chromodomaina Chp1 wiąże ogon h3k9me i rdzeń nukleosomu w celu zmontowania heterochromatyny

Budowa plazmidów i szczepów

mutanty Chp1CD do ekspresji i oczyszczania zostały wygenerowane przez odwrotne PCR przy użyciu starterów wymienionych w dodatkowej tabeli S2, począwszy od pet28a chp1 plazmid chromodomeny . Testy ratunkowe heterochromatyny przeprowadzono przez wprowadzenie plazmidów zawierających chp1 wt i zmutowane białko chp1 pod jego endogennym promotorem w szczepie chp1Δ (SP170, patrz tabela uzupełniająca S3). Gen pełnej długości chp1 i jego endogenny promotor (-949 bp od początku sekwencji kodującej chp1+) sklonowano w plazmidzie pREP1. mutanty chromodomeny chp1 wytworzono metodą odwrotnego PCR przy użyciu starterów wymienionych w dodatkowej tabeli S2 i przekształcono we wskazanym szczepie chp1Δ.

dla integracji genomowej, plazmid pREP1 zmodyfikowano w celu zastąpienia promotora nmt1+ następującą kasetą integracyjną: (SphI) Region na 5′ genu Chp1 (chromosom i, 2215500-2215055) (AscI)—kaseta oporności hphmx6 -(SphI) promotor endogenny Chp1 (chromosom i, 2214829-2214664)—Sekwencja kodująca Chp1—(bamhi) chp1 Terminator (chromosom i, 2210976-2210582) (bamhi). Kaseta integracyjna (zarówno kaseta chp1+, jak i kaseta chp1LOOP1B/2B) została następnie amplifikowana PCR i przekształcona przez elektroporację w szczepy SP101, SP170 i SP64. Następnie komórki wyselekcjonowano na płytkach YES + Higromycyna (50 mg ml-1 Higromycyna). Pojedyncze kolonie izolowano, przesiewano PCR i sekwencjonowano w celu genomowej insercji kasety oporności HphMX6 i mutacji LOOP1B/2B.

szczepy zawierające plazmidy hodowano na nośnikach Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC) – leu. Wszystkie szczepy i plazmidy użyte w tym badaniu są wymienione w dodatkowych tabelach S3 i S4.

oczyszczanie białka

His6-SUMO-Chp1CD i wszystkie mutanty CD wyrażono w E. coli BL21 (DE3)(pLys) i oczyszczona metodą chromatografii powinowactwa przy użyciu żywicy Ni-Nta (GE Healthcare, Freiburg, Niemcy). His6-SUMO-Chp1CD zawiera miejsce rozszczepienia trombiny pomiędzy dwoma znacznikami .

w sumie dodano 0,2 mM IPTG w celu wywołania ekspresji białka, a następnie wzrostu w temperaturze 18 °C O/N. komórki zebrano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w buforze do lizy (20 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynetanosulfonowy (HEPES) pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), 20 mM imidazol). Po błyskawicznym zamrażaniu komórki rozmrażano i inkubowano przez 30 minut w lizozymie przed sonikacją (Branson Sonifier 250-wyjście 4, cykl pracy 40). Zawiesinę odwirowano (12000 g, 20 min w temperaturze 4 °C) i supernatant dodano do żywicy Ni-NTA wstępnie zrównoważoną w buforze wiążącym (20 mm HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM imidazol) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 4 °C w rotacji. Następnie żywicę przemyto 5× buforem wiążącym, a białka eluowano w buforze elucyjnym (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM imidazol). Chp1CD wt i mutanty następnie dyalizowano O/N w buforze zawierającym 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD następnie oczyszczano przez filtrację żelową (Superdex 75 pg; GE Healthcare) i dializowano w buforze zawierającym 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mM DTT.

