Planter og patogenet
den felles is anlegget (Mesembryanthemum crystallinum L.) ble dyrket i et drivhus som beskrevet av ku hryvniak et al. . Etter utseendet til 3rd bladparet ble ett sett med planter vannet med 0.4 M NaCl for å indusere Crassulacean Syre Metabolisme (CAM planter) mens en annen ble ytterligere vannet med vann fra springen (C3 planter). Etter 12 dager ble induksjonen av KAM i de nacl – behandlede plantene bekreftet ved å måle den daglige ∆ malat i bladcellesapet. Deretter blader av 2. blad par C3 OG CAM planter ble inokulert Med Botrytis cinerea henhold Til Kuź Et al. .
Klorofyll a fluorescens imaging
Mini-versjonen av En Imaging-Pam Klorofyll Fluorometer M-Serien (Walz, Effeltrich, Tyskland) utstyrt med et blad holder ble benyttet for å registrere fluorescens imaging (Imaging-Pam M-serien Klorofyll Fluorometer) . Fluorometeret er en bladklipsmodell for feltapplikasjoner. Bladholderen sikrer at bladet holdes horisontalt til lyskilden for å unngå heterogen belysning over forskjellige områder av bladprøven. Prøvetakingsposisjonene ble valgt til å være like fordelt langs midrib, men de var litt forskjellige for et blad på grunn av sin størrelse og morfologi, og teknikken for å plassere blader i holderen. For å identifisere effekten av biotisk stress bare, og for å unngå innføring av gjenstander i klorofyllfluorescensmålingsprosedyre, ble det ikke brukt referansemerker som tillater bladbildereferanse på bladene. Klorofyllfluorescens fra vanlige isplanteblader ble oppnådd ved å definere interesseområde (AOI-verktøy) ved Hjelp Av Imaging Win 2.41 a-programvaren.
Med Imaging-PAM ble det nåværende fluorescensutbyttet (Ft) kontinuerlig overvåket. Planter var mørke tilpasset for 20 min. Ved påføring av en metningspuls ble fluorescensutbyttet på mørkt nivå (Ft = F0) og maksimal fluorescensutbyttet (Fm) bestemt. Det maksimale PSII – kvanteutbyttet, Fv / Fm og kvanteutbyttet av regulert og ikke-regulert energidisponering i PSII, Y(NPQ) og Y(NO) ble avbildet. Fv / Fm ble beregnet i henhold til ligningen: Fv / Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ) ble beregnet i henhold Til Kramer et al. ved formelen: 1-Y (II) ‒ 1/(NPQ + 1 + qL (Fm/F0 − 1)). Y (NO) ble beregnet i henhold Til Kramer et al. ved ligningen: Y (NO) = 1/. Prosessen med bildebehandling gir pseudo-farge (indeksert fargemodus) bilder av biologisk materiale med en oppløsning 640 × 480 piksler som svarer til synsfeltet for de fysiske dimensjonene 32 × 24 mm.
de infiserte blader Av C3 og CAM planter ble tatt for chl en fluorescensanalyse på tidspunktet for inokulering og 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 og 72 timer etter inokulering. Chl a fluorescens ble målt for vedlagte blader av 2. bladparet fra tre C3-og KAMPLANTER som kommer fra to uavhengige gjentakelser av plantedyrking. Hvert blad tatt for analyse ble separat screenet på alle tidspunkter (Fig. 1). Representativ serie på ni bilder (ett for hvert tidspunkt) AV Y (NO), Y(NPQ) og Fv/Fm For C3 og CAM ice planter har blitt behandlet for å måle endringer av disse parametrene i et valgt område av bladbladet screenet over tid. TIL sammenligning, Y(NO), Y(NPQ) og Fv/Fm gjennomsnitt data fra hele blad regioner avbildet I Fig. 2 ble oppnådd. Resultatene av bildejustering og måling av spatiotemporal pattering av biotisk stressutbredelse i blader med foreslått metode ble eksemplifisert PÅ Y (NO) bilder.
