aktywacja proteazy ClpP wynika z reorganizacji sieci oddziaływań elektrostatycznych w porach wejściowych

tryb wiązania ACP1 do Eccpp

w celu wyjaśnienia podstaw strukturalnych aktywacji ClpP przez ACP128, struktury nmclpp i Eccpp (Fig. 1A) w kompleksie z analogami ACP1 poszukiwano. Podczas gdy struktura NmClpP z wiązaniem ACP1 nie została osiągnięta pomimo wielokrotnych prób, struktura kompleksu EcClpP+ACP1-06 została ustalona na rozdzielczość 1,9 Å (rys. 1b, C, Tabela 1), zawierający tetradekamer w jednostce asymetrycznej (Łańcuchy A-N). Gęstość elektronów dla N-końcowych reszt tworzących pętle osiowe EcClpP jest niejasna we wszystkich oprócz jednej podjednostce (Łańcuch B). W wcześniej opublikowanych strukturach te pętle osiowe są bardzo elastyczne i są zwykle nieuporządkowane w krysztale w przypadku braku aktywatorów lub przez wykluczenie przez pakowanie kryształów23. Jednoznaczna gęstość elektronów została zaobserwowana dla pojedynczej cząsteczki ACP1 – 06 w kieszeni utworzonej przez podjednostki D i E, pokazując dwie różne konfiguracje związku (Fig. 2a, b). Obie konfiguracje były modelowane w gęstości elektronów, w której pierwsza konfiguracja umieszcza część trifluorometylopirydynową związku w kieszeni hydrofobowej (konfiguracja w dół), podczas gdy druga pozycjonuje ją poza kieszenią hydrofobową wystawioną na działanie rozpuszczalnika (konfiguracja w górę) (Fig. 2A). Pozostałe 13 kieszonek hydrofobowych wykazuje niejednoznaczną gęstość elektronów dla ACP1-06. Modelowaliśmy i udoskonalaliśmy wszystkie 14 cząsteczek ACP1-06 w konfiguracji zarówno w górę, jak iw dół przy zajętości 0,5, co skutkowało lepszą gęstością elektronów dla każdego ligandu.

tryby wiązania acp1 – 06 (rys. 2B-d) przybliżone wartości ADEPs obserwowane w strukturach krystalicznych różnych bakteryjnych ClpPs (Fig. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Zauważ, że związki syntetyzowane przez naszą grupę są numerowane jako ACP1-YY i ADEP-YY, podczas gdy związki z badań innych grup są nazwane tak, jak w odpowiednich opublikowanych artykułach. Wszystkie kontakty białkowe z ACP1 – 06 mają charakter niepolarny, z wyjątkiem dwóch zauważalnych wiązań elektrostatycznych, które występują między (1) fenolowym hydroksylowym łańcuchem bocznym Y76 i amidowym tlenem ACP1-06 oraz (2) guanidynylowym łańcuchem bocznym R206 (przedostatni Arg w Eccpp) i sulfonylowym tlenem ACP1-06 (Fig. 2b). Te dwa ostatnie interakcje są obecne w obu konfiguracjach ACP1-06. Ponadto R206 (Łańcuch E)jest stabilizowany przez wiązanie jonowe z E65 sąsiedniej podjednostki (Łańcuch D) (Fig. 3a, b).