testy wyciszania

komórki do testów wyciszania hodowano do OD 0,7–1, a następnie znormalizowano do końcowego stężenia 1×107 komórek ml−1 Kultury. Dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia wykonano tak, aby w miejscu o największej gęstości znajdowało się 1 × 105 komórek. Komórki zauważono na płytkach nieselektywnych (tak) i kwasu 5-fluoro-orotowego (5-FOA 1 g l−1 5-FOA). Płytki inkubowano w temperaturze 32 °C przez 2-3 dni i zobrazowano. Komórki posiadają Gen reporterowy ura4 wstawiany do perycentromerycznych powtórzeń IMR (locus heterochromatyczny). Gdy gen reporterowy ura4 jest wyciszony, komórki mogą rosnąć na podłożu zawierającym 5-FOA. Po utracie heterochromatyny ulega ekspresji Gen reporterowy ura4, a komórki nie są w stanie rosnąć na podłożu 5-FOA.

wykrywanie poziomów RNA za pomocą qPCR (RT–qPCR)

kultury drożdży (10 ml) hodowano do OD600 0,7-1,5. Następnie komórki ponownie zawieszono w buforze do lizy 500 µl (300 mM pH naoac 5,2, 1% siarczanu dodecylu sodu) i 500 µl fenolowo–chloroformu i inkubowano w temperaturze 65 °C przez 10 minut ze stałym mieszaniem. Frakcję wodną oddzielono od fenolowo-chloroformu przez odwirowanie (10 min, 20 000 g) i wytrącono Etanol. Kwasy nukleinowe traktowano Dnazą i (Roche, Bazylea, Szwajcaria) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przez 15 minut w temperaturze 75 °C inaktywację cieplną. Komplementarne DNA zsyntetyzowano przy użyciu 100 ng RNA i 1 pmol oligos DNA z indeksem górnym III (Invitrogen, Darmstadt, Niemcy) przy użyciu standardowych warunków. Poziomy RNA oznaczono ilościowo za pomocą qPCR za pomocą zestawu Biozym DyNAmo Flash qRT-PCR i znormalizowano do genu euchromatycznego tdh1.

RNA electrophoretic mobility shift assays

RNA shift assay wykonywano zgodnie z wcześniej opisanymi warunkami . W sumie 0.66 pmoli 32P znakowanego radioizotopem 30-nt centromerycznego RNA inkubowano z chromodomeiną 10 µM Chp1 (dzikiego typu i zmutowanego) w buforze zawierającym 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT i 3% glicerolu. Dla EMSA RNA z 100 nt dg centromerycznymi transkryptami inkubowano 2 pmole znakowanego radioizotopem RNA 32P z 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmole białka Chp1CD (mutant WT i loop1b/2B) w końcowej objętości 15 µl. Peptyd H3K9me3 (Eurogentec, Köln, Niemcy) Dodano w peptydzie 1:1 Chp1CD – h3k9me, jak opisano w . Inkubację prowadzono przez 1 godzinę na lodzie, a próbki (20 µl końcowej objętości) załadowano na 10% natywny żel Akrylamid-TBE (stosunek Bis-akrylamidu 1:29). Do ściągania RNA in vitro, 1 µg SUMO-Chp1CD (Mutant typu dzikiego i loop1b/2B) wiązano z 15 µl żywicy Ni-Nta (GE Healthcare) i dodano H3k9me3nukleosom w celu złożenia kompleksu Chp1cd-H3k9me3nukleosomu w buforze wiążącym (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol). Po trzykrotnym przemyciu 50 µl buforu wiążącego Dodano 2 pmole znakowanego 32P dg RNA 100nt i inkubowano z żywicą Nukleosomu Chp1cd na lodzie przez 1 godzinę. żywicę odwirowywano z powolną prędkością (60 g, 10 s) I zebrano przepływ. Żywicę przemyto trzykrotnie buforem wiążącym co najmniej 3× (v/v), A kompleks Chp1cd-Nukleosom-RNA eluowano przez dodanie 300 mM buforu imidazolowego (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mM DTT, 300 mm imidazol), inkubowano przez 1 godzinę na lodzie z 5-minutowym mieszaniem (frakcja związana). Próbki załadowano na 10% natywny żel Akrylamidowy TBE (stosunek Bis-akrylamidu 1:29) i prowadzono przez 2 godziny w temperaturze 10 mA w temperaturze 4 °C. po nocnej ekspozycji żele skanowano za pomocą phosphoimager TyphoonFLA9000.