Eksempel bilder av kvanteutbytte av ikke-regulert energidisponering i vanlige isplanteblader. Gjelder for psii Y(NO) av c3 (a–d) og CAM (e–h) fluorescens parametere. Bladfragmentet inneholder stedet for patogen-inokulering og symptomer på stressutbredelse
Eksempel bilde Av C3 felles is plante blad med utvalgte regioner av interesse. Manuelt gjort valg i firmware editor dekke infiserte (1), symptomless (2) samt midrib områder (3)
Bildejustering
mekanismen FOR pam-bildedatainnsamling i tidssekvens resulterer i flytting av bladfragmentet i synsfeltet mellom individuelle tidspunkter (Fig. 1). På grunn av endringen av bladposisjon har slike egenskaper som midrib og inokulasjonsstedene både forskjellig plassering og orientering. Videre kan effekten av rescaling observeres. For å riktig vurdere stressutbredelse, bør visningsfeltene synkroniseres gjensidig, forutsatt at en av dem er et referanse (fast) bilde og resten av bildene skal justeres med den faste. Denne tilnærmingen er kjent i medisinsk bildebehandling som bilderegistrering . Den grunnleggende registreringsoppgaven for fluorescensbildene er å finne likhetstransformasjonen som består av passende rotasjon, oversettelse og skalering. Bladoverflatebøyning og folding av blader fra stress forekommer bare i lokale regioner av enkeltbilder og er av mindre betydning for den globale bildejusteringen. De kan kompenseres på registreringsstadiet etterbehandling ved ikke-lineære transformasjoner som f. eks.
fluorescensbildene tas som en serie bilder i forhåndsdefinerte tidsintervaller med omtrent samme bladområde. De karakteristiske elementene i vurdert stabel av bilder representerer hovedsakelig blad årer. Men de er dårlig skilles fra bildeinnholdet på grunn av begrenset kontrast samt farge mote AV PAM imaging. Områdene av stress symptomer visuelt dominerer innholdet kan endres mellom bilder i en enkelt serie. I en slik situasjon vil automatisk registrering mislykkes.
de mest populære, automatiske toppmoderne metodene er basert på sammenligning av bildeintensitet med noen korrelasjonsmålinger (intensitetsbaserte metoder) eller stole på å søke i de faste og bevegelige bildene for korrespondansen mellom utvalgte bildefunksjoner som punkter, linjer og konturer (funksjonsbaserte metoder) . Ingen av disse tilnærmingene gir mulighet for riktig registrering AV pam fluorescens bilder av felles is-anlegg, hva som er verifisert og vist i eksemplene som inngår i supplerende materialer (Tilleggsfil 1). Resultatene som presenteres der, bekrefter at årsaken til mislykkede automatiske registreringer er den sterke obskurasjonen av bildeområder med bevarte funksjoner ved dynamiske endringer i bildeinnholdet forårsaket av infeksjon av bladvevet. Tester av de populære metodene ble utført både Av Registreringsestimatoren I Matlab og I Fiji-miljøet .
algoritmen TIL pam-bilderegistrering ble designet I Matlab-miljø basert på settet med kontrollpunkter valgt manuelt av en ekspert. For å angi de tilsvarende kontrollpunktene i hvert bilde ble funksjonen cvelg Av Kontrollpunktvalgsverktøyet Fra Bildebehandlingsverktøykassen brukt. Bildene ble redigert i par, inkludert et fast bilde og ett bevegelige bilde. Det første bildet som ble oppnådd like etter patogen-inokulering ble antatt som et fast (referanse) bilde. Gjennom interaktiv punktkartlegging kan brukeren peke ikke bare de synlige omrissene av nerver, men også andre karakteristiske elementer som injeksjonspunktet, steder langs patogenutbredelsen, samt de mest åpenbare epidermale blærecellene(Fig. 3).