w konfiguracji dolnej Grupa trifluorometylopirydynowa acp1 – 06 zajmuje hydrofobową jamę utworzoną przez L62, T93 i F96 (Łańcuch D) oraz Y74, Y76, I104, L203 i L128 (Łańcuch E) (Fig. 2b i 3b). Jest to ta sama Wnęka zajmowana przez pierścień egzocyklicznej pozostałości Phe różnych analogów ADEP zakrystalizowanych ClpP, takich jak w naszym NmClpP+ADEP-0419 (Fig. 2e, f) lub struktury Eccpp+ADEP140 (rys. 2c, d). Natomiast w konfiguracji up, ugrupowanie trifluorometylopirydynowe obraca się wokół wiązania C-S i jest narażone na działanie rozpuszczalnika podczas kontaktów van der Waalsa z Y74, I104, F126 i L203 (Łańcuch E) (Fig. 2b i 3b). Ugrupowanie gem-dimetylowe układa się na płaskim pierścieniu y74 (Łańcuch E), podczas gdy rozszerzony łańcuch alifatyczny kończący się Orto-chloro-podstawionym pierścieniem fenylowym znajduje się w niepolarnym rowku między dwiema helisami z sąsiednich podjednostek (Fig. 3b). Ta szczelina wiążąca jest utworzona przez L62 (Łańcuch D), F63 (Łańcuch D), A66 (Łańcuch D), L37 (Łańcuch E), V42 (Łańcuch E) i niepolarną część E40 (Łańcuch E) (Fig. 2b i 3b).

zarówno w strukturach Eccpp związanych z ACP1-06, jak i adep1, wewnątrzsubunitowy mostek solny między R36 a E40 znajduje się, gdzie pobliski alifatyczny ogon ADEP1 lub podstawiony chloro pierścień fenylowy ACP1 – 06 tworzy hydrofobową interakcję z łańcuchem bocznym E40 (Fig. 3b, c). Dwa aktywatory są dodatkowo stabilizowane w miejscu hydrofobowym przez dwa odrębne wiązania wodorowe. Podczas gdy ACP1-06 jest zabezpieczany przez narażoną na działanie rozpuszczalnika interakcję jonową między grupą sulfonylową A C-końcową pozostałością R206 (Fig. 3b), ADEP1 jest utrzymywany w miejscu przez dwa wiązania wodorowe z grupą hydroksylową Y76 w miejscu hydrofobowym (Fig. 3c). Wiązanie wodorowe z udziałem rozpuszczalnika między E65 a grupą karbonylową łańcucha bocznego Adep1 N-acylo-Phe dodatkowo wzmacnia jego interakcję z EcClpP (Fig. 3c). To dodatkowe wiązanie wodorowe, jak również większy rozmiar cyklicznego pierścienia depsipeptydowego, który ma większą powierzchnię, z którą tworzy się interakcje van der Waalsa w porównaniu z mniejszą grupą trifluorometylopirydynową acp1, może odpowiadać za ogólnie ściślejsze Wiązanie obserwowane dla adeptów niż ACP1s28.

w strukturze EcClpP + ACP1-06 znaleźliśmy niewyjaśnioną gęstość elektronów we wszystkich 14 podjednostkach rozciągających się od reszty nukleofilowej S111 triady katalitycznej, co sugeruje modyfikację kowalencyjną (Fig. 1a, b). Gęstość rozciąga się w przybliżeniu pod kątem prostym w przeciwnych kierunkach od łańcuchów bocznych S111. Pomimo rozległych wysiłków, nie można było przekonująco wyposażyć go w peptydy, produkty acyloketonowe lub różne znane cząsteczki inhibitora proteazy serynowej.

tryb wiązania ADEP do NmClpP

NmClpP ma krótszą sekwencję pro na końcu n, podczas gdy ma cztery dodatkowe pozostałości na końcu C w porównaniu do EcClpP (Fig. 1a). Chociaż nmclpp wyrażano jako pełnowymiarowe białko niosące N-końcowy znacznik His6, wielokrotnie obserwowaliśmy brak wiązania z żywicą kwasu Ni-nitrylotrioctowego. N-końcowe sekwencjonowanie oczyszczonego białka wykazało, że dojrzały nmclpp rozpoczyna się od reszty Y6 (Fig. 1a), wskazując na autoproteolizę w celu uwolnienia N-końcowej sekwencji pro (1MSFDN5).

