Chimery

co podasz Część I

• numer konta.
• wolna od mykoplazmy linia komórkowa ES z 40 chromosomami.

co zrobimy

• wstrzykniemy około 50 blastocyst na linię komórkową ES. Powinno to skutkować urodzeniem 10 myszy. Oczekuje się, że trzy z myszy będą silnymi samcami chimer. Mamy udokumentowane sukcesy.
• trzymamy myszy do momentu odstawienia od piersi (trzy tygodnie po urodzeniu).

co podasz cz. II

• Znajdziesz tu odstawione od maciory myszy.

koszt

• $3,300 za 129 linii komórkowej i koszt kobiet dawców; $4,950 za linię komórkową i koszt kobiet dawców dla innych środowisk genetycznych.
• lokalne zamówienia bez CWRU zostaną obciążone dodatkową kwotą 200 USD za pakowanie i transport myszy. Zamówienia nie-lokalne będą obciążane kwotą 200 USD i kosztami transportu.

zgodność z przepisami

• badacze potrzebują protokołu IACUC ze swojej instytucji, aby odbierać myszy z rdzenia. Protokoły CWRU iacuc muszą określać użycie rdzenia transgenicznego Case. Badacze nie potrzebują własnego protokołu IBC, Zwykle: przegląd rekombinowanego DNA u zwierząt zostanie przeprowadzony na informacjach przedłożonych przez zamówienie online dla rdzenia transgenicznego i zostanie dodany do protokołu IBC rdzenia jako poprawka, jeśli zostanie zatwierdzona. Po złożeniu zamówienia IBC może skontaktować się z Tobą w celu uzyskania dodatkowych informacji w ramach przeglądu rDNA. Przed rozpoczęciem iniekcji wymagane jest zatwierdzenie IBC.

podziękowania

• zwracamy się z prośbą o potwierdzenie sprawy w seminariach i publikacjach.

Timeline

• od daty wstrzyknięcia komórek minie co najmniej 6 tygodni, zanim będziemy mogli dostarczyć Ci myszy (prawie 3 tygodnie ciąży i co najmniej 3 tygodnie wzrostu poporodowego przed odsadzeniem). Minie kolejne 6 tygodni, zanim samiec Chimery będzie na tyle dorosły, by się rozmnażać, i minimum kolejne 6 tygodni, zanim będziesz miał odstawione potomstwo do genotypu, aby przetestować transmisję linii zarodkowej–w sumie 4.5 miesięcy od wstrzyknięcia do testowania transmisji linii zarodkowej.
• obecny (3/25/21) oczekiwany czas między złożeniem zamówienia a wstrzyknięciem komórki ES wynosi 8 tygodni. Podczas 8 tygodni przed wstrzyknięciem, żądanie Chimery jest weryfikowane przez Komitet rDNA IBC, komórki ES są rozmrażane i hodowane, a myszy są zamawiane i odbierane.

wskaźnik sukcesu w generowaniu myszy chimerycznych

rdzeń generuje średnio około 5 chimer na linię komórkową.

rozpoczęcie
prawdopodobieństwo przeniesienia linii zarodkowej ukierunkowanej mutacji wzrasta wraz z liczbą dostępnych niezależnych linii komórek ES. Średnio około 2/3 do 3/4 linii komórek ES na 129 tle genetycznym będzie germinali. W przypadku linii komórek ES na tle C57 średnio tylko od połowy do dwóch trzecich linii przechodzi w linię zarodkową. W związku z tym, jeśli kupujesz ukierunkowane linie komórkowe ES z publicznego repozytorium, zalecamy zakup 3 lub więcej prawidłowo ukierunkowanych linii na tle 129 i 4 lub więcej linii na tle C57. Podobnie, zamów 2 lub więcej zastrzyków dla 129 linii i 3 lub więcej dla linii C57. Aby uzyskać informacje na temat wytwarzania specyficznych dla tkanek nokautów z allelami warunkowymi w komórkach ES z EUCOMM, zobacz nasz podkład.

