y-kromosom microdeletion i en far og hans fire infertile sønner

Abstract

Microdeletions Av Yq er forbundet med azoospermi og alvorlig oligozoospermi. Generelt er menn med slettinger infertile og slettinger overføres derfor ikke til sønner med mindre in vitro fertilisering (IVF) og intracytoplasmatisk spermieinjeksjon (ICSI) utføres. Vi rapporterer en uvanlig familie preget av flere medlemmer med infertilitet og yq mikrodeletion. Fullstendig reproduksjonshistorie, sædanalyser og blodprøver ble fremkalt fra relevante familiemedlemmer. DNA forberedelse og kvantifisering ble utført ved hjelp av kommersielle kits. Totalt 27 par sekvens merket nettsteder basert primer sett spesifikke For y mikrodeletion regionen loci ble brukt for screening. Southern blots bruker slettet i azoospermi (DAZ) og ribosomal binding motiv (RBM) cDNAs ble deretter analysert for bekreftelse. Proband, hans tre brødre og far ble alle funnet å bli slettet FOR DAZ, men ikke RBM. På tidspunktet for analysen, proband far var azoospermic mens hans fire sønner var enten alvorlig oligozoospermic eller azoospermic. I motsetning til sin far, de fire sønner er infertile og har ingen avkom, bortsett fra en av dem som oppnådde en datter bare etter IVF / ICSI behandling for infertilitet. Mikrodeletjoner Av Yq som involverer DAZ-genet er forbundet med et variabelt fenotypisk uttrykk som kan inkludere tydeligvis normal fruktbarhet.

Innledning

Infertilitet forekommer hos ~14% av par (Mosher, 1985)og abnormiteter hos den mannlige partneren anslås å være tilstede i opptil halvparten av tilfellene (Swerdloff et al., 1985). Forsøk på å evaluere årsakene til azoospermi har vist at etter utelukkelse av tradisjonelt gjenkjennelige årsaker (dvs.unormal karyotype, obstruksjon, varicocoele, hormonell defekt, etc.), de fleste tilfeller (50-75%) er uforklarlige og kalles idiopatisk (Pryor et al., 1997). Nylig har det blitt rapportert at opptil 30% av menn med ‘idiopatisk’ azoospermi har mikrodeletjoner Av Y-kromosomet (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Marit et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Nøyaktig hvordan og hvorvidt disse mikrodeletjonene forårsaker azoo / oligozoospermi, er gjenstand for både intens undersøkelse og debatt.

Viktig for argumentet Om at y mikrodeletjoner forårsaker infertilitet er observasjonen at fruktbare menn sjelden manifesterer y mikrodeletjoner. Microdeletions i fire av 200 friske menn studert har blitt rapportert (Pryor et al., 1997). Slettingene i disse mennene var imidlertid svært små og representerte sannsynligvis ubetydelig polymorfisme. Relativt store slettinger av den typen assosiert med mannlig infertilitet er ikke rapportert hos menn med normal fertilitet. Selv om det er generelt antatt at disse slettingene oppstår de novo og at far til sønn overføring Av y mikrodeletion ikke ville forventes, noen sjeldne tilfeller av far til en sønn overføring Av Y-kromosom mikrodeletion er rapportert (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Imidlertid er vertikal overføring av en mikrodeletion som involverer slettet i azoospermi (DAZ) locus fra far til en sønn rapportert i bare tre tilfeller (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Vi beskriver nå en fire-generasjons familie der en azoospermic far og hans fire infertile sønner alle deler en tilsynelatende identisk microdeletion som inkluderer DAZ locus. Denne familien representerer den første og eneste rapporten om spontan vertikal overføring AV DAZ-sletting til flere avkom. Det gir bevis for at en Enkelt yq mikrodeletion kan resultere i varierende fenotypisk uttrykk i ulike individer. Det er klinisk signifikant fordi tilstedeværelsen av en mikrodeletion ikke er en absolutt markør for infertilitet og kan være forbundet med tilsynelatende normal fertilitet.

Materialer og metoder

Screening for yq mikrodeletion ble utført rutinemessig for mannlig infertilitet ved hjelp av en protokoll gjennomgått Og godkjent Av Institutional Review Board Of College Of Physicians & Surgeons, Columbia University. Prøver ble tatt fra pasienter etter informert samtykke.

Sædanalyse

Resultatene ble analysert ved HJELP AV WHO-kriterier med Et Nikon phase contrast-mikroskop.

Serumhormonkonsentrasjoner

Follikkelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH) og testosteron ble målt ved fastfase, to kjemiluminescerende enzymimmunometrisk analyse (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Normale områder for menn ER FSH <10 mIU / ml; LH < 10 mIU/ml; og testosteron 270-1070 ng / dl.