wcześniej ustaliliśmy strukturę NMCLPP za pomocą ADEP-0419. W tym badaniu określiliśmy strukturę apo-nmclpp do 2,0 Å i NmClpP z wiązaniem ADEP – 14 do 2,7 Å (Fig. 1B, C, dodatkowe rys. 1c, Tabela 1). Struktura apo-NmClpP zawiera tetradekamer w jednostce asymetrycznej i nie wykazuje wyraźnej gęstości dla żadnej z 14 N-końcowych pętli osiowych. Słaba gęstość elektronów jest obserwowana dla pętli utworzonych przez reszt G133-G137 w nici β8 regionu uchwytu (Fig. 1a). Jednostka asymetryczna dla kryształu NMCLPP + ADEP-14 zawiera dwa tetradekamery (dodatkowe rys. 1d). Nie zaobserwowano gęstości elektronów dla reszt 1-22 wszystkich 28 podjednostek z powodu upakowania kryształów (Fig. 1C, dodatkowe rys. 1d). Ponadto nici β8 (pozostałości 130-137; Fig. 1a) jest tylko częściowo widoczny we wszystkich podjednostkach. ADEP-14 jest związany z NmClpP w podobnej konfiguracji jak ADEP-04 (Fig. 2e, f i 3e, f). Krótko mówiąc, ugrupowanie difluorofenylowe adep-14 zajmuje kieszeń hydrofobową utworzoną przez Y67, L95, L97 i l119 jednej podjednostki oraz V49, L53, T84 i F87 sąsiedniej podjednostki (Fig. 3e). Sześcioczłonowy pierścień grupy kwasu pipekolowego jest narażony na działanie rozpuszczalnika i stabilizowany przez pierścień fenylowy F117 i hydrofobowe łańcuchy boczne L97, L119 i L196 (Fig. 3e). Dodatkowe podstawienie metylowe na pozostałościach allo-treoniny pierścienia depsipeptydowego (Fig. 1b) jest narażony na działanie rozpuszczalnika. Podobnie jak ADEP-04, ADEP-14 jest zabezpieczony w wysoce komplementarnej kieszeni hydrofobowej przez dwie interakcje wiązania wodorowego między fenolową grupą hydroksylową Y67, grupą aminową reszty difluorofenyloalaniny i grupą karbonylową alaniny w pierścieniu depsipeptydowym i wiązaniem wodorowym z E56, w którym pośredniczy rozpuszczalnik (Fig. 3e, f). Łańcuch boczny kwasu oktadienowego adep-14 znajduje się w wąskim kanale hydrofobowym utworzonym przez L53, F54 i S57 jednej podjednostki oraz R27, L28, E31, I33, F35 i Y67 sąsiedniej podjednostki (Fig. 3e).

Wiązanie ACP1 i ADEP skutkuje wyraźnym allosterycznym wpływem na beczkę ClpP

przy użyciu struktur APO – i złożonych form Eccpp i NmClpP (Fig. 1C), zbadaliśmy allosteryczne efekty, które występują podczas wiązania aktywatora. Jak pokazano na rysunku uzupełniającym. 2, Wiązanie aktywatora działa jak klin, powodując boczne przemieszczenie dwóch sąsiednich podjednostek. Zakres globalnych zmian konformacyjnych spowodowanych wiązaniem ACP1-06 (Rmsd = 0,84 Å w stosunku do apo-Eccpp) jest podobny do tego dla ADEP-04 (rmsd = 0.73 Å w stosunku do apo-nmclpp), ale mniej niż dla ADEP-14 (rmsd = 2,47 Å w stosunku do apo-nmclpp). Co ciekawe, kierunek przemieszczenia jest różny w obu klasach aktywatorów (dodatkowe rys. 2 oraz Filmy uzupełniające 1-4). Pomiędzy dwoma Adepami, ADEP-14 powoduje większe ogólne zakłócenia strukturalne w cylindrze NmClpP (porównaj dodatkowe filmy 3 vs. 4). Wiązanie ADEP powoduje rozszerzenie powierzchni wierzchołkowej NmClpP, któremu towarzyszy zwężenie w rejonie równikowym. Pivot dla tego ruchu znajduje się w regionie rękojeści złożonym z helisy AE i nici β8. Zjawisko to obserwuje się we wszystkich znanych do tej pory strukturach clpp związanych z ADEP, z różnym stopniem zagęszczenia cylindra Clpp15,18,19,23,40. Natomiast Wiązanie ACP1-06 do Eccpp powoduje ruch do wewnątrz wszystkich podjednostek skutkujący dokręceniem cylindra ClpP (film dodatkowy 1). Tak więc struktury pokazują, że ACP1s i ADEPs aktywują ClpP, indukując różne efekty allosteryczne.