Kontrollpunkter valgt av eksperten. Eksempel Y(NO) bilder AV et bladfragment av EN CAM common ice plant: et fast (referanse) bilde, b bevegelige bilde som skal justeres med den faste
Flere par kontrollpunktsteder, fordelt så vidt som mulig over bladets bildeflate, er tilstrekkelig til å justere bildene av det samme bladet som grovt betraktes som en stiv kropp. Bredere distribusjon av kontrollpunkter forbedrer følsomheten til bildematching, men er begrenset av bildevisningsfeltet som er beskåret etter justeringsomformingen og muligheten for presis plassering av det valgte punktet på bladbladet. Med en slik bildejustering affine transformasjonen ble utført ved hjelp av funksjonen fitgeotrans inkludert I Image Processing Toolbox. Denne transformasjonen har vært begrenset til ‘likhet’ – versjonen (som bare består av oversettelse, rotasjon og likhet) fordi scenen i pam-fluorometeret dukket opp som ikke vippet. Bevegelige bilder ble matchet til det faste bildet ved hjelp av funksjonen imwarp. Grafisk illustrasjon av registreringsalgoritmen er inkludert I Fig. 4.
blokkdiagrammet for affine og valgfri b-spline-registrering ble brukt på fluorescens pam-bilder. \(\venstre\) – vektoren av kontrollpunkter i det faste bildet, \(\venstre^{\venstre( k \høyre)}\)—vektoren av kontrollpunkter i k-th bevegelige bilde, \(\venstre^{{\venstre( {k^{\prime } } \høyre)}}\)—vektoren av kontrollpunkter i k-th bevegelige bilde etter b-spline registrering
Blader på ulike stadier av infeksjon kan ha en overflate lokalt bølget eller rynket som i regionen merket i analyserte pam-fluorometer bilder (Fig. 5a, b), hvilken form kan potensielt påvirke riktig analyse av patogenutbredelsesfenomenet. Det betyr at affine registreringsmetoden basert på geometrisk transformasjon kanskje ikke er tilstrekkelig til å matche fluorescens PAM bilder i noen tilfeller av blader med tilsynelatende synlig ikke-lineær deformasjon. Forfatterne foreslår derfor en totrinns registreringsmetode der affine rigid registrering etterfølges Av b-spline registrering redusere ikke-lineære deformasjoner.
eksempel på affine og B-spline registreringer For C3 felles is plante blad bilde. A Y (NO) bildet etter PAM anskaffe, b bildet etter rigid affine transformasjon med pilene representerer interaktivt satt forskyvning vektorer som brukes i den andre fasen av registreringen og c endelig form etter kontrollpunktbasert b-spline registrering
utvalget av ikke-rigid registreringstype utnytter det faktum at vanlige isplanteblader representerer et lite fleksibelt materiale og små bøyekrefter holder jevne endringer i en bladoverflateprofil. Specificiteten av denne registreringsmodifikasjonen er at vektorer av bildedeformasjonsfelt må pålegges interaktivt. Til dette formål ble en dedikert vektorfeltredaktør knyttet til algoritmen. Bare få forskyvningsvektorer i det bevegelige bildet må spesifiseres for å registrere lokale og glatte deformasjoner av en bladoverflate som I Fig. 5b.
B-spline Rueckert-algoritmen ble valgt for den andre fasen av registreringen. Implementeringen er tilgjengelig I Matlab Central File Exchange som Dirk-Jan Kroon Spline Registration Toolbox .
registreringsprosedyren b-spline består av to grunnleggende trinn:
-
Initialisering Av et rutenett G av bildepunkter jevnt fordelt over bildeflaten med alle deformasjonsfeltvektorer satt til null, og deretter beregne et tett vektorfelt T av deformasjoner I rutenettet G ved kubisk b-spline interpolering av manuelt sett kontrollpunktforskyvningsvektorer \(\venstre^{\venstre(k \ høyre)}\). Både rutenettet Og det tilhørende transformasjonsfeltet T blir deretter iterativt raffinert i 4 trinn for å redusere grid node avstand. Transformasjonen T er utarbeidet av funksjonen point_registration Fra Spline Registration Toolbox.