Genomisk DNA

Ekstraksjon av genomisk DNA fra fullblod ble utført ved lysis av røde blodlegemer, etterfulgt av lysis av hvite blodlegemer og deres kjerner. Cellulære proteiner ble fjernet ved saltutfelling, og genomisk DNA ble utfelt med isopropanol ved Bruk Av Puregene DNA extraction kit (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; katalog nr. D-5004).

Polymerasekjedereaksjon (PCR)

Primere ble produsert som tørkede oligonukleotider på en automatisert DNA-synthesizer (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Bergen, NORWAY). Totalt 27 Y-kromosom spesifikk sekvens merkede områder (STS) (Figur 1) ble valgt fra EN STS kart (Vollrath et al., 1992). De inkluderer de tre foreslåtte spermatogenese loci AZFa, AZFb og AZFc (Som Per Vogt et al., 1996) spenner Over yq intervaller 5, 6 og 7. SOM en rask screeningsprotokoll ble ET PCR-multiplekssystem bestående av to til seks forskjellige primerpar brukt i totalt seks multipleksede reaksjoner (Tabell I). MED HVER PCR-løp ble en kvinnelig kontroll og en normal mannlig kontroll inkludert. ALLE PCR-reaksjoner ble kjørt i polykarbonatplater (Techne®) i en Mj Research® PCR-forholdene var i hovedsak som tidligere beskrevet (Henegariu et al., 1993). I en 14 µl totalvolumreaksjon ble 50 ng genomisk DNA brukt som mal, 1 µ av primerstandardoppløsning (blanding i ELLER II eller III eller IV eller V eller VI bestående av 10 pmol per primer), 12 µ AV `PCR kaldblanding’ (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l av hver dNTP, 5% DMSO, 1× taq polymerasereaksjonsbuffer uten Mg2+), 1,25 IE TAQ DNA-polymerase (Promega) og 1 dråpe olje. De komplette blandingene ble plassert direkte i en termocycler forvarmet til 94°C. Sykkelforhold for 27 sykluser var: 94 hryvnias C, 30 s( smeltende); 55 hryvnias C, 45 s (gløding); og 72 hryvnias C, 60 s (forlengelse). Den endelige forlengelsestiden var 5 min. PCR-reaksjonsproduktene ble deretter separert på 3% agarose geler (Bio-Rad, ultra-ren klasse) ved elektroforese I TBE buffer. PCR-produkter ble farget med etidiumbromid og visualisert ved eksponering for ultrafiolett lys. STS som ikke viste noen forsterkning i multipleksreaksjoner ble bekreftet AV enkeltreaksjon PCR med passende positive og negative kontroller. EN STS ble ansett å være fraværende etter tre forsterkningsfeil.

Southern hybridisering

Southern blotting ble utført i henhold til etablert protokoll (Sambrook et al., 1989). Kort fortalt ble 5 µ genomisk DNA fordøyd med HindIII eller TaqI, kjørt på en 0,7% agarosegel i standard tbe-buffer, overført til en nylonmembran og hybridisert med 32p-merkede prober. DAZ-sonden var den rensede innsatsen av et plasmid (pDP1577) som inneholdt full lengde cDNA (Reijo et al., 1995). PÅ samme måte var rbm-sonden plasmid-innsatsen til EN rbm cDNA-klon (MK5) (Ma et al., 1993).

farskapsbestemmelse

Farskap av alle fire sønner ble bekreftet ved å vise forventet segregering av fire svært polymorfe autosomale markører (Weber Og May, 1989). Disse var D21S156, D21S270, D13S132 og D13S159 med heterozygositeter på henholdsvis 0,83, 0,86, 0,84 og 0,90.

Fluorescerende in-situ hybridisering (FISK)

FISK FOR DAZ ble utført Med Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996), ved hjelp av etablerte metoder (Yu et al., 1996).

Resultater

probanden (individ III 8 I Figur 2) og hans ektefelle (III-9) presentert For Reproductive-Endocrinology-Infertilitetsklinikken Ved Columbia-Presbyterian Medical Center med klage på primær infertilitet i 3 år. Testing viste normal karyotype og normale serumhormonnivåer mens sædanalyser viste alvorlig oligozoospermi (Tabell II). Mikrodeleksjonsscreening ved STS-BASERT PCR viste tilstedeværelsen av en mikrodeleksjon I subinterval 6D-6F Av Y-kromosomets lange arm (Figur 1). Under diskusjonen rapporterte probanden at hans to eldre brødre (III-4 OG III-6) var kjent for å være azoospermiske og ufruktbare. Senere opparbeidelse avslørte alle tre brødrene hadde en tilsynelatende identisk mikrodeletion. Testikkelbiopsi utført på EN AV DEM (III-6) demonstrerte’ Sertoli cell only ‘ syndrom.