w strukturach Eccpp i nmclpp związanych z aktywatorem, wiązania elektrostatyczne między pierścieniem a pierścieniem, które stabilizują tetradekamer, pozostają zachowane pomimo zmian konformacyjnych (dodatkowe rys. 3). Ponadto, niezależnie od globalnej zmiany strukturalnej po wiązaniu aktywatora, triady katalityczne ser-his-Asp Eccpp i NmClpP zachowują katalitycznie właściwe geometrie, ponieważ tylko niewielkie przesunięcia szkieletu ca występują w pobliżu miejsca aktywnego (dodatkowe rys. 1a-c). Analiza wszystkich istniejących struktur clpp związanych z ACP1 i ADEP pokazuje, że Wiązanie związków powoduje również skurcz regionu równikowego (Fig. 4).

obliczyliśmy zagęszczenie butli ClpP po związaniu ACP1 lub ADEP, mierząc objętość odpowiednich komór katalitycznych (dodatkowe rys. 4). Wiązanie ACP1-06 powoduje ~ 5% spadek objętości komory katalitycznej w stosunku do apo-Eccpp. Wiązanie ADEP1 z Eccpp powoduje podobny spadek objętości komory katalitycznej. Obserwuje się to również w przypadku innych struktur ClpP związanych z aktywatorem, takich jak nmclpp związany z ADEP-14, bsclpp związany z adep i Kompleks heteroligomeryczny związany z Adep MtClpP1P2 (Fig. 4).

aktywacja ClpP powoduje reorganizację sieci wiązania elektrostatycznego w porach osiowych

w strukturze apo-nmclpp dwa wiązania elektrostatyczne w pobliżu porów osiowych stabilizują interfejs dowolnych dwóch sąsiednich podjednostek (rys. 3d, dodatkowe rys. 5). Po pierwsze, ujemnie naładowana Grupa karboksylowa E58 jednej podjednostki tworzy parę jonową z dodatnio naładowaną grupą guanidyniową R27 sąsiedniej podjednostki. Po drugie, grupy hydroksylowe S57 i karboksylowe E31 dwóch sąsiednich podjednostek tworzą wiązanie wodorowe. Po wiązaniu ADEP, te dwa wiązania niekowalencyjne pękają, podczas gdy wiązanie jonowe między R27 i E31 tej samej podjednostki jest skrócone, tzn. wzmocnione (rys. 3e, f). W apo-Eccpp tylko jedno wiązanie jonowe między E67 i R36 łączy dwie sąsiednie podjednostki, ponieważ równoważna pozostałość S57 NmClpP jest alaniną w Eccpp i dlatego nie jest w stanie utworzyć wiązania wodorowego z E40 (Fig. 3A). Podobnie jak w NmClpP, Wiązanie ACP1 lub ADEP1 z EcClpP eliminuje wiązanie jonowe intersubunit E67-R36 i powoduje powstanie silniejszego wiązania intrasubunit jonowego między R36 a E40 (Fig. 3b, C, dodatkowe rys. 5).