immunoprecypitacja chromatyny

kultury drożdży (100 ml) hodowano do OD600 0,7 i usieciowano 3% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 15 minut, jak opisano . Reakcję hartowano 125 mM glicyną przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki ponownie zawieszono w buforze lizy 500 µl (50 mM HEPES pH 7,5, 1.5 M octan sodu, 5 mM MgCl2, 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy, 2 mM glikol etylenowy kwas tetraoctowy, 0,1% NP-40, 20% glicerol) zawierający inhibitory proteazy (tabletki koktajlowe inhibitora proteazy, Roche, Complete, wolny od kwasu etylenodiaminotetraoctowego). Zamrożone komórki lizowano za pomocą MP biospec bead beater. Po lizie ekstrakt sonikowano 35× przez 30 s (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgia) i obracano w temperaturze 13 000 g przez 15 minut, aby uzyskać supernatant chromatyny. Do wejścia DNA użyto 50 µl supernatantu. W przypadku immunoprecypitacji supernatanty znormalizowano na podstawie stężenia białka i inkubowano z przeciwciałem przeciw dimetylowanym H3K9 lub przeciwciałem przeciw Chp1(h3k9me2, nr Abcam. Ab1220 i Chp1, nr Abcam Ab18191), unieruchomiony na magnetycznych kulkach Dynabeads, przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. kulki i unieruchomione białko przemyto 5× 1 ml buforu lizy. Białka eluowano przez inkubację z 150 µl buforu elucyjnego (50 mM tris-HCl pH 8,0, 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego, 1% sodowego siarczanu dodecylu) w temperaturze 65 °C przez 15 minut. Sieciujące ogniwa odwrócono przez inkubację w temperaturze 65 °C przez noc, a następnie degradację RNA z Rnazą A i degradację białka z Proteinazą K. następnie DNA odzyskano przez ekstrakcję fenolowo–chloroformową i wytrącanie etanolem i oznaczono ilościowo za pomocą qPCR. Do normalizacji użyto genu euchromatycznego tdh1. Oligonukleotydy stosowane w testach immunoprecypitacji chromatyny są wymienione w dodatkowej tabeli S2.

odtwarzanie Nukleosomów in vitro i (h3k9me3) metylowanie

odtwarzanie Nukleosomów przy użyciu histonów Xenopus laevis i sekwencji 601, jak opisano wcześniej . Metylację in vitro przeprowadzono zgodnie z opisem . Szczyt na + 42 Da zaobserwowano w oryginalnej publikacji i nie jest to skażenie (Matt Simon, personal communication i opisane w).

in vitro chp1cd–H3K9me3 MLA tworzenie i elucja kompleksu Nukleosomów

w sumie 5 µg Chp1CD wiązano z 15 µl żywicy Ni-NTA w buforze wiążącym (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol) przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Żywicę przemyto raz pięcioma objętościami buforu wiążącego i dodano 10 µg nukleosomów analogu metylolizyny h3k9me3 (MLA) (nukleosomy MLA były wcześniej dializowane w buforze wiążącym) w końcowej objętości 20 µl i inkubowano 1 h na lodzie ze stałą ponowną zawiesiną co 5 minut. Po inkubacji żywicę wirowano (60 g przez 10 s) I zebrano przepływ. Następnie żywicę przemyto trzy razy pięcioma objętościami buforu wiążącego. Kompleks Nukleosomów SUMO-Chp1CD-H3k9me3 eluowano przez dodanie trombiny (Sigma, Monachium, Niemcy) przez 2 godziny na lodzie w 20 µl buforu wiążącego. Tworzenie kompleksu oceniano następnie za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS na 15% żelach akryloamidowych i za pomocą ujemnego zabarwienia EM.

