badanie chimeryzmu służy do rutynowej dokumentacji wszczepienia i obserwacji po przeszczepie u biorców przeszczepu allogenicznego. Komórki dawcy i biorcy można odróżnić poprzez testowanie markerów genetycznych, które są ustalane przed przeszczepem.2 w przeszczepach nieprzystosowanych do płci, gdy biorca i dawca są różnej płci, proporcja komórek żeńskich i męskich jest zwykle określana na podstawie analizy markerów chromosomów płciowych, najczęściej u ryb.8,9 ocena zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) lub krótkich powtórzeń tandemowych (STR) metodą PCR stała się najcenniejszą metodą oznaczania chimeryzmu w przeszczepach dopasowanych do płci.Opracowano 10 różnych metod wykrywania MRD. Analiza morfologiczna szpiku może zidentyfikować choroby resztkowe zajmujące więcej niż 5% przestrzeni szpiku, a tym samym brakuje niezbędnej czułości do wczesnego wykrywania. Ponadto, często trudno jest odróżnić małą populację blast białaczki od normalnych dawców pochodzących blastów krwiotwórczych repopulating szpiku bez użycia dodatkowych markerów. Specyficzne testy mogą wykryć MRD, gdy istnieje specyficzny marker nowotworowy, taki jak specyficzna nieprawidłowość cytogenetyczna, specyficzny immunofenotyp, który może być zidentyfikowany przez FACS, specyficzne sekwencje DNA lub RNA, które mogą być amplifikowane przez PCR lub specyficzny wzorzec wzrostu w testach klonogennych. W przypadku braku specyficznego markera nowotworowego dla MRD, badanie chimeryzmu może być użyte do wykrycia komórek pochodzących od biorcy. Wykrycie komórek pochodzących od biorcy nie zawsze może korelować z ryzykiem nawrotu choroby. Komórki biorcy przyczyniające się do mieszanego chimeryzmu (MC) należą do złośliwego klonu lub mogą być normalnymi komórkami krwiotwórczymi, a nawet komórkami zrębowymi. W ciągu pierwszych kilku tygodni po standardowym allogenicznym przeszczepieniu komórki biorcy mogą być nadal wykrywane, gdy stosowane są czułe testy.9,11 są to głównie limfocyty T, które przetrwały schemat kondycjonowania. Komórki gospodarza mogą być wykrywane na niskim poziomie (<1%), nawet w późniejszym okresie po przeszczepieniu. MC jest wykrywany częściej po kondycjonowaniu nie-mieloablacyjnym.2 Tak więc sondy markerów specyficznych dla guza są prawdopodobnie lepsze i dokładniejsze niż sondy niedopasowania płciowego do wykrywania MRD.Jednakże nawet wykrycie MRD przy użyciu testów specyficznych dla guza nie zawsze może być skorelowane z ryzykiem nawrotu choroby. Pozytywne testy PCR na obecność BCR / ABL odnotowano u zdrowych osób.Translokację t (14;18) wykryto w liniach innych niż limfocyty B u pacjentów z chłoniakiem nieziarniczym.14 może istnieć próg, w którym MRD ma znaczenie kliniczne. W kilku chorobach, takich jak AML z t (8;21), obserwowano 15 długotrwałych remisji w obecności MRD wykrytego przez PCR, podczas gdy w innych, takich jak ostra białaczka promielocytowa, dodatni wynik PCR przewiduje nawrót choroby.Ponownie, może to być związane z wrażliwością konkretnego testu PCR i progiem na znaczenie kliniczne. Szczątkowe komórki nowotworowe mogą być w stanie uśpionym17, nie mogąc przyczynić się do nawrotu choroby z powodu braku lub wzmocnienia drugiej zmiany genetycznej. W niektórych chorobach może wystąpić częściowe różnicowanie do bardziej dojrzałych komórek i komórki te mogą nie mieć potencjału do proliferacji. MRD może być pod nadzorem immunologicznym, lub komórki MRD być w fazie apoptotycznej czyniąc je nieistotne dla nawrotu choroby. Czułe testy PCR nie zachowują morfologii komórkowej, dlatego nie jest jasne, które komórki korelują z MRD w tych różnych warunkach.
