok (Ceulemans i wsp ., 2016). U dwóch z tych pacjentów odnotowano nieznaczne pogrubienie jednej lub dwóch zastawek serca zgodne z możliwym związkiem między stosowaniem fenfluraminy a nadciśnieniem płucnym(Douglas i wsp ., 1981; Ceulemans et al., 2016). U ludzi HTR2A i HTR2C ulegają ekspresji w OUN, podczas gdy ekspresja HTR2B jest wzbogacona w sercu (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Dokładniej, HTR2C wyraża się na subpopulacji interneuronów hamujących (Liu et al., 2007) i aktywacja tych receptorów za pomocą 5-HT zwiększa hamowanie synaptyczne za pośrednictwem GABA (Boothman i wsp., 2006), tj. mechanizm działania przeciwpadaczkowego leżący u podstaw wielu powszechnie przepisywanych leków przeciwpadaczkowych. Rzeczywiście, większość badań przedklinicznych sugeruje, że aktywacja receptorów HTR2A i/lub HTR2C ma działanie przeciwpadaczkowe (Gharedaghi i wsp., 2014; Guiard et al., 2015), który jest rozsądnym mechanizmem działania łączącym klemizol, lorkaserynę, trazodon i fenfluraminę blokującą wychwyt zwrotny 5-HT (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). Co ciekawe, ekspresja htr2b w mózgu danio pręgowanego była stosunkowo niska, co dodatkowo sugeruje, że leki te potencjalnie wywierają działanie przeciwpadaczkowe poprzez aktywację receptora HTR2A lub HTR2C. Co ciekawe, badania nad muchami typu knock-in Drosophila niosącymi ludzką mutację K1270T SCN1A w genie kanału sodowego para wykazały, że suplementacja prekursorem 5-HT (5-hydroksytryptofanem) ratuje fenotyp napadowy wywołany przez ciepło (Schutte et al., 2014). Dodatkowo, w niedawnym badaniu z użyciem mutantów scn1Lab oceniono 13 związków sygnałowych 5-HT, a także zasugerowano potencjalną rolę przeciwpadaczkową dla modulatorów sygnalizacji 5-HT(Sourbron i in., 2016). Jednak w tych ostatnich badaniach danio pręgowanego stosowano zasadniczo inny protokół (24 godziny w porównaniu z 30-90 minutową ekspozycją na lek), który nie został wcześniej zwalidowany jako skutecznie identyfikujący leki przeciwdepresyjne stosowane w zespole Dravet (benzodiazepiny, walproinian, styrypentol, bromki i dieta ketogeniczna). Dodatkowo, stężenia leków około 10-krotnie niższe niż wykazujemy, że są skuteczne u danio pręgowanego (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015) i zgłaszanie działania przeciwpadaczkowego na halucynogen TCB-2 (rys. 5), sugeruje, że bezpośrednie porównanie danych z laboratoriów przy użyciu różnych procedur powinno być interpretowane z ostrożnością.

podsumowując, stwierdzamy, że zmutowane danio pręgowane są odpowiednim modelem do szybkiego badania przesiewowego i odkrywania nowych leków przeciwdrgawkowych, które przy odpowiednich profilach bezpieczeństwa mogą bezpośrednio informować o opiece klinicznej nad populacjami pacjentów zagrożonych, takimi jak zespół Draveta.

skróty

skróty
• 5-HT
• AED

  lek przeciwpadaczkowy

• dpf

  dni po zapłodnieniu

• GPCR

  receptor sprzężony z białkiem G

• iZAP

  zintegrowana platforma analizy danio pręgowanego

podziękowania

chcielibyśmy podziękować członkom Laboratorium Barabana, w szczególności Brianowi Grone i Matthew Dinday, za przydatne dyskusje w trakcie tych studiów.

dofinansowanie

S. C. B. NS079214, UCSF Catalyst Award i Raymond & Beverley Sackler Centre Sabbatical Fund.

materiał uzupełniający

materiał uzupełniający jest dostępny na stronie Brain online.