funn av mikrodeletion i tre infertile brødre antydet at deres far var sannsynlig å bære samme sletting. En detaljert studie ble gjennomført på resten av familien som alle bodde i en liten by i Den Dominikanske Republikk. En fullstendig reproduktiv historie ble fremkalt fra de voksne familiemedlemmene. Familierelasjonene avbildet i stamtavlen (Figur 2) ble bekreftet ved å vise forventet segregering av flere autosomale polymorfe markører (data ikke vist) for de relevante familiemedlemmene (I-1, i-2, II-1, II-8 OG II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Det var ingen bevis for ikke-faderskap. Grundige cytogenetiske studier på relevante familiemedlemmer (i-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 og IV-1) viste normale karyotyper. Semen analyse ble utført i syv av de 16 hanner og blodprøver ble hentet fra de fleste av familiemedlemmene.

Tabell II oppsummerer resultatene av sædanalyse og endokrin utredning av relevante familiemedlemmer. Proband (III-8), hans far (II-1) og to av hans tre brødre (III-4, III-6) ble funnet å være enten azoospermic eller alvorlig oligozoospermic. Probands eldste bror (III-1) avviste sædanalyse. I tillegg ble probands onkel (II-8) funnet å ha azoospermi og forhøyet FSH med lavt testosteron. Som vist i Figur 1, proband, hans far og tre brødre ble alle funnet å ha microdeletion Av Yq VED STS PCR analyse. Southern blotting med DAZ (Figur 3) og RBM (data ikke vist) sonder bekreftet at slettingen inkluderte DAZ locus, men ikke RNA bindende motiv (RBM) locus. FISK analyse MED DAZ Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996) av probands fars (II-1) leukocytter viste ensartet fravær AV DAZ locus(Figur 4).

det at individ II-8 i stamtavlen var azoospermisk, men ikke hadde en mikrodeletion, var en overraskelse. DAZ locus i denne personen ble ytterligere testet Ved Southern analyse ved Hjelp AV DAZ cDNA og et annet restriksjonsenzym (TaqI). Det viste ikke noe unormalt I DAZ locus. I TILLEGG viste FISK med DAZ Cosmid 63C9 normal intensitet (data ikke vist).

probanden (III-8) og hans eldre bror (III-6) søkte infertilitetsbehandling. Etter omfattende rådgivning valgte de in vitro befruktning (IVF) og intracytoplasmatisk spermieinjeksjon (ICSI). Proband (III-8) og hans kone (III-9) gjennomgikk to IVF-ICSI sykluser som ikke klarte å produsere en graviditet sekundær til dårlig eggstokkrespons. Probands bror (III-6) og hans kone (III-7) gjennomgikk en syklus med kontrollert ovarial hyperstimulering og ni oocytter ble hentet. Elleve modne spermatozoer ble funnet i tre ejakulater på dagen for henting og brukt TIL ICSI. Tre oocytter befruktet som deretter spaltes og ble overført. Hun fødte en sunn kvinnelig baby (IV-2).

Diskusjon

vi rapporterer en eksepsjonell familie der en azoospermisk far og hans fire infertile sønner deler en tilsynelatende identisk yq mikrodeletion som involverer DAZ locus. De-novo-mutasjonen som førte til mikrodeletion AV DAZ ser ut til å ha sin opprinnelse i probandens far (II-1). Denne slettingen forventes å forårsake azoo / oligozoospermi og mannlig infertilitet, og likevel unnfanget han spontant fem barn og var uvitende om noe fruktbarhetsproblem. Interessant, men alle fire sønner er infertile og er enten azoospermic eller alvorlig oligozoospermic.

denne familien reiser flere problemer med hensyn til sammenhengen Mellom yq mikrodeletion og infertilitet. For det første bekrefter det at vertikal overføring Av yq-mikrodeletion er mulig og kan føre til etterfølgende infertilitet hos mannlige avkom. For det andre er det åpenbart at samme sletting kan resultere i forskjellige fenotyper hos forskjellige individer. Selv om faren (II-1) av de fire guttene i denne familien var azoospermisk på analysetidspunktet, far han sitt første barn i en alder av 25 og hans siste i en alder av 38 år. Dermed hadde han en viss grad av fruktbarhet over et stort spekter av år. På samme måte betyr mikrodeletion Av Y-kromosomet, spesielt DAZ, ikke nødvendigvis en livslang historie med azoospermi, og det utelukker heller ikke dannelsen av en stor familie. Hans fire sønner, på den andre siden, er infertile og enten azoospermic eller alvorlig oligozoospermic.

