spaltet-Caspase-3-antistoffet Er en markør For Caspase-9-lignende DRONC-aktivitet I Drosophila

Merking av spaltet-Caspase-3-antistoffet vedvarer i dcp-1-drICE doble mutanter

for å evaluere spesifisiteten til spaltet-Caspase-3 antistoff, vi analyserte Øye Imaginal plater fra tredje instar larver. I villtype øye imaginal plater oppdager antistoffet noen døende celler spredt over hele platen (Figur 1a). Overraskende, i øye plater dobbelt mutant for null alleler dcp-1prev og drICEΔ1 (ref.14, 15), spaltet-Caspase-3 antistoff fortsatt etiketter celler (Figur 1b). Merking i dcp-1prev drice ④1 dobbeltmutanter forekommer i klynger (Figur 1b), tilsvarende det som tidligere er observert når celledød ble blokkert ved ekspresjon Av Caspase – 3-hemmer P35. 3 Disse observasjonene vil tyde På At spaltet-Caspase-3-antistoffet fortsatt oppdager en epitop i fravær av De Caspase-3-lignende proteinene DCP-1 og DRICE. Likevel, da apoptose på dette stadiet ikke forekommer i et definert mønster, var vi usikre på spesifisiteten til disse merkesignalene.

DERFOR brukte VI GMR-hid-transgener,en godt karakterisert apoptotisk modell, 5 for å undersøke spesifisiteten til spaltet-Caspase-3-antistoffet. GJENNOM GMR-drevet ekspresjon av det pro-apoptotiske genet hid spesifikt i den bakre halvdelen av det utviklende øyet, induserer GMR-hid-transgene apoptose i to distinkte bølger som vist ved spaltet-Caspase – 3 antistoff og TUNEL labeling28(Figur 1c, d). FOR å evaluere spesifisiteten til spaltet-Caspase-3-antistoffet, undersøkte VI GMR-hid – øyeskiver som var dobbeltmutante for dcp-1prev og drICEΔ1. I samsvar med forventningen opphever tap av dcp-1prev og driceδ 1 FULLSTENDIG TUNEL-positiv apoptose i GMR-hid-plater (Figur 1f). Overraskende nok viste dcp-1prev driceδ 1 dobbeltmutante GMR-hid-øyeskiver fortsatt sterk immunoreaktivitet med spaltet-Caspase – 3-antistoff (Figur 1e). Dermed oppdager spaltet-Caspase – 3-antistoffet IKKE ELLER ikke bare DRICE og / eller DCP-1. Vi merker imidlertid at merkingsutseendet til spaltet-Caspase – 3-antistoffet endres i fravær AV DCP-1 og DRICE(sammenlign Figur 1c og e). Merkesignalet er ikke lenger begrenset til to forskjellige bølger (Figur 1c), men fyller hele bakre rommet på øyeskiven og er begrenset til interommatidiale celler (Figur 1e). En lignende endring av merkingsmønster er rapportert FOR CM1 antistoffmerking ved ekspresjon av caspasehemmeren P35.3 denne endringen av merkemønsteret skyldes sannsynligvis at celler i dcp – 1prev driceδ 1 dobbeltmutante GMR-hid – øyeskiver ikke dør (Figur 1f) og dermed opprettholder epitopen oppdaget av spaltet-Caspase-3-antistoff. Det er imidlertid viktig å merke seg at denne analysen viser påvisning av epitop i fravær Av Caspase-3-lignende proteiner DCP-1 og DRICE av spaltet-Caspase – 3 antistoff.