aby dokładniej zweryfikować te obserwacje, zaprojektowaliśmy mutanty punktowe Nmclpp i EcClpP, które prowadzą do utraty powyższych wiązań elektrostatycznych intersubunit. Jak pokazano na Fig. 4a, podczas gdy WT NmClpP nie był w stanie degradować kazeiny białkowej, stwierdzono, że mutant NMCLPP E58A degraduje kazeinę w wyższym tempie niż mutant e31a. Co ważne, podwójny mutant E31A + E58A miał jeszcze większą aktywność niż pojedyncze mutanty. Stopień aktywacji podwójnego mutanta nmclpp jest podobny do obserwowanego w obecności 1 µM ADEPs lub 10 µM ACP1s (Fig. 4a). Podobne zachowanie zaobserwowano w przypadku EcClpP z podobnymi mutacjami (E40A i E67a; Fig. 4B). Odpowiedni podwójny mutant EcClpP nie jest rozpuszczalny i nie może być badany.

następnie oznaczono struktury rentgenowskie mutantów nmclpp E58A i nmclpp E31A + e58a (Tabela 1). Miejsca katalityczne w obu mutantach nie są zaburzone (dodatkowe rys. 1e). W pojedynczym mutancie nmclpp E58A mutacja znosi wiązanie jonowe intersubunit E58–R27 i powoduje silniejszą interakcję intrasubunit R27–E31, podczas gdy wiązanie wodorowe między S57 i E31 pozostaje (Fig. 4c). Podobny „efekt klina” obserwuje się więc w strukturze, co pokazuje subtelna globalna zmiana konformacyjna w szkielecie ca mutanta nmclpp (rmsd = 0,33 Å w stosunku do WT NmClpP) (film dodatkowy 5). Mutacja zarówno E31, jak i E58 do alaniny w celu wytworzenia podwójnego mutanta NMCLPP E31A + E58A (Rmsd = 0,29 Å w stosunku do WT NMCLPP) znosi dwie stabilizujące interakcje elektrostatyczne intersubunit, jak również wiązanie jonowe R27–E31 intrasubunit obecne w pojedynczym mutancie nmclpp E58A (Fig. 4D i Film uzupełniający 6) oraz w adep-bound NmClpP (rys. 3e, f). Tak więc, podwójny mutant NMCLPP E31A + e58a różni się od nmclpp związanego ADEPEM z wyeliminowanym wiązaniem wewnątrzcząsteczkowym jonowym, ale mimo to jest aktywowanym białkiem o wewnętrznej aktywności proteolitycznej porównywalnej z aktywowanym przez małe cząsteczki ClpP (Fig. 4a). Podobnie jak nmclpp związany z ADEP, zarówno pojedyncze, jak i podwójne mutanty NmClpP mają zmniejszoną objętość komory katalitycznej z powodu zagęszczania beczek ClpP (dodatkowe rys. 4).

taka reorganizacja sieci wiązania jest obserwowana dla wszystkich aktywowanych struktur ClpP dostępnych w PDB, czy to w obecności aktywatorów małocząsteczkowych, czy z powodu specyficznych mutacji (dodatkowe rys. 6). Na przykład, drobnocząsteczkowe Wiązanie aktywatora z B. subtilis ClpP (Bsclpp), S. aureus ClpP (SaClpP), M. tuberculosis ClpP (MtClpP) i Homo sapiens ClpP (HsClpP) znosi jedno lub dwa intersubunit elektrostatyczne wiązania w pobliżu osiowego poru i powoduje silniejszą interakcję międzysubunit jonową (dodatkowe rys. 6a–e, g-l)6,15,18,21,39. W MtClpP2 intersubunit jonowe Wiązanie równoważne interakcji E58-R27 w Nmclpp18 nie istnieje. Równoważną pozostałością dla E58 nmclpp jest L66 w MtClpP2 i nie może uczestniczyć w interakcji jonowej z K35 MtClpP2 (odpowiednik R27 NmClpP). Zamiast tego, intersubunit wiązanie wodorowe między S65 i E39 stabilizuje interfejs (dodatkowe rys. 6g, h). Wiązanie ADEP z MtClpP2 przerywa wiązanie wodorowe S65-E39 i wzmacnia wiązanie jonowe intrasubunit między K35 a E3918.