DAZ-genet har blitt foreslått som azoospermi-faktor På Y-kromosomet. Denne familien viser tydelig at MENS DAZ kan ha en kritisk rolle i spermatogenese, er det ikke avgjørende for fruktbarhet. Videre kan totalt tap AV daz-genklyngen være forbundet med et histologisk bilde av ‘Sertoli-celle bare’, så vel som spermmodningsstans (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Flere forfattere har funnet en dårlig sammenheng Mellom plasseringen Av y-mikrodelesjoner (inkludert DAZ-slettinger) med pasientens kliniske og histologiske fenotype (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). Funnene i denne familien er enige om at en slik sammenheng kan vise seg å være ganske problematisk. Testikkelbiopsi av probandbroren (III-6) viste et bilde av ‘Sertoli-celle bare’, mens probanden (III-8 med sædtall 0,5×106 / ml) klart forventes å ha en viss grad av spermemodning på biopsi. Videre kan testikkelbiopsi ikke være representativ for hele testikkelen fordi det kan være geografisk heterogenitet for spermatogenese som i individuelle III-6 hvis ejakulater inneholdt modne spermatozoer.

vi kan bare spekulere om grunnlaget for fenotypiske forskjeller mellom familiemedlemmer med samme sletting. Det er velkjent at identiske slettinger i autosomer kan resultere i forskjellige fenotyper (Schinzel, 1994). Man kan postulere at slike forskjeller er konsekvenser av hver enkelt persons eksponering for sitt miljø eller uttrykk for ulike modifiserende gener. En fruktbar far har blitt beskrevet med en mikrodeletion som utvidet seg når den ble overført til sin infertile sønn (Stuppia et al., 1996). Selv om variable utvidelser ved grensene for slettingen kan eksistere mellom våre forskjellige familiemedlemmer, kan disse molekylære utvidelsene ikke skilles ved intervallkartlegging. VED PCR-analyse klarte ikke samme STSs å forsterke i våre fem individer og Sørlig hybridisering med DAZ-sonden bekreftet en fullstendig sletting av denne genklyngen. Selv om det er mulig at de observerte slettingene faktisk ikke er identiske, og tilstøtende områder kan inneholde viktige gener som modulerer graden av fenotypisk uttrykk, indikerer disse resultatene fortsatt en stor overlapping av slettet Y-DNA (inkludert tap av DAZ – genklyngen) i hvert individ av denne unike familien.

vi var fascinert av det faktum at probands onkel (II-8) har infertilitet og azoospermi, men ingen tilsynelatende mikrodeleksjon ved STS-testing. Siden southern blot analyse ved hjelp AV BÅDE RBM og DAZ sonder samt FISK analyser ved hjelp AV EN DAZ cosmid var helt normalt, vi er tvunget til å konkludere med at han har en annen etiologi underliggende hans infertilitet. Riktignok er det mulig at han kan ha en mindre eller punkt mutasjon / forstyrrelse eller proksimal / distal omorganisering som ikke kan påvises ved dagens metoder. Han ga ingen historie med eksponering for gonadotoksiner eller andre definerbare faktorer som sannsynligvis ville påvirke spermatogenesen.

Inntil nylig har y mikrodeletion hatt liten klinisk betydning, siden en mann med sletting ikke generelt vil reprodusere. MEN ved BRUK AV ICSI og testikkel sperm aspirasjon (TESA), kombinert med IVF, er det nå mulig for oligo / azoospermic menn Med y mikrodeletion å oppnå graviditeter (Mulhall et al., 1997; Silber et al. 1998 OG individ III-6). Dette har fostret bekymringer for at slike graviditeter kan produsere mannlige avkom med lignende mikrodeletjoner og påfølgende infertilitet (Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). Faktisk Kan yq mikrodeletion overføres til mannlige avkom via ICSI (Kent-First et al., 1996). Familien vi rapporterer antyder at menn med Yq-mikrodeleksjoner (som individuelle II-1) som oppnår svangerskap, vil overføre samme mikrodeleksjon og risiko for infertilitet til sine sønner (individer III-1, III-4, III-6, III-8). Pasienter bør derfor tilbys y-mikrodelesjonsscreening før ICSI, og de bør få råd om sikkerhet ved overføring Av yq-mikrodelesjon og muligens infertilitet til sine sønner. Ettersom mer forskning er fokusert på genetiske etiologier for mannlig infertilitet, bør identifisering av gener involvert i spermatogenese gi innsikt i patofysiologien til mannlig infertilitet og et mer rasjonelt grunnlag for å starte behandlingen.

vi takker familiene for samarbeidet i studien; Dr David C. Side for å gi DAZ cDNA-sonden og hans uvurderlige hjelp med dette manuskriptet; Dr Kun Ma for å gi mk5 (RBM1) cDNA-sonden; Dr Peter Vogt for DNA Av Yq microdeleted individer som brukes til å validere VÅR STS PCR metodikk; Og C. C. Yu og Patricia Lanzano for deres uvurderlig teknisk assistanse.

denne studien ble delvis finansiert av Columbia Presbyterian Medical Center Office Of Clinical Trials House Staff Awards.