Najczęściej zadawane pytania

czym są Chimery?
zazwyczaj Chimery są skonstruowane w celu generowania myszy z ukierunkowanych na geny lub uwięzionych w genie linii komórkowych ES. Komórki ES wstrzyknięte do zarodków gospodarza dają początek myszy mozaikowych znanych jako Chimery.
męskie komórki ES wstrzykuje się do nieseksowanych blastocyst. Jeśli zarodek gospodarza jest żeński, a męskie komórki ES tworzą komórki zarodkowe, Chimera często będzie płodnym samcem. Wykorzystuje się zarodki gospodarza ze szczepu, który nie konkuruje zbyt silnie z komórkami ES, a dwa składniki (ES i zarodek gospodarza) są genetycznie oznaczone genami koloru sierści, dzięki czemu wkład komórek ES w zwierzę można łatwo określić. Jeśli odsetek Potomków komórek ES w sierści zwierzęcia jest wysoki, prawdopodobieństwo, że komórki ES są reprezentowane w gametach, jest również wysokie, ponieważ komórki ES dokładnie mieszają się z komórkami gospodarza na początku embriogenezy. System oznaczania koloru sierści umożliwia również określenie, za pomocą odpowiednich krzyżówek, czy potomstwo chimer pochodzi od składnika komórkowego ES lub składnika zarodka gospodarza.
129 komórek ES daje brązowy kolor sierści, ponieważ są A / A (agouti typu dzikiego), a zarodki gospodarza C57BL / 6J dają czarny kolor sierści, ponieważ są A / a (recesywne nonagouti). Komórki ES pochodzą ze szczepu myszy 129; zarodki gospodarza pochodzą ze szczepu myszy C57BL / 6J. Jeśli te Chimery są hodowane u myszy a/a nie agouti (na przykład C57BL / 6J, to każde brązowe potomstwo (a/a) musi pochodzić z GAMET pochodzących z komórek ES, a oczekuje się, że 50% brązowego potomstwa będzie nosiło allel nokautujący. Alternatywnie, transmisja mutacji może być oznaczona bezpośrednio przez testy PCR lub Southern blot tkanek potomstwa.

jeśli komórki ES pochodzą ze szczepu C57BL/6j (A/A, Tyr/Tyr i czarny), zarodek gospodarza będzie albinosem C57BL / 6j (A/A, Tyrc-2j / Tyrc2-J i biały). Hodowla takich chimer do albinosa C57BL/6J może generować Czarne potomstwo (a/a, Tyr/Tyrc-2j) ze składnika komórki ES, z którego 50% powinno posiadać mutację, a białe potomstwo (a/a, Tyrc-2j/Tyrc-2j) ze składnika zarodka gospodarza.
męskie Chimery, które mogą przenosić celowaną mutację, można zidentyfikować poprzez genotypowanie wtyczki kopulacyjnej.

chimery do innych zastosowań
wykonujemy również Chimery agregacyjne i Chimery diploidtetraploidalne. Dwa zarodki preimplantacyjne z dwóch różnych szczepów myszy są łączone, tworząc agregację Chimery. Technologia ta może być wykorzystana do generowania zarodków mozaiki genetycznej do analizy autonomii i nieautonomii działania genów i innych celów eksperymentalnych. W chimerach diploidtetraploidalnych Składnik tetraploidalny w dużej mierze tworzy łożysko pochodzenia zarodkowego, a składnik diploidalny tworzy zarodek. Ten typ Chimery może być użyty do określenia, czy gen jest wymagany w łożysku lub zarodku.