co ciekawe, nawet aktywowany wariant SaClpP Y63A41, z aktywującą mutacją znajdującą się w centrum miejsca hydrofobowego, a zatem nie równoważny z aktywującymi mutacjami nmclpp przedstawionymi tutaj, wspiera nasz proponowany model reorganizacji sieci wiązania wodorowego wokół osiowego poru po aktywacji ClpP (dodatkowe rys. 6f). W strukturze mutanta SaClpP Y63A zwiększa się odległość między parą jonów intersubunit (Q54-R23), podczas gdy mostek solny intrasubunit (R23–D27) jest wzmocniony (dodatkowe rys. 6d, f). Wygenerowaliśmy również równoważną mutację Y63A zarówno w Eccpp, jak i NmClpP. Mutant NMCLPP Y67A był nierozpuszczalny, podczas gdy EcClpP Y76A miał aktywność nieco wyższą niż mutant e40a, ale niższą niż mutant e67a (Fig. 4B).

aktywacja ClpP skutkuje zmniejszeniem strukturalnej heterogeniczności N-końcowych pętli osiowych

jak omówiono powyżej, w uporządkowanej pętli osiowej kompleksu NmClpP+ADEP–04 tworzącego zwrot Szpilki β1-β2, Wiązanie ADEP uwalnia R27 z wiązania międzysubunit jonowego z E58 i wzmacnia Wiązanie intrasubunit jonowe z E31 helisy aA (Fig. 5A). W konsekwencji R27 tworzy wiązanie jonowe z D23 nici β1 pętli osiowej. Ta stabilizująca interakcja jest obserwowana we wszystkich strukturach związanych z aktywatorem ClpP, gdzie są uporządkowane pętle osiowe (rys. 5a-e).

dla struktury EcClpP+ACP1-06, pętle osiowe (pozostałości 14-31)są częściowo uporządkowane w krysztale z tylko 1 z 14 pętli osiowych tworzących zwrot spinki do włosów β1–β2 (Fig. 1C-całkowite zamówienie wydaje się być częściowo uniemożliwione przez efekty pakowania kryształów). W uporządkowanej pętli osiowej podjednostki a uwolnienie R36 z międzysubukowego wiązania jonowego z E67 pozwala na utworzenie silniejszego wewnątrzsubukowego wiązania jonowego z E40 helisy aA (rys. 5f). Jednak nie ma stabilizującego oddziaływania jonowego między E22 nici β1 i R36 helisy aA, prawdopodobnie z powodu częściowego uporządkowania (Fig. 5f). Dodatkowe wiązanie wodorowe między D32 nici β2 i S21 helisy aA zakotwicza pętlę osiową do domeny rdzenia EcClpP (rys. 5f). Podobnie pętle osiowe w strukturze Enterococcus faecium ClpP (EfClpP) – ADEP4 są tylko częściowo uporządkowane21. Zachowane wiązanie wodorowe pomiędzy pozostałością ARG helisy aA a ujemnie naładowaną pozostałością nici β1 nie jest widoczne w częściowo uporządkowanych pętlach osiowych EfClpP, chociaż EfClpP ma potencjalne wiązanie wodorowe tworzące pozostałości na nici β1 (T6) i na pętlach łączących nici β1 i β2 (E9, Q10, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

poza zachowanymi oddziaływaniami elektrostatycznymi, rozległe kontakty hydrofobowe z domeną głowicy ClpP stabilizują pętle osiowe. W EcClpP+ACP1-06, niepolarne N-końcowe pozostałości nici β1 i poprzedzającej cewki strukturalnej uczestniczą w hydrofobowych interakcjach z niepolarnymi pozostałościami helisy aA tej samej podjednostki oraz na hydrofobowych powierzchniach helisy aA’ i aB’ sąsiedniej podjednostki (dodatkowe Fig. 7a). Niepolarne pozostałości na helisach aA, aB 'i β3′ tworzą ciągłą hydrofobową łatę na obwodzie osiowego poru (dodatkowe rys. 7b) 15.