-
b-spline transformering av alle pikselposisjoner og bi-kubiske interpolasjoner av fargekomponenter i det bevegelige (affine-registrerte) bildet \(I_{M}\) i henhold til spline glattet deformasjonsfelt.
Bilderegistreringsnøyaktighet
nøyaktigheten av den foreslåtte bildejusteringen ble utført av rotmiddelkvadratet (rms) på avvik Fra N = 15 kontrollpunkter vist I Fig. 3. Forskyvningen av hvert fast bildekontrollpunkt \(P_{i}\) evaluert i et bevegelig bilde for saken med og uten justeringen ble illustrert I Fig. 6 som vektorene \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\) og \(Q_{i} p_{i} =\Delta q_{i}\) henholdsvis. Rms forskyvning feil av alle kontrollpunkter i et enkelt bilde for de to tilfellene er uttrykt I Eq. (1) som \(\Delta r_ {\text{rms}}\) og \(\Delta q_ {\text{rms}}\).
Illustrasjon av feilvurdering i affine registrering AV PAM bilder. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—kontrollpunkt i det faste bildet \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—kartlegging av kontrollpunktet \(P_{i}\) i det bevegelige bildet \(I_{M}\), \(R_{i}\)—kartlegging av kontrollpunktet \(P_{\text{I}}\) etter registrering, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—forskyvningsfeil av kontrollpunktet \(p_{\text{i}}\) etter registrering
prosentandelen av restforskyvning \(\delta_{rms}\) etter affine type registrering, kan evalueres per ett bilde i Henhold Til Eq. (2).
de evaluerte affine-registreringsfeilene er oppført I Tabell 1. De opprinnelige forskyvningene\(\Delta q_ {\text{rms}}\) som varierer fra 3,01 til 7,09 mm reduseres etter likhetsregistreringen til området fra 0,45 til 1,71 mm \(\Delta r_{\text{rms}}\) for Den testede c3-anlegget. De samme parametrene for CAM-anlegget er \(1,90 \ div 5,69\; {\text{mm}}\) for \(\Delta q_ {\text{rms}}\) og \ (0,41 \ div 1,53\; {\text{mm}}\) for \(\Delta r_ {\text{rms}}\). Når \(\delta_{rms}\) er i gjennomsnitt både For c3-og CAM-bildeserier, tilsvarer den henholdsvis 21% og 23%. Verdiene av fluorescensparametrene Y (NO), Fv/Fm og NPQ hentet fra is-plantebladbilder uten registrering hentes fra inkompatible deler av bladet og kan ikke tas i betraktning (se Tilleggsfil 2).
for ytterligere b-spline registrering tilordning transform feilen er definert av to komponenter. Den første av dem er postregistreringsforskyvningen \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\) vist i Fig. 7a, med \(R_{i}\) evaluert I Eq. (3) som centroid \(\bar{p}\) av regionen \(a_{i}\).
hvor \(I_{R} \venstre (p \høyre) \i \venstre\) angir intensiteten til registrert kontrollpunktbilde ved piksel p, \(\venstre / {a_{i} } \ høyre/\) – uskarphetsområdet. Feilen andre komponenten er definert av standardavvik radius \(\rho_{i}\) av intensitet spredt rundt hvert kontrollpunkt \(R_{i}\) som beskrevet I Eq. (4).
