Tło: przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) ma klasyczny immunofenotyp, składający się z ograniczenia łańcucha lekkiego, CD5+, CD19+, dim CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10 – i CD79b-. To odróżnia go od normalnych komórek B i innych zaburzeń limfoproliferacyjnych (LPDs). Przeciwciała skierowane przeciwko tym antygenom są zawarte w dwóch 8-kolorowych panelach cytometrii przepływowej opracowanych przez konsorcjum Euroflow do prac nad LPD z komórek B. Połączenie tych przeciwciał w jeden 10-kolorowy panel byłoby bardziej opłacalne. Ponadto, nowe terapie PBL mogą wywoływać Głębokie remisje, tworząc rosnące zapotrzebowanie na pomiar minimalnej choroby resztkowej (MRD), zdefiniowanej jako posiadanie ponad 1 pozostałej komórki białaczkowej na 10 000 leukocytów (10-4). Obecne międzynarodowe znormalizowane podejście do pomiaru MRD ustanowione przez europejską inicjatywę badawczą w zakresie PBL (ERIC) wykorzystuje panel przeciwciał ukierunkowanych na CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b i CD81. Jednakże te kombinacje przeciwciało-fluorochrom różnią się od stosowanych przez panele diagnostyczne Euroflow. Dlatego laboratoria rozważające wdrożenie testów MRD musiałyby zakupić przeciwciała dla 3 różnych paneli (2 diagnostyczne i 1 MRD). Rozszerzyliśmy 8-kolorową rurkę do przesiewania limfocytów Euroflow (LST) o CD200 i CD23, dzięki czemu CLL można wykryć w jednej 10-kolorowej rurce, na poziomie nawet 0,01%. Celem tego badania było określenie potencjalnych oszczędności kosztów wdrożenia nowego panelu oraz określenie, czy jest on wystarczająco wrażliwy do wykrycia MRD.
metody: w okresie od kwietnia 2018 r.do marca 2019 r. obliczyliśmy liczbę próbek analizowanych za pomocą zmodyfikowanej 10-kolorowej probówki lst (mLST1, uzyskanej liofilizowanej), aby wykluczyć LPD i liczbę zapisanych aliquotów przeciwciał przy użyciu tego podejścia w porównaniu ze standardową 2-rurkową metodą Euroflow. Stworzyliśmy również wersję wyżej wymienionego panelu (mLST2) wykorzystującą ciekłe przeciwciała, aby zwiększyć uogólnialność naszych wyników, zastępując CD38 CD43, aby sprawdzić, czy to ulepszone wykrywanie MRD (patrz panele poniżej). Do badań MRD wykorzystaliśmy próbki PBL od 24 różnych pacjentów do wytworzenia 60 próbek MRD w różnych stężeniach komórek białaczkowych. Próbki przygotowano przez dodanie komórek PBL do zawiesin normalnych leukocytów w stężeniach 0,1%, 0,01% i 0,001%. Każda próbka została przyporządkowana i zabarwiona trzema panelami: ERIC, mLST1 i mLST2. Dane pozyskano przy użyciu BD FACSCanto II lub BD FACSAria Fusion i analizowano przy użyciu oprogramowania BD FACSDiva. Komórki PBL zidentyfikowano na podstawie różnicowej ekspresji kluczowych markerów i obliczono MRD jako liczbę komórek PBL/całkowitą liczbę leukocytów. Dodatni wynik MRD określono jako ≥ 0,01%. Porozumienie między panelami oceniano przy użyciu metody wykresu Bland-Altmana. Obliczyliśmy również procentową zgodność między panelami w identyfikacji pozytywności MRD.
wyniki: w ciągu 1 roku mLST1 przeprowadzono na 474 próbkach, z których 220 miało LPD, a 123 (56%) miało klasyczny fenotyp CLL, co eliminowało potrzebę dalszych badań. Dzięki temu uzyskano oszczędności netto w wysokości 476 podliczników przeciwciał. Dla oceny MRD, ekspresja różnicowa CD5 i CD20 była najbardziej znaczącym czynnikiem w odróżnianiu PBL od normalnych komórek B przy użyciu mLST1 i mLST2. Zidentyfikowaliśmy jeden przypadek PBL z atypowym immunofenotypem (dim CD5, bright CD20), który okazał się trudny do przejścia za pomocą panelu mLST. Osiągnięto porozumienie co do wyników MRD uzyskanych z panelami mLST i panelem ERIC. Dla wartości powyżej granicy oznaczalności, 95% granica porozumienia wynosiła ±0,3369 log dla porównania ERIC vs mLST1 i ±0,3485 log dla porównania ERIC vs mLST2. Tak więc zmienność poziomów MRD między panelami była mniejsza niż 2-krotnie w większości przypadków, co uznaliśmy za klinicznie dopuszczalne, ponieważ MRD jest mierzony w skali wykładniczej. Panel ERIC i mLST1 zgodziły się na 88,3% w rozróżnieniu próbek MRD-dodatnich od MRD-ujemnych. Umowa między panelem ERIC a mLST2 wyniosła 93,3%.
wnioski: zastosowanie zmodyfikowanego 10-kolorowego panelu LST zarówno do diagnostyki, jak i pomiaru MRD CLL jest możliwe. Zaletami są zwiększona znajomość przeciwciał i potencjalne oszczędności, dzięki czemu MRD jest dostępny dla większej liczby laboratoriów cytometrycznych. Nietypowe obudowy CLL bez zwykłej pozytywności CD5 i dim CD20 są bardzo trudne do zdobycia za pomocą panelu LST. W tych przypadkach panel ERIC jest wyraźnie lepszy, ponieważ CD22, CD79b, CD81 i CD43 mogą nadal zapewniać separację między złośliwymi i normalnymi limfocytami.
Bazinet:BD Biosciences: Inne: . Wever: Teva Canada Innovation: Zatrudnienie. Gimmig: BD Biosciences: zatrudnienie. Johnson: Lundbeck: zatrudnienie, Honoraria, członkostwo w Radzie Dyrektorów lub komitetach doradczych podmiotu, inne: opłaty za Podróże, prezenty i inne, finansowanie badań; Merck: Doradztwo, Honoraria; Roche: Doradztwo, zatrudnienie, Honoraria, członkostwo w Radzie Dyrektorów lub komitetach doradczych podmiotu, inne: opłaty za Podróże, prezenty i inne, finansowanie badań; Abbvie: Doradztwo, zatrudnienie, Honoraria, członkostwo w Radzie Dyrektorów podmiotu lub komitetach doradczych, finansowanie badań; BD Biosciences: Inne: Pod warunkiem, że znaczna część przeciwciał stosowanych w tym projekcie bezpłatnie.; BMS: Consultancy, Honoraria; Seattle Genetics: Honoraria.