Immunoreaktivitet av spaltet-Caspase – 3-antistoffet avhenger av apoptosomkomponentene DRONC og ARK

det er to muligheter for at spaltet-Caspase-3-antistoffetikettene dcp-1 drICE doble mutantceller, selv om de ikke er apoptotiske. For det første kan antistoffet ikke oppdage en apoptotisk epitop; eller for det andre kan antistoffet oppdage en apoptotisk epitop generert oppstrøms eller parallelt MED DCP-1 og DRICE. For å skille mellom disse mulighetene, undersøkte VI GMR-hid øye plater mutant for apoptosom komponenter DRONC OG ARK, som fungerer oppstrøms DRICE OG DCP-1. I dronc og ark mutant GMR-hid øyeskiver blokkeres BÅDE TUNEL og spaltet-Caspase-3 antistoffmerking (Figur 1 g, h; Figur 3a, b). Disse dataene bekrefter at spaltet-Caspase – 3-antistoffet faktisk oppdager en apoptotisk epitop i Drosophila. Videre, fordi det ikke klarer å oppdage apoptotisk epitop i dronc og ark mutanter, men ikke i dcp-1 drICE doble mutanter, er det mer nøyaktig å vurdere spaltet-Caspase – 3 antistoff som en markør FOR DRONC aktivitet, snarere enn effektor caspase aktivitet, i døende Drosophila celler.

tripeptid ETD er apoptotisk epitop oppdaget av spaltet-Caspase-3-antistoff

epitopen oppdaget av spaltet-Caspase-3-antistoffet avhenger AV DRONC-aktivitet. Det kan være mulig at antistoffet direkte gjenkjenner aktivert DRONC. Alternativt er det også mulig at cleaved-Caspase-3-antistoffet oppdager en epitop generert gjennom spaltning av et ukjent substrat av aktiv DRONC, uavhengig av DRICE og DCP-1.

for å skille mellom disse to mulighetene justerte vi rester fra katalytisk cystein (Cys163) til spaltningsstedet Ved Asp175 av humant Caspase-3 (Caspase-3 peptid) med de tilsvarende regionene I Drosophila caspases (Figur 2a; se også ref. 3). De Mest C-terminale rester Av Caspase – 3 peptidet, ETD, er konservert I DRICE og DCP-1 (Figur 2a). I likhet Med Caspase-3 er dette klyvingsstedet for aktivering av MINST DRICE, 29 og muligens DCP-1. Det er interessant å merke seg At n-terminalen, to tredjedeler Av Caspase – 3 peptidet, har høyest likhet MED DRONC; seks av ni rester er konservert (Figur 2a). Denne delen Av Caspase-3-peptidet er mindre godt bevart i DRICE, DCP-1 og de resterende Drosophila caspases. Selv om spalting mellom DE store og små underenhetene AV DRONC ikke er nødvendig for DETS aktivitet,30, 31 og kan ikke forekomme in vivo, vurderte vi muligheten for at antistoffer rettet mot Den N-terminale delen Av Caspase – 3 peptid direkte kan oppdage aktiv DRONC i døende celler.

vi brukte blokkerende peptider for å evaluere hvilke epitoper Av Caspase-3 peptidet som oppdages av spaltet-Caspase – 3-antistoffet i døende Drosophila-celler. Sekvensene av de blokkerende peptidene er vist I Figur 2b og understreket I Figur 2a. Blokkerende peptid A (TETD) er avledet FRA DRICE OG DCP-1 og blokkerende peptid B (CRGDEYDLG) tilsvarer regionen med høyest likhet I DRONC (Figur 2a,b). Peptid C er et kontrollpeptid som svarer til restene umiddelbart ved siden av peptid B i DRONC(Figur 2a, b). Peptid D er et annet kontrollpeptid, som er veldig lik peptid A og er avledet fra PRODOMENET TIL DRONC i posisjon 113. Hvis PRODOMENET TIL DRONC spaltes på dette stedet, vil DET eksponere ESD ved Sin C-endepunkt, som er svært lik C-endepunktet Til Caspase – 3-peptidet (ETD, peptid A) og kan dermed påvises av spaltet-Caspase-3-antistoffet.

de blokkerende peptidene ble blandet med spaltet-Caspase-3-antistoffet 60 min før inkubasjon med øyeskivene. Resultatene av blokkeringsforsøkene er oppsummert I Figur 2b, og for peptider a og B vist I Figur 2c-f. Peptid A er tilstrekkelig til å blokkere hele immunoreaktiviteten til spaltet-Caspase – 3-antistoffet I GMR-hid og i dcp-1-doble mutante GMR-hid-øyeskiver (Figur 2c, d). Peptid B opphever ikke immunoreaktivitet av antistoffet i disse skivene (Figur 2e, f). Kontrollpeptidene C og D klarer heller ikke å blokkere spaltet-Caspase – 3 immunoreaktivitet (Figur 2b; data ikke vist).