testy wiązania peptydu Chp1CD h3k9me3

w sumie 1 µg peptydu-histonu H3 (1-21)-GGK(biotyny) (Eurogentec) inkubowano z 15 µl żywicy agarozowej streptawidyny (Invitrogen) w 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT. Następnie dodano około 5 µg Chp1CD (zarówno wt, jak i mutanty) w końcowej objętości 20 µl i inkubowano przez 1 godzinę na lodzie w tych samych warunkach buforowych. Żywicę przemyto trzy razy, a następnie oceniono skuteczność wiązania na elektroforezie żelu poliakrylamidowego SDS na 15% żelach akryloamidowych. Kwantyfikacja wiązania została wykonana przy użyciu oprogramowania ImageJ. Wiązanie każdego mutanta znormalizowano do WT Chp1CD dla każdego testu.

Termoforeza mikroskopowa (MST)

dla MST znacznik SUMO został usunięty z konstrukcji Chp1CD z proteazą Ulp1. W sumie 100 µg chp1cd typu dzikiego i zmutowanego zostało znakowane fluorescencyjnie za pomocą zestawu do znakowania Monolith Protein MO-L003 BLUE-NHS (Amine Reactive) zgodnie z instrukcjami producenta (Nanotemper Technologies, Monachium, Niemcy). Stosunek fluorescencji 1: 1: białko oszacowano za pomocą funkcji „białka i etykiety” oprogramowania Nanodrop1000 i każdą Chromodomenę Chp1 przeprowadzono na 15% żelu akryloamidowym SDS w celu normalizacji stężeń do 0,1 mg ml-1.

reakcje montowano w 20 µl z 300 ng fluorescencyjnego Chp1CD i zwiększając ilości-histonu H3 (1-21)-GGK(biotyny) peptydu (Eurogentec) lub H3k9me3nukleosomów, w buforze zawierającym 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT i 0,05% Tween-20. Do oznaczania wiązania H3k9me3nukleosomów glicerol dodano do 10% koncentrakcji końcowej. W testach H3K9me3 rozcieńczenia te wykorzystano do pomiarów: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nm, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µM, 800 µM, 1,2 µM, 1,8 µM. Do oznaczania Nukleosomów H3k9me3 wykorzystaliśmy następujące rozcieńczenia do pomiarów: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 µM, 1,2 µM, 1,4 µM, 1,6 µM, 2,4 µM.

przebiegi MST wykonywano przy użyciu standardowych naczyń włosowatych (Nanotemper Nr kat. K002) NA NT.115 instrument monolitowy. Wszystkie pomiary wykonano przy użyciu 80% mocy LED i 40% mocy MST, przy 30-sekundowym włączaniu lasera i 5-sekundowym wyłączaniu lasera. Dla każdego eksperymentu przeprowadzono pięć pojedynczych pomiarów.

dane analizowano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism w wersji 6.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) oraz oprogramowania SigmaPlot w wersji 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). Dla testów wiązania peptydów, z krzywymi wykazującymi wyraźny trend sigmoidalny, dopasowaliśmy asymetryczne równanie Sigmoidalne Richardsa five parametr Logistic i automatycznie obliczyliśmy Kd. W przypadku testów wiązania Nukleosomów H3k9me3, ponieważ trend surowych danych nie był już esicą dla wszystkich analizowanych białek, zastosowano równanie wielomianowe trzeciego rzędu (sześcienne) do dopasowania i porównania surowych punktów danych chp1cd typu dzikiego i różnych mutantów. Kd obliczono na podstawie funkcji „interpolacji”oprogramowania GraphPad prism, przy użyciu 50% wartości związanej / niezwiązanej na osi Y.