Dlaczego moje myszy są śmieszne kolory?
niektóre linie komórkowe ES są heterozygotyczne dla alleli koloru sierści, które ujawniają się dopiero w kolejnych pokoleniach. Komórki R1 129 ES, których używamy, są heterozygotyczne w locus albinosa, niosąc jedną kopię allelu szynszyli albinosa (cch, również oznaczonego Tyrc-ch) i są heterozygotyczne w locus rozcieńczenia różowookiego (p). Hodowla potomstwa wywodzącego się z komórek R1 ES do siebie może dać początek myszom, które są czarne, różne odcienie szarości, różne odcienie brązu lub żółte, w zależności od asortymentu alleli koloru sierści.

co można zrobić, aby zapewnić transmisję linii zarodkowej?
transmisja linii zarodkowej jest zmaksymalizowana dzięki komórkom ES, które spędziły minimalną ilość czasu w hodowli, które mają normalny dopełniacz chromosomów i które są wolne od drożdży, bakterii i mykoplazmy. Celuj w linię komórkową, o której wiesz, że jest transmitowana w Twoich warunkach w Twojej instytucji. Użyj linii komórki rodzicielskiej, która znajduje się na najniższym dostępnym numerze przejścia (najlepiej mniejszym niż numer przejścia 16). Zminimalizuj czas hodowli docelowej linii. Sprawdź, czy docelowe linie komórkowe mają normalną liczbę chromosomów. Sprawdź linię komórkową na obecność mykoplazmy. Niektóre linie komórkowe nie będą transmitować nawet wtedy, gdy wszystkie te parametry są na Twoją korzyść. Nawet w optymalnych warunkach, tylko dwie trzecie docelowych linii komórkowych ES będą transmitowane przez linię zarodkową. Dlatego zacznij od co najmniej trzech niezależnych ukierunkowanych linii komórkowych, aby zapewnić transmisję.

mam słabe Chimery / żeńskie Chimery. Będą transmitować nokaut?
zarówno słabe Chimery, jak i żeńskie Chimery mogą przenosić zmutowane allele, choć rzadko. Samce chimer, które mogą przenosić celowaną mutację, można zidentyfikować poprzez genotypowanie wtyczki kopulacyjnej. Tylko około 10% żeńskich chimer przekazuje Genom komórki ES, kiedy to robią, jest to tylko w pierwszych kilku miotach, a wiele z ich męskiego potomstwa ma aneuploidie chromosomów płciowych, które czynią je bezpłodnymi(Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

dlaczego umarły moje najsilniejsze Chimery?
śmiertelność może wzrastać wraz z odsetkiem zwierzęcia, które pochodzi z komórek ES, nawet dla najlepszych linii komórkowych. Śmiertelność ta wynika w dużej mierze z aberracji epigenetycznych, które powstały w kulturze. Uważa się, że aberracje epigenetyczne są korygowane przez późniejsze rozmnażanie przetrwałych myszy i oddzielają się losowo od docelowego locus, nawet jeśli nie były.

do jakiego szczepu myszy hoduję mutanty?
aby zminimalizować zmienność genetyczną tak szybko, jak to możliwe, hoduj Chimery na tym samym tle, co komórki ES. Jeśli komórki ES miały 129, rozmnażaj chimery do 129 myszy, a twoja mutacja będzie całkowicie na 129 wrodzonym tle w jednym kroku. Najczęstszym podłożem do badań genetycznych jest szczep C57BL/6. Jeśli komórki ES są komórkami C57BL / 6, krzyżuj Chimery z myszami C57BL / 6J. Jeśli chcesz zmienić tło, standardem jest wykonanie 9 seryjnych krzyży do wybranego szczepu wsobnego (około 2,5 roku). Uzasadnienie dla 9 pokoleń wyjaśnia tutaj Lee Silver. Alternatywnie, około połowa liczby pokoleń jest wymagana przez marker-assisted backcross, lub speed congenics.Aby uzyskać maksymalną reprodukcję, krzyżuj myszy na rasowych szczepach, takich jak CD1. Myszy CD1 pochodzą od myszy Szwajcarskich, mają wysoki stopień zmienności genetycznej i zostały wybrane do solidnej reprodukcji.