aby uzyskać jaśniejszy obraz heterogeniczności konformacyjnych pętli osiowych ClpP, przeprowadzono eksperymenty z NMR metodą metylo-TROSY. Początkowo wprowadzono pojedynczą mutację cysteiny w pętlach osiowych NmClpP (T10C). Jednorodnie deuterowane białko zostało wytworzone, a następnie poddane reakcji z 13C-metylo-metanotiosulfonianem (MMTS). Powoduje to przyłączenie pojedynczej NMR widocznej grupy 13ch3-s do łańcucha bocznego cysteiny, co prowadzi do powstania pozostałości s-metylotio-cysteiny (MTC) 42. Metoda ta zapewnia łatwy sposób monitorowania struktury i dynamiki dużych kompleksów w roztworze. Monitorowanie korelacji NMR dołączonej sondy spin w wolnych, związanych z aktywatorem lub zmutowanych formach enzymu zapewnia odczyt konformacji roztworu porów osiowych.

początkowo przeprowadzono eksperymenty kontrolne, aby upewnić się, że wprowadzenie ugrupowania t10mtc nie zaburza struktury NmClpP. Krótko, 1h–13C heteronuclear multiple quantum coherence (HMQC) korelacje WT i t10mtc nmclpp oznakowane 13ch3 w łańcuchu bocznym reszt ILVM w skądinąd w pełni deuterowanym tle porównano i stwierdzono, że są praktycznie identyczne. Następnie uzyskano korelacje HMQC 1h-13c nmclpp T10MTC w różnych stanach (Fig. 6a). Forma apo (niebieskie kontury) ma dużą liczbę korelacji, wskazując strukturalnie niejednorodne pętle osiowe. Dodanie dwukrotnego nadmiaru molowego adep – 28 (aktywność podana na Fig. 4a) nad Monomerycznym ClpP znacznie zmniejszyła się liczba korelacji (czerwonych konturów), wskazujących na sztywność lub uporządkowanie strukturalne. Natomiast Wiązanie ACP1-17 (Dwukrotna nadwyżka molowa nad monomerycznym ClpP; aktywność podana na Fig. 4A) powoduje niewykrywalne zmiany obserwowanych korelacji (zielone kontury), co oznacza, że pętle osiowe nie są naruszone.

podejście to zostało również wykorzystane do monitorowania wpływu mutacji aktywujących (rys. 4A, b) na pętlach osiowych. W eksperymentach tych wprowadzono mutacje aktywujące w tle mutacji t10c (oznaczającej). Jak pokazano na Fig. 6A, korelacje mutanta nmclpp t10mtc/e31a (czerwone kontury) są nieco mniej heterogeniczne niż forma pseudo WT, podczas gdy korelacje mutanta nmclpp t10mtc/E58A (pomarańczowe kontury) są praktycznie niezmienione. Jednoczesna obecność obu mutacji aktywujących (NmClpP T10MTC / E31A + E58A) ma znacznie bardziej dramatyczny efekt niż pojedyncze mutacje i usuwa dużą liczbę korelacji odpowiadających pętlom osiowym (czarne kontury). Jest to zgodne z obserwacją, że podwójny mutant jest bardziej aktywny niż pojedynczy Mutant (rys. 4a).

aktywacja ClpP skutkuje zmniejszeniem heterogeniczności konformacyjnej regionu uchwytu

to samo podejście oparte na NMR zastosowano do badania wpływu wiązania aktywatora i mutacji na region uchwytu. Mutant i144mtc (helix AE) nmclpp został przygotowany i zbadany przez NMR w postaciach związanych z APO-, ADEP-28-i ACP1-17. Apo-forma (niebieskie kontury, rys. 6A) wykazuje parę pików, co wskazuje, że region uchwytu jest związany z parą współistniejących konformacji, jak widać w naszej poprzedniej pracy na EcClpP4. Co ciekawe, dodanie ACP1 i ADEP prowadzi do zaniku jednego ze szczytów. Biorąc pod uwagę, że miejsce wiązania aktywatora jest dystalne do sondy spinowej NMR, wydaje się, że allosterycznie Wiązanie ACP1 lub ADEP wybiera jedną z konformacji w regionie uchwytu. Alternatywnie, aktywatory mogą być w stanie związać obie formy, ale indukować zmianę do jednego stanu.