trawienie Nukleosomów trypsyny

bezogonowe nukleosomy otrzymano przez inkubację odtworzonych nukleosomów z unieruchomioną żywicą Tpck-trypsyny (Termoscientific) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w buforze zawierającym 20 mm HEPES pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mM DTT . Trawienie tryptyczne generuje bardzo określone pasma histonów i zostało szczegółowo scharakteryzowane, gdzie dokładnie trypsyna przecina .

testy wiązania Nukleosomów z mutantami Chp1CD

testy wiązania nukleosomów chp1cd typu dzikiego i zmutowanego przeprowadzono jak opisano wcześniej dla tworzenia kompleksu Nukleosomów Chp1CD-H3KC9me3 MLA w 20 mm HEPES pH 7,5, 100 mm KCl, 0,5 mM DTT, 40 mm imidazol. Żywice i wkłady przeprowadzono na elektroforezie żelu POLIAKRYLAMIDOWEGO SDS-15% żelach akryloamidowych. Następnie wszystkie Próbki analizowano immunoblot przeciwciałami anty-H3 histone (AbCam, Cambridge, UK, 1: 1000) lub przeciwciałami anty-H3K9me3 (AbCam, 1: 1000), przeciwciałami anty-kozim IgG-HRP (BioRad, 1: 3000) przeciwciałami anty-króliczym IgG-HRP (BioRad, Monachium, Niemcy, 1:3000).

mikroskopia elektronowa z ujemną plamą

po elucji trombiny, 3 µl kompleksu nukleosomów Chp1CD–H3KC9me3 zauważono na wyładowanej poświatą miedzianej siatce (CU 400 mesh Q11916, Quantifoil, Großlöbichau, Niemcy) pokrytej 1 nm warstwą węglową przez 45 s. Po szybkim umyciu wodą siatkę inkubowano przez 15 s W 2% octanie Uranylu. Ujemne obrazy plam zebrano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego FEI Morgagni.

Cryo-EM na kompleksie nukleosomów Chp1CD–H3KC9me3

siatki Cryo-EM (siatki pokryte dziurawym węglem, warstwa węglowa CU 300 Mesh R3/3+1 nm, Kwantyfikol) przygotowano przy użyciu Vitrobot Mark IV (firma FEI). Dane Cryo-EM zostały zebrane przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego Titan-Krios (Fei Company, Hillsboro, OR, USA) przy 200 KeV i powiększeniu 113 000× na płaszczyźnie matrycy CCD przy użyciu kamery F816 CMOS (TVIPS GmbH, Gauting, Niemcy), co dało obraz o rozmiarze 1,2 Å na piksel w skali obiektu (rozmiar piksela matrycy CCD wynosił 13,6 µm). Do automatycznego zbierania danych wykorzystano oprogramowanie EM-TOOLS, a dane zbierano w zakresie rozmycia 10 000-40 000 Å.

w sumie wybrano 2 480 mikrografów dla kompleksu Chp1CD–h3kc9me3 i 991 mikrografów dla sterowania nukleosomem h3kc9me3 do analizy pojedynczych cząstek przy użyciu pakietu oprogramowania Xmipp (rysunek uzupełniający S9A) . Kilka tysięcy cząstek zostało ręcznie zebranych i starannie oczyszczonych z hałasu. Cząstki te zostały następnie wykorzystane do półautomatycznego i automatycznego zbierania cząstek w XMIPP. Funkcja transferu kontrastu została określona przez CTFFIND3 . Wybrane pojedyncze cząstki przekształcono do formatów SPIDER i RELION w celu dalszej analizy (rysunek uzupełniający S9B). Dwuwymiarowe średnie klasy zostały wygenerowane za pomocą pakietu oprogramowania RELION (rysunek uzupełniający S9C). Złe średnie klasy zostały usunięte z dalszej analizy danych. Trójwymiarowe udoskonalenia zostały następnie wykonane za pomocą pakietów oprogramowania SPIDER i RELION .