disse dataene viser at spaltet-Caspase – 3-antistoffet spesifikt detekterer epitopen ETD i apoptotiske celler. Blant Drosophila caspases er denne epitopen bare tilstede I DRICE OG DCP-1, noe som gjør det svært sannsynlig at antistoffet faktisk oppdager disse effektor caspases. I kontrast, det faktum at DE DRONC-avledede peptidene B, C og D ikke klarer å blokkere immunoreaktivitet tyder på at det er usannsynlig for antistoffet å direkte oppdage aktiv DRONC. Derfor, fordi spaltet-Caspase-3-antistoffet ikke mister immunoreaktivitet i dcp-1 drICE double mutants (Figur 1e), oppdager det minst ett annet protein, som eksponerer etd-epitopen PÅ EN DRONC-avhengig måte.

Aktivering av DCP-1 uavhengig AV ARK gjenoppretter spaltet-Caspase-3 immunoreaktivitet

analysen presentert I Figur 2 antyder, men beviser ikke, at spaltet-Caspase – 3-antistoffet faktisk påviser spaltet DCP-1 og DRICE. For å teste denne muligheten direkte, uttrykte VI EN GMR-Δ-dcp-1 transgene i ark mutant bakgrunn. Δ-dcp-1 mangler Det n-terminale prodomenet TIL DCP-1. Det antas at PRODOMAIN-utarmet Δ-DCP-1 lett fremmer autoprosessering, og konsekvent uttrykk under GMR-kontroll induserer en øyeablation fenotype.32 denne øyeablationfenotypen er forårsaket av induksjon av apoptose (Figur 3c,d). Som nevnt ovenfor, ark mutant kloner I GMR-hid bakgrunn unnlater å indusere TUNEL-positiv apoptose (Figur 3b) og spaltet-Caspase – 3 antistoff har ingen immunoreaktivitet i ark kloner (Figur 3a) som tyder på at VERKEN DCP-1 ELLER DRICE eller de ukjente DRONC substrater er spaltet i ark mutant kloner. Derfor testet vi om uttrykk FOR Δ-Dcp-1 i fravær av apoptosomaktivitet, det vil si i ark-kloner, kan gjenopprette spaltet-Caspase – 3 antistoffmerking. Sammenlignet med villtypevev (merket MED GFP I Figur 3c, c’), er antallet spaltede-Caspase-3-positive celler sterkt redusert i ark-mutantkloner (Figur 3c,c’), noe som tyder på at aktivering AV Δ-DCP-1 i det minste delvis er avhengig av apoptosomet. Imidlertid inneholder omtrent 50% av ark-mutantklonene (n=32) I GMR-Δ-Dcp-1-bakgrunnen spaltet-Caspase-3 immunoreaktive celler(piler I Figur 3c, c’). Dette er usannsynlig å være en merkingsartefakt, fordi disse cellene også ER TUNEL-positive (Figur 3d, d’). DERFOR, fordi DRONC er inaktiv i ark mutant bakgrunn som tyder på at spaltet-Caspase-3 merking signal ikke er forårsaket av det ukjente DRONC substrat, viser denne analysen at spaltet-Caspase – 3 antistoff gjør faktisk påvise spaltet DCP-1. Det er også mulig at spaltet-Caspase-3-antistoffet oppdager spaltet DRICE i dette eksperimentet, FORDI DCP-1 kan proteolytisk behandle DRICE, i det minste in vitro.29, 32 en lignende analyse MED DRICE kunne ikke utføres fordi GMR-drICE og GMR-Δ-DRICE ikke forårsaker øyeablation fenotype.32 LIKEVEL, OM DCP-1 klipper DRICE in vivo eller ikke, gitt sekvenslikheten AV DCP-1 og DRICE ved C-terminus av den store underenheten Og peptidblokkeringsdataene I Figur 2, antyder det at antistoffet også kan oppdage spaltet DRICE.