badanie rozszczepiania łańcucha bocznego cholesterolu (20,22 desmolazy) powodującego wrodzony rozrost nadnerczy przy użyciu sond oligodeoksyrybonukleotydowych sekwencji bydlęcej p450scc

Konwersja cholesterolu do Pregnenolon jest pośredniczony przez enzym rozszczepiania łańcucha bocznego cholesterolu (SCC), p450scc. Niedobór aktywności SCC powoduje wrodzony przerost nadnerczy lipoidalnych (znany również jako niedobór desmolazy 20,22), potencjalnie śmiertelny defekt w syntezie wszystkich hormonów steroidowych. W celu wykrycia ewentualnych wad genetycznych powodujących tę chorobę zsyntetyzowano cztery oligodeoksyrybonukleotydy zawierające od 63 do 72 zasad odpowiadających fragmentom sekwencji komplementarnego DNA bydła (cDNA) dla P450scc. Bydlęce oligonukleotydy były znakowane i używane bezpośrednio do badania południowych plam normalnego ludzkiego genomowego DNA, ujawniając wzór wskazujący na istnienie pojedynczego genu P450scc w ludzkim genomie. Hybrydyzacja z północnymi Plamami normalnego ludzkiego i bydlęcego nadnerczowego RNA wskazuje, że p450scc ma około 2,0 kilobazy długości u obu gatunków. Hybrydyzacja oligonukleotydów z genomowym DNA od trzech niepowiązanych pacjentów z niedoborem SCC nie wykryła delecji w ludzkim Genie P450scc. Oligonukleotydy sekwencji bydlęcej wykorzystano następnie do wyizolowania ludzkiego klonu cDNA p450scc. Wyizolowany fragment cDNA P450scc zawiera 818 zasad kodujących 239 aminokwasów białka, sygnał zakończenia translacji i 98 zasad 3 ’ nieprzetłumaczonego regionu. Sekwencja tej karboksy-końcowej połowy ludzkiego białka P450scc jest w 72% homologiczna z sekwencją bydlęcą i zawiera dodatkowy aminokwas nie występujący w bydlęcym P450scc; sekwencje nukleotydowe ludzkie i bydlęce są w 81% homologiczne. Powtórzenie badań genomowego blottingu DNA z sondą cDNA dało takie same wyniki uzyskane z sondami oligonukleotydowymi o sekwencji bydlęcej, potwierdzając, że niedobór SCC nie jest spowodowany delecją w regionach hybrydyzacji P450scc z sondami. Długie, syntetyzowane chemicznie sekwencje heterologiczne oligonukleotydy zawierające nieznaną liczbę niezgodności zasad z sekwencjami ludzkimi mogą być zatem wykorzystywane do badania ludzkich genów, tak aby dostęp do cDNA nie był konieczny do takich badań.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.