bez nadzoru klasyfikację cząstek przeprowadzono przez losowe wysiewanie z kompletnymi mapami gęstości bez skupionej klasyfikacji w pakiecie oprogramowania SPIDER. Próby zastosowania klasyfikacji skoncentrowanej skutkowały silnym odchyleniem i nadmiernym poziomem hałasu w interesujących regionach. Dlatego nie użyliśmy klasyfikacji skupionej w celu zmniejszenia uprzedzeń. W klasyfikacji wstępnej przeprowadzonej w pajęczynie, klasy C0–C6 i N0–N5 zostały ponownie wyprofilowane za pomocą kątów z map C0 i N0 i klasy te nie zostały do końca dopracowane. Tutaj chcieliśmy tylko wybrać klasy, które mają dodatkową gęstość związaną z nukleosomem. Cząstki generujące mapy o różnych gęstościach Chp1CD zostały oddzielone i dalej sklasyfikowane. Przeprowadzono około 20 rund losowych klasyfikacji wysiewu, dopóki nie podzielimy cząstek na pięć różnych grup (rysunek uzupełniający S3). Klasy C11-C15 zostały udoskonalone za pomocą pakietu oprogramowania RELION. Ostateczne udoskonalenia kompleksów Nukleosomów Chp1CD-H3k9me3 (Klasa C15)i kontroli Nukleosomów przeprowadzono za pomocą pakietu oprogramowania RELION. W celu ostatecznego udoskonalenia referencję filtrowano do ~50 Å (filtr RELION). Zastosowana przez nas Referencja nie miała żadnych cech obserwowanych w rekonstrukcjach wyrafinowanych (podwójna helisa DNA nie jest rozdzielona, główny rowek nie jest widoczny, α-helisy nie są rozdzielone). Oznacza to brak odniesienia w naszej strukturze. Rozdzielczość kontroli Nukleosomów osiągnęła 7,3 Å przy użyciu auto-rafinacji w RELIONIE i symetrii C2 (FSC 0,143 odcięcia dwóch niezależnie udoskonalonych map). Kompleks Nukleosomów Chp1CD-H3k9me3 rafinowano do 10 Å (FSC 0,143 odcięcia dwóch niezależnie rafinowanych map) bez zastosowanej symetrii.

rozdzielczość lokalna została obliczona za pomocą oprogramowania ResMap (final single volume, minRes=7, maxRes=14, automask). Średnia rozdzielczość określona przez Resmap wynosi 9,4 Å dla kompleksu Nukleosomów Chp1CD-H3k9me3, niezależnie potwierdzając wcześniej ustaloną średnią rozdzielczość 10 Å (FSC 0,143) (Fig. 1C). Dla Chp1CD-H3K9me3Nucleosome complex lokalna rozdzielczość dla nukleosomu wynosi 9-10 Å, a dla ligandu ~10 Å (Fig.2A). Rozkład kąta Eulera dla końcowych rekonstrukcji przedstawiono zarówno dla Nukleosomu, jak i kompleksu Nukleosomu Chp1CD-H3k9me3 (rysunek uzupełniający S9D). Wszystkie orientacje są obecne z preferencjami dla widoku górnego i bocznego.

modele molekularne zostały zbudowane przy użyciu pakietu oprogramowania Chimera z wykorzystaniem sztywnego dopasowania struktur krystalicznych. Dopasowanie do gęstości zostało wykonane za pomocą opcji Chimera „Dopasuj na mapie” i „dopasuj na segmentach” z tylko niewielkimi ręcznymi regulacjami. Segmentacja i wizualizacja wszystkich map cryo-EM została również wykonana za pomocą oprogramowania Chimera .