komórki ES z allelami warunkowymi z EUCOMM
każda linia komórkowa z EUCOMM będzie wymagała zawarcia umowy transferu materiałów. Rozpocznij ten proces jak najwcześniej.
czas generacji myszy i liczba krzyży niezbędnych do wygenerowania myszy eksperymentalnych łączą się w czasie, który jest zaskakujący dla tych, którzy nie są przyzwyczajeni do genetyki myszy, więc planuj z wyprzedzeniem. Czas generacji myszy (czas od dojrzałego płciowo dorosłego do dojrzałego płciowo potomstwa) wynosi około 3 miesięcy.
allele warunkowe EUCOMM mają zazwyczaj kasetę flankowaną Frt (kasetę” Frt-ed”). Kaseta ma akceptor splicingu, który przekierowuje praktycznie całe splicing do kasety, co czyni allel mutacją utraty funkcji w tej konfiguracji. Aby wygenerować allel warunkowy, kaseta flankowana Frt musi zostać usunięta przez przejście do myszy wyrażających Flpe. System Flpe / Frt jest porównywalny, ale różni się od systemu Cre/LoxP.
wstrzykniemy komórki ES do zarodków gospodarza, aby stworzyć myszy chimeryczne. Stamtąd wyhodujesz myszy, aby wygenerować myszy przenoszące mutację (transmisję linii zarodkowej). Ta generacja myszy założyciel może być skrzyżowana z myszami, które wyrażają Flpe w celu usunięcia kasety Frt-ed, generując allel warunkowy. Następnie trzeba wykonać kilka kolejnych krzyży, aby wygenerować myszy doświadczalne.

1. od iniekcji komórek ES do dojrzałych płciowo chimer jest czas generacji myszy (3 miesiące).
2. Chimery są hodowane na myszy typu dzikiego w celu ustalenia mutanta w linii zarodkowej (3 miesiące).
3. heterozygotyczne myszy warunkowe frtd są krzyżowane do flpe wyrażających homozygoty. Generuje to flpe/ o, FRTD warunkowe / + potomstwo. (3 miesiące)
4. myszy warunkowe Flpe/o, frtd krzyżuje się do typu dzikiego w celu ustalenia wyciętego allelu w linii rozrodczej i rozmnażania flpe, a wycięcie weryfikuje się molekularnie u tych myszy warunkowych/+ (3 miesiące).
5. myszy warunkowe/+ następnie rozmnażały się ze sobą, tworząc homozygotyczne allele warunkowe myszy (3 miesiące).
6. myszy warunkowe/warunkowe są hodowane do myszy tkankowo-specyficznych-Cre/tissue-specific-Cre, Null/+, aby zrobić eksperymentalne myszy tkankowo-specyficzne-Cre/o, warunkowe/null i kontrolować myszy tkankowo-specyficzne-Cre/o, warunkowe/+.

ponadto należy uzyskać myszy Fple, null, Cre, myszy tissue-specific-Cre/tissue-specific-Cre, null/+.
również allel warunkowy powinien być analizowany w celu określenia, czy jest on dzikim typem w funkcji przed wycięciem z Cre, a null po wycięciu z Cre. Aby ustalić, czy allel warunkowy jest dzikim typem funkcji przed wycięciem, należy zbadać mutanty warunkowe/warunkowe i warunkowe/null w celu ustalenia, czy ich fenotyp jest taki sam jak myszy +/+ i null/+ odpowiednio. Aby ustalić, czy Cre-wycięty warunkowy jest allelem zerowym, warunkowy jest krzyżowany do linii zarodkowej myszy Cre, a warunki wycięte są krzyżowane w celu sprawdzenia, czy fenotyp wyciętego warunkowego / wyciętego warunkowego jest taki sam jak null/null i/lub czy z wyciętego allelu warunkowego nie powstaje żadne białko.
reporter aktywności Cre, jak RosaReporter, lub bardziej idealnie, pokazujący bezpośrednio, że białko będące przedmiotem zainteresowania jest nieobecne w komórkach docelowych przez immunofluorescencję, jest ważną kontrolą. RosaReporter wytwarza trwałą ekspresję beta-galaktozydazy we wszystkich komórkach, które były narażone na Cre.
nadmierna ekspresja kremu może prowadzić do złamania chromosomu, co może powodować fenotypy niezwiązane z funkcją allelu warunkowego. W związku z tym ważną kontrolą Są myszy rodzeństwa, które wykazują ekspresję Cre, ale zachowują pewną funkcję genu (na przykład warunkową/+).