hvor \(\left \| \cdot\ right\|\) betegner Den Euklidiske normen for vektoren mellom punktene p og \(\bar{p}\) i bildeplanet. Uskarphet av det justerte kontrollpunktet \(R_{i}\) vises på grunn av at den ikke-lineære registreringen bruker bikubisk interpolering I det endelige oppløsningsnettet G. denne effekten ble målt eksperimentelt ved å utføre en gitt b-spline-transformasjon i bildet bygget fra hvite kontrollpunkter på en svart bakgrunn. Tabell 2 inneholder størrelsene \(\Delta q_{i}\) Av N = 9 eksempelforskyvningsfeltvektorer vist I Fig. 5b. Størrelsene \(\Delta r_{i}\) av vektorkartleggingsfeilene etter spline-registrering måles mellom de ønskede faste kontrollpunktene \(P_{i}\) og sentroidene av registrerte punkter\ (R_{i}\) evaluert i regionen \(A_{i}\). Alle testede\ (\Delta r_{i}\) verdier er under pikseloppløsningen lik \(50\;\upmu {\text{m}}\) og kan bli forsømt-avrundet til 0. Dette betyr presis posisjonering av kontrollpunkter ved spline-transformasjonen. Standardavviket \(\rho_{i}\) av uskarphet region vist i Tabell 2 etter dobling kan være et mål på kontrollpunkt uskarphet. Da varierer det omtrent fra \(24\; {\text{to}}\; 63\;\upmu {\text{m}}\) hva tilsvarer en piksel uskarphet. Dermed kan denne transformasjonen lokalt gjenopprette riktig form AV Y (NO) endringer i et fluorescensbilde.
Forklaring av feilen I B-spline bilderegistrering AV PAM-bilder. a mismatch av kontrollpunkt plassering kartlegging under registrering, b bildeintensitet distribusjon av spline registrert kontrollpunkt, \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—kontrollpunkt i det faste bildet \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—ekvivalenten av kontrollpunkt \(P_{i}\) i det bevegelige bildet \(I_{M}\), \(R_{i}\)—kartlegging av kontrollpunktet \(P_{i}\) etter registrering, \(R_{i} p_{i} =\Delta R_{i}\)—forskyvningsfeil mål for kartlegging av kontrollpunktet \(p_{i}\), \(a_{i}\)—uskarpt område Rundt \(R_{I}\) Som Svarer til kontrollpunktet \(p_{i}\), \(\rho_{i}\)—Standardavviksradiusen Til \(R_{I}\) uskarphet
måling av stressutbredelse
dataanalysen bruker et spesielt redigeringsverktøy for å manipulere en stabel MED pam-bilder etter registrering. Hovedredigeringsfunksjonen tillater tegning av to datainnsamlingslinjeseksjoner \(L_{1} \;{\text{and}}\;L_{2}\) med samme lengde (Fig. 8), som kan observeres og tilgjengelig på et bilde fra bunken. I det vurderte eksperimentet starter den første linjen \(l_{1}\) på stedet for inokulering \(s_{1}\), hvor stressfaktoren påføres bladvevet ved tid t, og bør omtrent settes i retning av spenningsutvidelse. Den andre linjen \(l_{2}\) er plassert langs midrib hvor den observerte stresspåvirkning i tid alltid var begrenset og fluorescensparametere utviser minimale endringer. Linjene skal passe helt i sammenheng med bildet.
Måleområder I Y (NO) bilder av vanlige is anlegget blader etter datamaskinen justering. Målepunktene indikerer: (1) mesofyll på inokulasjonsstedet, (2) mesofyll uten skade, (3) midrib nær inokulasjonsstedet. Målelinjen (L1) er orientert i retning av stressutbredelse i mesofyll og linjen (L2) ligger langs midrib. Linjer startet på punktene (S1) og (S2), henholdsvis
Ekstra mulighet for punktvis måling er mulig der tre små forskjellige sirkulære områder av 10 piksler radius er plassert interaktivt i synsfeltet(Fig. 8). De bør tilhøre bladområdene med forskjellig fluorescensparameter pattering over tid. Alle registrerte pikselverdier er i gjennomsnitt innenfor disse områdene.