System Duet™ do połączonej jednoczesnej analizy morfologicznej i cytogenetycznej wieloparametrycznej oferuje kilka zalet, które mogą pomóc w ujawnieniu znaczenia wykrywania MRD. System ten Automatycznie przeszukuje dużą liczbę komórek (około 150000 komórek na slajd) w poszukiwaniu małych podzbiorów komórkowych o unikalnym fenotypie cytogenalnym lub immunologicznym. Zwiększa się wrażliwość na wykrywanie małych populacji. W serii eksperymentów rozcieńczania wykazaliśmy, że czułość wykrywania męskiej komórki w żeńskiej populacji komórek jest wyższa niż 1:50000, jednak ze względu na ograniczoną swoistość w tym mianie, najlepsze wykrywanie występuje między 1:10000 i 1:50000 (patrz dodatek). Jak widać w analizie próbek szpiku kostnego od pacjenta 1 (Ostatnia analiza) i pacjenta 2, System Duet ™ mógł wykryć bardzo małe populacje komórek biorcy XY, które nie zostały wykryte przez rutynowe ryby. Dokładność ilościowa ryb zależy od obserwowanej częstotliwości i liczby ocenianych komórek, co poprawia się poprzez punktowanie większej liczby komórek.18 punktowanie tak dużej liczby komórek nie jest praktyczne w przypadku ręcznego pomiaru ryb, ale automatyczny system Duet™ jest w stanie skanować 10000 komórek/min w mikroskopii jasnego pola i 2000-10000 komórek/h w mikroskopii fluorescencyjnej, wspierając tym samym potrzebę szybkiego i skutecznego skanowania oraz zwiększonej czułości.
czułe testy są często związane ze zmniejszoną swoistością i stosunkowo wysokim wskaźnikiem fałszywie dodatnich wyników. W przypadku standardowych ryb może wystąpić fałszywie dodatni wynik z powodu niespecyficznej hybrydyzacji sondy. Fałszywie dodatnia ocena translokacji chromosomów może wystąpić z powodu losowego skojarzenia przestrzennego i fuzji optycznej.System Duet™ może potencjalnie poprawić swoistość poprzez identyfikację morfologii komórek w badanej populacji. Wykrycie pozytywności ryb, w małej populacji, ale z jednolitym wyglądem morfologicznym Duet™ sprawia, że jest ona bardziej prawdopodobna jako prawdziwa pozytywna, niż gdy komórki dodatnie są rozproszone w różnych, niepowiązanych liniach. Można również poprawić specyficzność wykrywania MRD z niespecyficznym testowaniem chimeryzmu. Jak omówiono powyżej, komórki biorcy mogą należeć do złośliwego klonu (jak u pacjenta 1), mogą być normalnymi komórkami krwiotwórczymi (pacjent 3, pacjent 1 po leczeniu STI571) lub komórkami nie-krwiotwórczymi/zrębowymi (takimi jak osteoblasty, pacjent 2). System Duet ™ umożliwia różnicowanie tych opcji poprzez wygląd morfologiczny. Wykazaliśmy w analizie pacjenta 1 i dwóch dodatkowych pacjentów (dane nie pokazane), że identyfikacja cech biorcy (takich jak cytogenetyka przeciwnej płci) w blastach lub niedojrzałych komórkach przewiduje jawny nawrót choroby i poprzedza go o kilka tygodni do kilku miesięcy. W osobnych analizach Fish u pacjenta 1 wykazano małą populację biorców XY (0,6%) oraz małą populację z dodatnim wynikiem BCR/ABL (0,8%), co można było uznać za odsetek wyników fałszywie dodatnich w analizie FISH. Jednak System Duet ™ wykazał, że duża część komórek biorcy XY miała blasty (a także wynik BCR/ABL dodatni w wyniku drugiego testu FISH na tych samych komórkach) i w ten sposób mógł przewidzieć, że pacjent jest przeznaczony do nawrotu. Identyfikacja małej populacji biorców w dojrzałych komórkach krwiotwórczych może nie przewidywać nawrotu choroby. U trzech dodatkowych pacjentów (brak danych) udokumentowano ciągłą remisję w obecności małej populacji biorców o dojrzałej morfologii. Konieczne są badania na większą skalę z dłuższą obserwacją w celu potwierdzenia związku między morfologią szczątkowych komórek gospodarza a ryzykiem nawrotu choroby u pacjentów bez innych unikalnych markerów dla złośliwego klonu.