eksperymenty wymiany magnetyzacji z okresami opóźnienia mieszania 100, 200, 300, 400, 500, a 600 ms w temperaturze 40 °C nie było w stanie wykryć żadnej interkonwersji między konformerami obserwowanymi dla regionu uchwytu dla WT NmClpP. Oznacza to, że proces wymiany jest zbyt wolny do charakteryzowania przez NMR.

SAXS wykazuje indukowane aktywatorem zmiany konformacyjne ClpP w roztworze

w celu dalszego badania stanu oligomerycznego i zmian strukturalnych po wiązaniu związku, próbki apo-nmclpp i nmclpp+ADEP-04 charakteryzowały się SAXS (Fig. 6b-g i dodatkowe rys. 8). Końcowe połączone krzywe przedstawiono na Fig. 6b, a uzyskane profile SAXÓW przypominały profile pustych struktur43. Nie stwierdzono istotnych zmian w ogólnym składaniu (dodatkowe rys. 8), promień żyracji (Rg) i stan oligomeryczny, gdy adep-04 dodano do NmClpP (dodatkowe rys. 8c). W celu dalszej analizy profili NMCLPP SAXS i generowania struktur rozwiązania ab initio, program GNOM został użyty do skonstruowania funkcji rozkładu odległości par, p (r). Apo-NmClpP p (R) ujawnił subtelne przesunięcie w prawo i większy maksymalny wymiar (Dmax) w porównaniu do nmclpp związanego z ADEP-04 (Fig. 6C i dodatkowe rys. 8c). Następnie przy użyciu danych SAXS wygenerowano modele atomu (Dam) do wizualnej analizy struktur nmclpp (rys. 6d-g). Dla APO-nmclpp i adep-04-bound NmClpP stworzono dziesięć modeli, przy czym wybrano najbardziej prawdopodobne. Modele te wykazały, że ogólnie dwie struktury roztworu NmClpP są podobne (puste cylindry). Jednak po nałożeniu na odpowiednie struktury krystaliczne różnice, które zgadzają się ze strukturami o wysokiej rozdzielczości, były łatwe do zaobserwowania (rys. 6d, e). Miara wysokości osiowych wszystkich dziesięciu zapór dla NmClpP związanych z apo i ADEP-04 dała wartości 93,0 ± 5,4 Å dla postaci APO i 103,5 ± 6,1 Å dla postaci związanej z ADEP-04. Aby dodatkowo potwierdzić tę obserwację, uśrednione mapy prawdopodobieństwa zapór i mapy najwyższego zajętości DAs (rys. 6F, g) poddano analizie. Wysokość osiowa wykazała wzrost o około 10 Å Dla nmclpp związanego z ADEP-04 w porównaniu z apo-nmclpp. Ponadto nmclpp związany z ADEP-04 wykazywał większy osiowy Obwód porów niż apo-nmclpp (rys. 6f, g). Tak więc, pomimo niskiej rozdzielczości techniki SAXS, wyniki sugerują, że Wiązanie ADEP-04 z NMCLPP nie wpływa na stan oligomeryczny NMCLPP, ale powoduje rozszerzenie porów osiowych i zwiększenie zajętości w górnej i dolnej części zapory NMCLPP+ADEP-04 (Fig . 6e, g) w porównaniu z apo-nmclpp. Prawdopodobnie odzwierciedla to zmiany konformacyjne prowadzące do zmniejszonej heterogeniczności struktury N-końcowych pętli osiowych NmClpP obserwowanych przez promieniowanie rentgenowskie i NMR.