system jest stosunkowo prosty w obsłudze, jest w większości automatyczny, jego czas i koszty są porównywalne z innymi systemami do wykrywania chimeryzmu i MRD, takimi jak standardowe ryby i PCR i może być odpowiedni do testowania na dużą skalę. Poza sprzętem i zestawami systemu potrzebne jest jedynie standardowe wyposażenie łatwo dostępne w dużych laboratoriach (zob. dodatek).
w ostatnich latach badania nad chimeryzmem w różnych podzbiorach komórkowych zyskały zainteresowanie i popularność.19,20 ma to ogromne znaczenie po przeszczepach nie-mieloablacyjnych.W niektórych grupach wykazano, że do indukcji GVL wymagany jest całkowity chimeryzm w obrębie limfocytów T, dlatego MC w tej podgrupie komórkowej może wiązać się ze zwiększonym ryzykiem nawrotu, zwłaszcza agresywnych, szybko rosnących nowotworów złośliwych.2,19 badanie chimeryzmu podzbiorów komórkowych wymaga uciążliwego i czasochłonnego sortowania komórek z teoretycznym potencjałem utraty niektórych komórek podczas tego procesu. Jak omówiono w dodatku, przygotowanie szkieł do analizy Duet™ nie powoduje utraty lub zmniejszenia jakiejkolwiek populacji komórkowej. System Duet™ wykorzystuje MGG stained slide do lokalizowania limfocytów i innych podzbiorów komórkowych, a także może wykorzystywać plamy immunocytochemiczne (takie jak przeciwciała monoklonalne anty-CD3) do lokalizowania tych komórek. W drugiej fazie, ryby mogą być stosowane do badania chimeryzmu w przeszczepach niedopasowanych płciowo. Prezentacja przypadku pacjenta 3 pokazuje, w jaki sposób system był używany do śledzenia chimeryzmu u pacjenta po przeszczepieniu nie-mieloablacyjnym oraz jak konwersja do całkowitego chimeryzmu po odstawieniu cyklosporyny przewidywała wystąpienie odpowiedzi GVHD i GVT.
niniejszy raport koncentruje się na zastosowaniu preparatu Duet™ po przeszczepieniu szpiku kostnego, jednak może istnieć wiele innych konsekwencji. System może również pomóc w badaniu komórek i linii, które zawierają unikalny marker cytogenetyczny lub immunofenotypowy, taki jak fuzja BCR/ABL (jak u pacjenta 1) i korelować ich morfologię z ryzykiem nawrotu choroby po standardowej chemioterapii. Może to pomóc w ujawnieniu charakteru MRD w różnych nowotworach i dlaczego wykrywanie MRD nie zawsze jest predykcją nawrotu choroby. W pewnych warunkach można szukać małych populacji komórek dawców lub mikrochimeryzmu. Na przykład ogólnoustrojowy mikrochimeryzm limfo-krwiotwórczy wykryty po przeszczepieniu narządów stałych może przewidywać tolerancję na przeszczepiony narząd i kierować terapią immunosupresyjną.W podobny sposób można również wykryć małą populację matek zanieczyszczającą przeszczepy allogeniczne krwi pępowinowej, co może mieć wpływ na ryzyko GVHD po transplantacji.
podsumowując, dodając analizę morfologiczną małych populacji komórek z nowotworami złośliwymi lub markerami związanymi z biorcą, System Duet™ może poprawić dokładność badań chimeryzmu i MRD oraz określić ich znaczenie kliniczne. System ten zasługuje na dalsze badania w badaniach na większą skalę.